全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (9): 1315~1321　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.1017 1315
收稿 2014-07-09　　修定 2014-08-18
资助 国家自然科学基金项目(3117021)和上海市科委重点基础
研究项目(13JC1400900)。
* 通讯作者 (E-mail: bkkuai@fudan.edu.cn; Tel: 021-65642648)。
绿色器官衰老进程中叶绿素降解代谢及其调控的研究进展
陈俊毅, 朱晓宇, 蒯本科*
复旦大学生命科学学院, 植物科学研究所, 遗传工程国家重点实验室, 上海200433
摘要: 褪绿(degreening)现象是绿色器官衰老的显著标志, 其中涉及的叶绿素急速降解是植物衰老的特征性生理生化过程。
近十余年来, 叶绿素降解的主要生化途径(PAO途径)已基本被阐明。游离的叶绿素及其代谢中间产物具有潜在的光毒性,
因此精准调控的叶绿素降解被认为是一个高效有序的解毒过程。目前关于叶绿素降解的全局性调控机制依然知之甚少;
多个物种中叶绿素降解关键调控因子SGRs/NYEs的鉴别及其相关作用机理的初步揭示是该领域近年来的最显要进展。上
述研究基础预示着近期在叶绿素降解调控的多个方向上可能会取得实质性乃至突破性进展。
关键词: 衰老; 叶绿素降解与调控; PAO途径; SGRs/NYEs
Recent Progresses in the Elucidation of Chlorophyll Catabolism and Its Regu-
lation during Green Organ Senescence
CHEN Jun-Yi, ZHU Xiao-Yu, KUAI Ben-Ke*
State Key Laboratory of Genetic Engineering, Institute of Plant Biology, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai
200433, China
Abstract: Degreening is the most obvious phenotypic change during green organ senescence, and the causal
process of rapid chlorophyll degradation is one of the characteristic senescence-associated processes. The major
biochemical pathway of senescence-associated chlorophyll degradation, i.e. PAO pathway, has been largely elu-
cidated over the past decade or so. Free chlorophyll and its catabolites possess a potential phototoxicity, and
therefore the delicately regulated degradation of chlorophyll during senescence is regarded as a detoxification
process. So far, the global regulatory mechanism of chlorophyll degradation remains largely unknown. Identifi-
cation and functional characterization of the key regulatory factor of chlorophyll degradation STAY-GREEN 1
(SGR1)/NON-YELLOWING 1 (NYE1) in diversified species marked a milestone progress of this area in recent
