全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (3): 256~262256
收稿 2010-10-15　　修定 2011-01-27
资助 国家自然科学基金(30771759和30972388)、广东省自然科
学基金团队项目(9351064201000002)、广东省自然科学基
金重点项目(7118121)。
* 通讯作者(E-mail: xiaolanpeng@scau.edu.cn; Tel: 020-
85280259)。
苹果蔗糖载体蛋白MdSUT1多克隆抗体的制备及MdSUT1蛋白表达特异
性分析
彭昌操, 肖文芳, 李文燕, 赵小兰*
华南农业大学林学院, 广东省森林植物种质创新与利用重点实验室, 热带亚热带林业生物技术实验室, 广州510642
摘要: 高等植物光合同化产物蔗糖的质外体运输主要是靠蔗糖载体蛋白来完成的。MdSUT1是从苹果果实中克隆的蔗糖载
体家族基因, 本文将MdSUT1构建到酵母表达载体pMETαB中, 重组质粒转化毕赤酵母PMAD16经0.5%甲醇诱导后获得Md-
SUT1表达。纯化的MdSUT1异源表达蛋白免疫Balb/C小鼠制备多克隆抗体, 抗体特异性分析结果显示该抗体对酵母表达
和苹果中的MdSUT1识别具有较高的特异性。免疫共沉淀实验结果也证明抗体能够应用于苹果果实中MdSUT1的功能分
析。
关键词: 苹果; 蔗糖载体; 多克隆抗体; 蛋白质互作
Polyclonal Antibody Preparing and Specific Expression Analyzing of Sucrose
Transporter MdSUT1 in Apple
PENG Chang-Cao, XIAO Wen-Fang, LI Wen-Yan, ZHAO Xiao-Lan*
Bio-technology Laboratory of Tropical and Subtropical Forestry, Guangdong Key Laboratory for Innovative Development and
Utilization of Forest Plant Germplasm, College of Forestry, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China
Abstract: Apoplast transport of sucrose is mainly mediated by sucrose transporters in high plants. MdSUT1 is
a member of sucrose transporter (SUT) family isolated from apple fruit. In this study, the cDNA of MdSUT1
was subcloned into pMETαB and the recombinant plasmid was used to transform the Pichia methanolica
PMAD16. The fusion proteins induced by 0.5% methanol were used for standard immunization protocols in
Balb/C mouse to prepare MdSUT1 polyclonal antibody. The affinity-purified antisera were evaluated by immu-
noblotting and shown to recognize MdSUT1 in vivo and in vitro specifically. Co-immunoprecipitation assay
also confirmed that the prepared antisera were specific and reliable enough to be used to analyze the function of
MdSUT1 in apple fruit.
Key words: apple (Malus domestica cv. Starkrimson); sucrose transporter; polyclonal antibody; protein-protein
interaction
大多数高等植物光合作用的产物主要是蔗糖
(Rolland等 2006)。在植物体内, 蔗糖的运输依赖
于作为蔗糖分子载体的蔗糖载体蛋白(sucrose tran-
sporters, SUTs), 又称蔗糖-H+共转运蛋白(sucrose
co-transporters, SUCs)。这是一类典型的膜结合蛋
白分子, 广泛存在于高等植物的组织和细胞中, 能
够利用细胞内外H+浓度梯度, 对蔗糖分子进行跨
膜转运。根据氨基酸序列结构与特性分析, 蔗糖
转运蛋白属于MFS (major facilitator superfamily)超
家族中的一员, 它们的序列高度保守, 是高疏水性
蛋白, 含有12个跨膜结构域, 中央面向细胞质的部
分有一个大的胞质环, 将蛋白分为各含6个跨膜结
构域的2个半区, 即前半区和后半区(彭昌操和赵小
兰2010; 杨彩菊等2006)。
作为肉质果的苹果果实是贮存光合同化物蔗
糖的主要库器官(Lalonde等1999; Patrick 1997;
Oparka 1990), 而在果实发育过程中韧皮部光合同
化物的卸载以质外体路径为主(Zhang等2004), 因
此包括蔗糖载体在内的糖载体形成了一套有效的
机制来提升库器官的糖吸收或者糖贮存的水平。
一些蔗糖或单糖载体基因已经从葡萄(Vignault等
彭昌操等: 苹果蔗糖载体蛋白MdSUT1多克隆抗体的制备与MdSUT1蛋白表达特异性分析 257
2005; Manning等2001; Ageorges等2000; Davies等
1999; Fillion等1999)、酸樱桃(Gao等2003)和番茄
(Hackel等2006; Gear等2000; Barker等2000; Weise
等2000)的果实中克隆并鉴定。苹果山梨醇载体基
因也陆续从叶片(Watari等2004)和果实(Gao等
2005)中被克隆, 但是有关苹果蔗糖载体的功能人
们知之甚少。我们先前从苹果果实中克隆并鉴定
了一个对蔗糖具有高亲和力(Km=0.63 mmol·L
-1)的
蔗糖载体MdSUT1 (Fan等2009), 它在韧皮部蔗糖
的跨膜转运中起着关键性的作用, 然而这种蔗糖
载体在细胞中的定位机制以及调节功能并不清楚,
这就需要来自不同动物免疫的特异性抗体作精确
分析。同时, 我们也证明了MdSUT1与苹果果实细
胞色素b5蛋白(MdCyb5)存在体内互作, 这同样需
要多种抗体的体外实验加以综合印证。
由于蔗糖载体含有众多的跨膜结构域, 不易
在原核表达系统中纯化到基因全长表达的融合蛋
白, 现有的研究中大多采取原核表达其可溶性的
中央胞质环片段来制备多克隆抗体(Fan等2009)。
然而蔗糖载体的中央胞质环片段一般来说只有几
十个氨基酸的长度, 这可能会影响到抗体的免疫
原性。因此, 本研究构建了苹果蔗糖载体MdSUT1
的酵母表达体系, 表达并纯化了MdSUT1融合蛋
白, 且制备多克隆抗体, 对多克隆抗体的特异性进
行了检测, 以期为苹果蔗糖载体的定位、功能以
及蛋白质互作研究打下基础。
材料与方法
1 材料
以北京西郊农场十年生苹果品种新红星(Malus
domestica Borkh. cv. Starkrimson)为植物试材。酵
母菌PMAD16 (Pichia methanolica) (ade2-11pep4Δ