years. The areas where significant progresses and/or breakthroughs could be made in the near future are dis-
cussed.
Key words: senescence; chlorophyll degradation and regulation; PAO pathway; SGRs/NYEs
植物衰老(plant senescence)是指植物细胞、
组织、器官乃至整个植株的功能衰退, 最终导致
其死亡的生理过程(Lim等2007)。植物衰老不仅表
现在正常生长环境下, 因生命衰竭导致的自然衰
老; 也表现在逆境胁迫下, 部分细胞提前衰老, 并
将营养物质转移到新生组织或生殖器官中, 尽可
能地延续植株的生命或繁殖更多的后代(Guiboi-
leau等2010)。目前对植物衰老的研究主要集中在
器官层面上, 尤其是植物叶片的衰老上。植物叶
片衰老的显著标志是由叶绿素快速降解所导致的
褪绿(degreening)或黄化(yellowing)现象(Lim等
2007)。
叶绿素(chlorophyll)是植物体内含量最多的色
素, 行使光能捕获以保障光合作用的顺利进行。
叶绿素分子主要存在于叶绿体的类囊体膜中, 与
捕光色素蛋白形成“叶绿素-蛋白质”复合体(Stand-
fuss等2005)。在植物的绿色器官进入衰老阶段后,
叶绿素的降解是复合体中叶绿素结合蛋白降解的
前提; 叶绿素结合蛋白的同步降解可使得其中富
含的氮素及时地由衰老器官向新生器官或生殖器
官的转运, 完成营养物质的高效再动员(Hörten-
steiner 2009)。
游离的叶绿素及其降解代谢的中间产物对植
物细胞具有潜在的光毒性, 所以衰老进程中叶绿
植物生理学报1316
素的降解必须是一个受到精密调控和高效有序的
过程, 以保障衰老进程中的细胞免受光损伤, 进而
保障营养物质再动员的效率(Hörtensteiner和Kräut-
ler 2011; Hörtensteiner 2013)。因此, 阐明衰老进程
中叶绿素的降解代谢及其调控机理不仅有助于全
面理解植物的生长发育调控, 而且能够为作物品
种的遗传改良和农业生产过程中产量潜力的提高
提供理论依据和相关技术体系。本文主要对近年
来叶绿素降解代谢和调控机理方面的研究进展进
行了梳理和总结, 同时对未来的研究方向和可能
取得突破的重点领域进行了展望。
1 叶绿素的降解代谢
叶绿素分子主要由螯合一个镁离子的卟啉环
(porphyrin ring)和脂肪烃侧链的植基(phytol)两部
分组成。高等植物体内的叶绿素包括叶绿素a和叶
绿素b两种, 它们的化学结构高度相似, 只有吡咯
环II上的附加基团存在差异, 前者是甲基(-CH3), 而
后者是甲醛基(-CHO) (Tanaka和Tanaka 2006)。相
对于叶绿素的合成代谢研究, 叶绿素的降解代谢
研究显著滞后(Tanaka和Tanaka 2006)。近些年来,
随着多种非功能型滞绿突变体(non-functional stay-
green mutants)的鉴定和相关基因的克隆, 以及高效
液相色谱(HPLC)、质谱(MS)和核磁共振(NMR)等
技术的应用, 叶片衰老进程中叶绿素降解的主要
途径已经得到了系统的阐明(Hörtensteiner和Kräut-
ler 2011; Hörtensteiner 2013) (图1)。
1.1 叶绿素b转化为叶绿素a
对叶绿素降解最终代谢产物的分析发现, 除
了At-NCC-3外, 其他已知的FCCs (fluorescent chlo-
rophyll catabolites)和NCCs (nonfluorescent chloro-
phyll catabolites)都来源于叶绿素a (Hörtensteiner和
Kräutler 2011)。此外, 催化卟啉环氧化开环的脱镁
叶绿酸a单加氧酶(pheophorbide a oxygenase, PAO)
对脱镁叶绿酸a (pheophorbide a, Pheide a)具有底物
特异性, 而脱镁叶绿酸b能竞争抑制这种氧化开环
反应(Hörtensteiner等1995)。这些发现暗示了, 在
叶绿素的降解过程中叶绿素b应该是被转化为叶
绿素a后再被进一步降解的。近年来的研究表明,
衰老过程中的确存在这样一个两步反应的转换过
程, 叶绿素b首先在叶绿素b还原酶的作用下转化