prb1Δ)购自Invitrogen公司。Cyb5抗体、V5抗体、
AP (碱性磷酸酶)标记的各种二抗为SANTA公司产
品。免疫用Balb/C小鼠由中国科学院遗传与发育
生物学研究所提供。
2 方法
2.1 载体构建、重组质粒转化及诱导
根据已克隆的MdSUT1序列(GenBank登录号:
AY445915)设计引物: PPMET5, 5-cgctggatccCAT-
GCCAGCTCCAGACACAGACC-3 (划线部分为
BamHI酶切位点); PPMET3, 5-gactactagtGTGACA-
GCTCTGGGCTTAGGTGC-3 (划线部分为SpeI酶
切位点)。将PCR产物构建到表达载体pMETαB
(目的基因的3端为融合表达的V5肽标签序列),
pMETαB转化大肠杆菌DH5α菌株, 将酶切鉴定正
确的单克隆送交上海生工生物工程公司测序。
重组质粒pMETαB-MdSUT1经化学方法(LiCl
法)转化酵母感受态细胞PMAD16, 转化子在MD
(Ade-)基本培养基上筛选。甲醇诱导表达按照In-
vitrogen公司Pichia methanolica Expression Kit使用
说明书进行。
2.2 融合蛋白纯化及小鼠免疫
采用ProBand 6-His亲和层析法纯化融合蛋白,
具体参照Invitrogen公司Pichia methanolica Expres-
sion Kit使用说明书。考马斯亮蓝G-250测定洗脱
液浓度后进行SDS-PAGE和Western Blot分析。用
上述纯化的融合蛋白免疫Balb/C小鼠, 每次每只小
鼠注射50~100 µg纯化的融合蛋白。首免时将纯化
的融合蛋白与Freund完全佐剂按1:1混合乳化, 背
部多点皮内注射, 注射卡介苗50 µL; 二免与三免时
将纯化的融合蛋白与Freund完全佐剂按1:1混合乳
化, 背部多点皮内注射; 取耳部血液进行效价测
定。三免后10 d尾部小量采血, 用酶联免疫吸附测
定(ELISA)方法测定血清效价, 若血清效价合格,
于四免后10 d眼部采血, 取全血, 每次免疫间隔期
为10 d, 免疫血清在4 ℃下静置过夜, 5 000×g离心
10 min, 取上清液待用。上述免疫小鼠过程于中国
科学院遗传与发育生物学研究所进行。
2.3 微粒体的制备
苹果果肉微粒体的制备参照Zhang等(2001)的
方法, 略有改动。称取苹果果肉50 g, 加入150 mL
的研磨液[100 mmol·L-1 Tris-HCl (pH 7.5)、250
mmol·L-1蔗糖、10 mmol·L-1 MgCl2、5 mmol·L
-1乙
二胺四乙酸(EDTA)、10%甘油、0.2%巯基乙醇、
1 mmol·L-1苯甲基磺酰氟(PMSF)、5 mmol·L-1维生
素C、3 . 5 %交联聚乙烯吡咯烷酮 ( P V P P )、2
µg·mL-1亮抑酶肽(leupeptin)、抑肽酶(aprotinin)、
抑肽素(pepstatin A)]浸泡, 待果肉变软后, 放入组
织破碎器中破碎成匀浆。4层纱布过滤, 滤液进行
10 000×g离心20 min, 弃去沉淀, 上清液100 000×g
离心1 h, 所得沉淀即为微粒体组分, 上清液为可溶
植物生理学报258
性组分。沉淀用少量悬浮液[5 mmol·L-1 Tris-HCl
(pH 7.0)、1 mmol·L-1二硫苏糖醇(DTT)、5 mmol·L-1
维生素C、0.5 mmol·L-1 PMSF]悬浮, 测定蛋白浓度
后分装, 液氮速冻后保存于-80 ℃备用。以上实验均
在4 ℃下进行。按照Bradford (1976)的方法测定蛋
白质含量, 以牛血清白蛋白(BSA)为标准蛋白质。
2.4 抗血清效价的测定
用ELISA法测定抗血清的效价。蛋白经SDS-
PAGE电泳后电转移至硝酸纤维素膜上(4 ℃, 100
mA转移9 h), 浸入10 mL封闭液(TBST) [TBS (10
mmol·L-1 pH 7.5的Tris-HCl和150 mmol·L-1 NaCl)+
0.05% (V/V) Tween 20+3% (W/V) BSA, pH 7.5]中,
在摇床上封闭2~3 h。按效价加入一抗(1:2 000)于
10 mL TBST中, 在摇床上轻摇2~3 h, 使抗原和抗
体发生免疫反应。用TBST1 [TBS+0.05% (V/V)
Tween-20]洗膜3次, 每次10 min。加入二抗(1:1 000,
用TBST1进行稀释), 室温轻摇2 h。TBST2 [50
mmol·L-1 Tris-HCl (pH 7.5)、150 mmol·L-1 NaCl、
0.1% Tween-20]洗膜3次, 每次10 min。TBS洗膜
2次, 每次10 min。加入5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐/
氯化硝基四氮唑蓝(BCIP/NBT)底物反应液, 混匀
后于黑暗中显色2~5 min至蛋白谱带出现, 取出硝
酸纤维素膜, 置于重蒸水中终止反应, 并清洗2~3
次。苹果不同器官的Western Blot方法与以上方法
相同。
2.5 体外免疫共沉淀实验
参照Li等(2002)的方法, 略加修改。重悬苹果果
实微粒体蛋白于膜溶解缓冲液中, 4 ℃下100 000×g
离心30 min, 上清加入30 µL Protein A Agrose和20
µL抗体(一抗), 4 ℃缓慢摇动过夜(8~10 h)。分别
用Buffer A、Buffer B洗涤沉淀2次, 12 000×g离心
10 min, 弃上清, 沉淀用1×SDS Sample Buffer溶解
并用相应的抗体作Western Blot分析。膜溶解缓冲
液组分为: 10 mmol·L-1 Tris-Cl (pH 7.3)、150
mmol·L-1 NaCl、1 mmol·L-1 EDTA、1%甘油、
0.1% Triton X-100、1 mmol·L-1 PMSF、1 µg·mL-1
亮抑酶肽、10 µg·mL-1抑肽酶、10 µg·mL-1抑凝乳
蛋白酶素(chymostatin)。Buffer A组分为 : 50
mmol·L-1 Tris-Cl (pH 8.0)、150 mmol·L-1 NaCl、
0.1% Triton X-100; Buffer B组分为: 50 mmol·L-1
Tris-Cl (pH 8.0)、0.1% Triton X-100。
实验结果
1 MdSUT1在毕赤酵母细胞中的表达
1 497 bp的苹果蔗糖载体基因(MdSUT1)的开
放阅读框(ORF)经RT-PCR扩增后, 克隆到pMETαB
酵母表达载体, 重组质粒命名为pMETαB-MdSUT1。
重组质粒pMETαB-MdSUT1转化酵母菌PMAD16,
转化子在MD (Ade-)基本培养基上筛选, 4~6 d长出
白色单克隆(资料未列出)。随机挑选20个Ade+阳
性酵母转化子进行甲醇诱导的蛋白小量表达, 相
应的空载体(pMETαB)转化子作为对照, 从中筛选
出甲醇快速利用型(Mut+)转基因菌株, 用于后续的
大量表达和蛋白纯化。SDS-PAGE检测蛋白小量
表达的结果表明, 30 ℃培养条件下目标蛋白的表
达量随着甲醇诱导时间的延长而增加, 到第4天达
到最大(图1-A)。在酵母表达菌株的培养基上清液
中未检测到目的蛋白条带(资料未列出), 说明目的
蛋白只在胞内表达而没有分泌到胞外。因此后续
的蛋白大量表达的条件均设定为甲醇诱导4 d (30 ℃),
图1 甲醇诱导毕赤酵母表达MdSUT1蛋白的
凝胶电泳(A)及其免疫(B)分析
Fig.1 SDS-PAGE (A) and Western Blot (B) analysis of Md-