为7-羟甲基叶绿素a (7-hydroxymethyl chlorophyll a,
图1 高等植物叶绿素降解的PAO途径
Fig.1 The PAO pathway of chlorophyll degradation
in higher plants
参考Hörtensteiner (2013)文献修改。
HMChl a), HMChl a再在7-羟甲基叶绿素a还原酶
(hydroxymethyl chlorophyll a reductase, HCAR)的
催化下转化为叶绿素a (Sato等2009; Horie等2009;
Meguro等2011; Sakuraba等2013)。
在水稻和拟南芥中 , 叶绿素b还原酶是由
NYC1 (NON-YELLOW COLORING1)和NOL (NYC1-
LIKE)两个同源基因编码。Sato等(2009)发现水稻
nyc1-2和nol-1突变体中叶绿素的降解受到抑制, 尤
其是叶绿素b显著滞留; 此外, NYC1和NOL在体外
能够互作, 暗示NYC1和NOL可能形成复合体行使
叶绿素b还原酶的功能。Horie等(2009)发现拟南芥
nol突变体没有显著的滞绿表型, nyc1单突变体和
nolnyc1双突变体的叶绿素降解受到抑制, 叶绿素b
显著滞留; 但是, 体外表达的NOL蛋白能够催化叶
绿素b到7-羟甲基叶绿素a的转化。这些结果表明,
陈俊毅等: 绿色器官衰老进程中叶绿素降解代谢及其调控的研究进展 1317
不同物种间叶绿素b到叶绿素a的转化存在一定程
度上的调控差异。HCAR基因也已经被克隆, Me-
guro等(2011)发现拟南芥hcar突变体中有7-羟甲基
叶绿素a的积累, 且体外表达的HCAR蛋白可以将
7-羟甲基叶绿素a转化为叶绿素a。
1.2 脱镁反应和脱植基反应
由于PAO催化卟啉环氧化开环的反应对脱镁
叶绿酸a具有底物特异性, 因此在叶绿素降解过程
中脱镁反应和脱植基反应发生在卟啉环氧化开环
反应之前(Hörtensteiner等1995)。关于脱镁反应和
脱植基反应的先后顺序, Takamiya等(2000)先前认
为, 叶绿素是在叶绿素酶(chlorophyllase, CLH)和
镁脱螯合酶(Mg de-chelatase)的作用下依次发生脱
植基反应和脱镁反应; 此后相当长一段时间内叶
绿素酶催化的脱植基反应被认为是叶绿素降解的
第一步反应。直至2007年, 两个实验室在拟南芥
上独立获得的数据明确否定了这一推论。Zhou等
(2007)利用RNAi技术抑制AtCLH1的表达不影响叶
片衰老进程中叶绿素的降解速率。Schenk等
(2007)发现拟南芥的AtCLH1和AtCLH2定位于液
泡中, 而非叶绿体中; 更重要的是, clh1-1、chl2-1
单突变体及clh1-1chl2-1双突变体中的叶绿素能够
正常降解。这些试验数据表明, 拟南芥的叶绿素
酶没有参与到衰老进程中叶绿素的降解代谢。
脱镁叶绿素水解酶(pheophytin pheophorbide
hydrolase, PPH)的鉴别是叶绿素降解代谢研究过
程中的一个突破性进展。PPH是一个定位于叶绿
体的α/β水解酶, 具有酯酶活性(Schelbert等2009)。
国际上三个课题组先后独立地分离鉴别出了PPH
基因。Schelbert等(2009)运用化学遗传学的手段从
拟南芥中筛选具有α/β水解酶特性的酶蛋白, 再通
过叶绿体定位及突变体表型验证 , 鉴别出了
AtPPH; Ren等(2010)通过对衰老相关基因的聚类
分析, 从与NYE1共表达的基因中鉴定出了AtCRN1
(Co-Regulated with NYE1), 即AtPPH; Morita等
(2009)也从水稻中克隆鉴定到AtPPH的同源基因
NYC3 (NON-YELLOW COLORING 3)。体外表达
的AtPPH蛋白只能以脱镁叶绿素a (pheophytin a,
Phein a)和脱镁叶绿素b为底物, 而不能作用于叶绿
素a和叶绿素b (Schelbert等2009); 与此同时, 利用
HPLC检测发现, 在拟南芥pph-1突变体及水稻nyc3
突变体衰老的叶片中有脱镁叶绿素a的积累(Schel-
bert等2009; Morita等2009)。上述研究表明, 在叶
绿素的降解代谢过程中脱镁反应发生在脱植基反
应之前。
关于脱镁反应, 目前有两种说法: 一是存在一