SUT1 expression induced by methanol in P. methanolica
M: 蛋白质分子量标准; 1: 空载体(pMETαB)转化子甲醇诱导
0 d表达的总蛋白; 2: 阳性转化子甲醇诱导3 d表达的总蛋白; 3: 阳
性转化子甲醇诱导2 d表达的总蛋白; 4: 空载体(pMETαB)转化子
甲醇诱导4 d表达的总蛋白; 5: 阳性转化子甲醇诱导4 d表达的总蛋
白; 6: 纯化的目的蛋白。蛋白表达受体菌株为酵母菌PMAD16, 其
基因型为ade2-11pep4Δprb1Δ , 表现型为Ade-Mut+。表达蛋白用In-
vitrogen公司ProBondTM纯化试剂盒纯化, 融合蛋白C端的6-His蛋白
与含Ni树脂结合。以融合蛋白尾部的抗V5肽抗体作Western Blot
分析, 每泳道上样总蛋白为20 µg。
彭昌操等: 苹果蔗糖载体蛋白MdSUT1多克隆抗体的制备与MdSUT1蛋白表达特异性分析 259
取诱导表达的酵母细胞进行目标蛋白的提取和纯
化。
2 融合蛋白的纯化
30 ℃培养条件下经过4 d的甲醇诱导, 转Md-
SUT1酵母细胞总蛋白裂解液经过ProBand 6-His亲
和层析法纯化到58 kDa的目标蛋白(图1-A)。利用
融合表达标签V5肽的抗体进行Western Blot分析结
果显示, 经过甲醇诱导3或4 d, 目标蛋白得到表达
(图1-B), 而且蛋白分子量与纯化的目标蛋白一
致。空载体对照无论是诱导前还是诱导后均未检
测到信号。这说明图1-A中的纯化蛋白确实是目
标蛋白MdSUT1。同时, 纯化的MdSUT1融合蛋白
不能被PAS试剂染色(资料未列出), 说明该融合蛋
白不是糖蛋白, 其免疫原性没有受到蛋白翻译过
程中糖基化的影响, 可以直接进行动物免疫制备
抗体。SDS-PAGE结果还显示, 得到的纯化蛋白纯
度较高, 达到95%以上。纯化蛋白的浓度测定结果
表明, 1 L菌体纯化得到的蛋白量约为200 μg。
3 MdSUT1多克隆抗体的特异性分析
经纯化的MdSUT1抗体(1:2 000)进行Western
Blot分析的结果显示, MdSUT1抗体检测到苹果果
实微粒体蛋白中大约为58 kDa的多肽, 其表观分子
量大小与酵母表达纯化的MdSUT1基本一致(图
2-A)。当抗体经过量的MdSUT1抗原(酵母表达后
纯化)封闭后, Western Blot检测不到先前出现的58
kDa蛋白(图2-B), 而BSA则不能封闭MdSUT1抗体
的识别反应(图2-C)。以上结果表明, MdSUT1抗体
识别苹果蔗糖载体MdSUT1是特异的。
4 MdSUT1在苹果各器官中的表达特异性
我们之前的拟南芥原生质体瞬时表达亚细胞
定位结果显示MdSUT1定位于细胞质膜上(Fan等
2009)。于是我们提取了苹果不同器官的微粒体蛋
白进行Western Blot分析, 检测结果表明, MdSUT1
的表达在翻译水平表现出器官的特异性。从图
3-A可以看到, MdSUT1在苹果果实发育的前期(花
后30 d)和中后期(花后80 d)表达量较高, 中期(花后
60 d)表达次之, 后期(花后110 d)较低。MdSUT1在
枝条皮层、雄蕊、花瓣和叶片中均有表达, 相对
而言, 叶片和枝条皮层中蛋白表达量较高, 暗示
MdSUT1在叶片和韧皮部的运输中具有蔗糖转运
功能; 然而在种子中未检测到MdSUT1的表达(图
3-B)。
5 MdSUT1与MdCyb5的体外互作
我们曾经用膜蛋白酵母双杂交系统筛选到
MdSUT1的互作蛋白MdCyb5 (Fan等2009)。为了
进一步验证本研究制备的多克隆抗体是否可用于
上述互作蛋白的体外实验分析, 我们开展了免疫
共沉淀实验。实验发现, MdSUT1抗体的沉淀组分
中能检测到MdCyb5 (图4-A); 反过来, MdCyb5抗
体的沉淀组分中也能检测到MdSUT1 (图4-B)。
图2 MdSUT1抗体特异性分析
Fig.2 Specificity assay of the anti-MdSUT1 serum
A: MdSUT1抗血清识别苹果果实微粒体蛋白中的MdSUT1
蛋白; B: MdSUT1抗血清经过量的MdSUT1蛋白封闭后消除了对
苹果果实微粒体蛋白中MdSUT1的识别反应; C: 对照, BSA预温
育MdSUT1抗血清不影响MdSUT1抗血清对苹果果实微粒体蛋白
中MdSUT1的识别反应。所有泳道中样品均为苹果果实微粒体蛋
白。
图3 MdSUT1在苹果器官中表达的特异性
Fig.3 Organ-specific expression pattern of MdSUT1 in apple
A: MdSUT1在果实发育不同时期的表达; B: MdSUT1在苹果
不同器官中的表达。微粒体蛋白分别提取自盛花期后30、60、
80、110 d的果实(A)以及不同器官(B)。蛋白经SDS-PAGE分离后转
入NC膜, 再用MdSUT1抗体作免疫印迹分析, 总蛋白上样量24 µg。
植物生理学报260
MdSUT1与MdCyb5的免疫共沉淀结果佐证了Md-
SUT1与MdCyb5体内蛋白互作的结果。这从另一
个方面说明本研究所制备的多克隆抗体对识别苹
果果实MdSUT1蛋白有较高的专一性。
讨　　论
据统计, 植物基因组中有20%~30%的基因编
码膜蛋白, 这显示了膜蛋白在植物体中的重要性
(Krogh等2001)。膜蛋白虽然具有重要的功能, 然
而天然蛋白的分离纯化极其困难, 难以满足其功
能研究的需要(Fleishman等2006)。所以, 体外重组
表达和纯化膜蛋白成为最重要的方法和手段。膜
蛋白在细胞内的表达是一个十分复杂的生化过程,
其中有两个环节至关重要, 其一是核糖体上翻译
的多肽只有正确折叠后才能进入高尔基体(Ell-
gaard等1999), 而那些未被正确折叠的蛋白质则被
细胞降解(Meusser等2005; Tsai等2002); 其二是膜
蛋白被定位于质膜之前必须经过蛋白质磷酸化等
翻译后修饰环节(Coughlan等2004)。因此, 体外重
组表达膜蛋白常常表现为表达量低或对宿主细胞
产生毒性而导致宿主细胞死亡。本研究中所表达
的MdSUT1是一个具有12个跨膜结构域的膜蛋白,
从理论上讲要获得正确的定位和大量表达是很困
难的。尽管我们试图优化酵母细胞的表达条件,
但所获得的表达量仍然很低, 每升培养基能纯化
到目的蛋白200~300 µg。实验中我们还碰到表达
不稳定的问题, 即某一批培养细胞能纯化到目的
蛋白, 而同样的条件下有时纯化到的目的蛋白很
少或几乎没有。这可能是酵母细胞翻译过程中的
后内质网质量控制体系(Coughlan等2004)使得未正
确折叠蛋白质降解的缘故。
目前, 使用酵母表达系统表达的重组跨膜蛋
白来免疫动物制备抗体是一种行之有效的方法。
本研究将MdSUT1构建到真核表达载体pMETαB
中, 经甲醇诱导酵母表达后纯化到表达的融合蛋
白, 并制备了效价(1:3 000)和特异性较高的多克隆
抗体。经检测抗体的特异性与我们先前报道的
MdSUT1中央胞质环片段MdSUT1CL (可溶性, 原核
表达)免疫兔获得的抗体相当(Fan等2009), 这说明
本研究所制备的抗体适宜于开展MdSUT1的免疫
定位和表达模式的研究。苹果蔗糖载体MdSUT1
的时空表达在翻译水平表现出器官的差异性。一
方面, 苹果果实发育的前期(花后30 d)和中后期(花
后80 d)表达量较高, 中期(花后60 d)表达次之, 后期
(花后110 d)则较低。这可能同果实的发育进程相
关, 果实发育的前期和中后期是体积和重量增加
的关键时期, 胞内需要大量蔗糖的积累, 果实接近
成熟的后期, 因细胞内糖分积累已达到相当水平,
糖的转运速率减缓。因为苹果果实同化物的卸出
主要是靠质外体途径(Zhang等2004), 这必然涉及
到负责包括蔗糖在内的糖分跨膜转运的糖载体。
在果实发育中后期有大量的蔗糖需要从胞外转运
到胞内贮存或转化(Zhang和Wang 2002), 而韧皮部
组织同周围薄壁组织间空间上又存在着共质体隔
离(Zhang等2004), 所以需要蔗糖载体的大量表达
来完成蔗糖的卸载和跨膜转运。在果实发育后期
胞外蔗糖浓度相对较低, 因而蔗糖载体的表达量
也相对较低。另一方面, MdSUT1在枝条皮层、雄
蕊、花瓣和叶片中均有表达, 而成熟的种子中未
见表达。枝条皮层中MdSUT1蛋白表达量高, 说明
MdSUT1在韧皮部的运输过程中亦行使功能。种
图4 免疫共沉淀检测苹果果实中MdSUT1与MdCyb5互作
Fig.4 Detection of interaction between MdSUT1 and Md-
Cyb5 by co-immunoprecipitating assays in apple fruit
A: MdSUT1抗体(抗鼠)免疫沉淀MdCyb5蛋白, Cyb5抗体用
作免疫印迹分析。1: 免疫前血清免疫沉淀苹果果实总蛋白; 2: 总
蛋白中MdCyb5免疫印迹; 3: MdSUT1抗体免疫沉淀苹果果实总蛋
白。B: Cyb5抗体(抗羊)免疫沉淀MdSUT1蛋白, MdSUT1抗体用作
免疫印迹分析。1: 免疫前血清免疫沉淀苹果果实微粒体蛋白; 2:
微粒体蛋白中MdSUT1免疫印迹; 3: Cyb5抗体免疫沉淀苹果果实
微粒体蛋白。
彭昌操等: 苹果蔗糖载体蛋白MdSUT1多克隆抗体的制备与MdSUT1蛋白表达特异性分析 261
子成熟后各种贮藏物质相对稳定, 不涉及到蔗糖
的转运, 故而MdSUT1不表达。事实上, 许多实验
证明蔗糖载体可同时在库/源的不同器官中表达,
如马铃薯中负责同化物装载的蔗糖转运蛋白
StSUT1在块茎的韧皮部卸载中也起着重要作用
(Kuhn 2003); 番茄、烟草、拟南芥、胡萝卜、水
稻和大豆等多种植物中鉴定出的SUT基因在源器
官如叶中大量表达, 同样在种子、根、花粉等库
器官中表达(Scholz-Starke等2003; Meyer等2000;
Shakya和Sturm 1998; Ylstra等1998; Harrington等
1997; Gahrtz等1996; Riesmeier等1993; Turgeon
1987); 在甜橙(Citrus sinensis)、葡萄(Vitis vinifera)
等果实上克隆的蔗糖载体基因同样在源器官叶片
中表达(Ageorges等2000; Davies等1999)。
免疫共沉淀技术普遍应用于蛋白质互作的体
外分析。我们已经利用MdSUT1CL抗体(抗兔)证实
了MdSUT1与MdCyb5的体外互作(Fan等2009), 本
研究再次用MdSUT1全长蛋白抗体(抗鼠)和Cyb5
抗体进行了免疫共沉淀实验, 结果与我们先前报
道的相似, 即苹果果实中MdSUT1与MdCyb5能发
生体外互作。这也从侧面证明本研究中的Md-
SUT1多克隆抗体对蔗糖载体的识别是特异的。
综上所述, 我们成功地从毕赤酵母细胞中表
达了MdSUT1蛋白, 并制备得到特异性良好的多克
隆抗体, 抗体可用于苹果蔗糖载体MdSUT1的表达
水平检测。前期研究中我们还发现MdSUT1的表
达受ABA的诱导, 将MdSUT1转入蔗糖吸收功能缺
失酵母突变体SUSY7/ura3细胞后, 外源ABA能显
著提高酵母细胞对14C标记蔗糖的吸收活性(未发
表资料)。我们将继续利用该抗体通过免疫组化的
方法来分析蔗糖载体对ABA的响应, 甚至进行蛋
白质互作因子的体外筛选。因此, 该抗体的制备
对进一步研究蔗糖载体的蔗糖转运功能以及调控
信号打下了基础。
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