种低分子量且耐热的金属螯合物MCS (metal-che-
lating substance), 另一是存在一种热稳定性差的脱
镁蛋白MRP (Mg-releasing proteins) (Vicentini等
1995; Suzuki和Shioi 2002)。但是, MCS仅被证明
能催化叶绿素酸酯a (chlorophyllide a, Chlide a)的
脱镁反应 , 而MRP也只能以人工合成的叶绿酸
(chlorophyllin)为底物, 这些初步数据都不能说明
叶绿素a是如何脱去卟啉环中的镁离子(Vicentini等
1995; Suzuki和Shioi 2002)。此外, Lundquist等
(2012)在分析与PAO和PPH共表达的基因时, 鉴别
到了一个催化叶绿素脱镁反应的候选基因
At5g17450, 该基因编码的蛋白具有一个HMA金属
离子结合域 , 且定位于叶绿体的质体球滴结构
(plastoglobules)中。
1.3 卟啉环氧化开环反应
催化卟啉环氧化开环的脱镁叶绿酸a单加氧
酶PAO以脱镁叶绿酸a为底物, 通过催化氧原子的
加入, 使脱镁叶绿酸a的卟啉环在C4-C5键氧化开
环 , 生成红色叶绿素降解产物(red chlorophyll
catabolite, RCC) (Pružinská等2003)。RCC在红色
叶绿素降解产物还原酶(red chlorophyll catabolite
reductase, RCCR)的作用下催化C1/C20双键的还原,
转化为初级荧光叶绿素降解产物(primary fluores-
cent chlorophyll catabolites, pFCCs)或epi-pFCCs
(Pružinská等2007)。PAO催化的卟啉环氧化开环
是叶绿素生化降解的关键步骤, 该步骤使得叶绿
素降解产物最终丧失绿色, 叶绿素的这条降解途
径因而被称为PAO降解途径(Matile和Hörtenstein-
era 1999)。
Ginsburg等(1994)在分析叶绿素降解最终产
物的化学结构时发现, 存在一个依赖ferredoxin
(Fd)的氧化酶, 催化了卟啉环C4-C5键的氧化开环,
后来Hörtensteiner等(1995)又发现这个氧化酶是一
个单加氧酶, 作用的底物是脱镁叶绿酸a, 因此被命
名为PAO。有两个实验室相继在拟南芥中克隆得
到AtPAO, 并发现它是玉米LLS1 (Lethal Leaf Spot 1)
植物生理学报1318
的同源基因。Pružinská等(2003)利用化学遗传学
的方法鉴定得到AtPAO, 即ACD1 (Accelerated Cell
Death 1)基因; 随后, Yang等(2004)利用图位克隆的
方法也克隆得到AtPAO基因。对PAO蛋白的分析
发现, 它定位于叶绿体的类囊体膜上, 包含有一个
N端叶绿体转运肽序列、一个Rieske型结构域
(Rieske-type)和一个单核铁结合结构域(mononu-
clear iron-binding) (Pružinská等2003)。值得一提的
是, 不同物种中PAO的突变体或抑制表达株系均表
现为细胞加速死亡的表型, 这是因为PAO的底物脱
镁叶绿酸a具有潜在的光毒性。拟南芥中, PAO的
突变体acd1在自然衰老或胁迫处理时表现为光依
赖性的细胞加速死亡表型(Greenberg和Ausubel
1993); 玉米中, PAO的突变体lls1表现为致死的叶
斑点表型(Gray等1997)。
RCCR是一个30 kDa大小的可溶性蛋白, 定位
于叶绿体(Wuthrich等2000)。在拟南芥中RCCR也
被称为ACD2 (Accelerated Cell Death 2), 它的突变
体acd2与PAO的突变体类似, 表现为光依赖性的细
胞加速死亡, 这是由于RCCR的底物RCC的大量积
累引起的光损伤(Pružinská等2007)。有趣的是, 绿
藻(Chlorella protothecoides)基因组中没有RCCR,
它可以把RCC直接分泌到细胞外, 避免对自身的
毒害; 高等植物难以采用这样的排毒方式, 因此必
须将RCC进一步降解为低毒性或无毒性的产物。
RCCR的出现被认为是植物进化史上的一个关键
事件(Hörtensteiner等2000)。研究中还发现, 当植
物受到外界胁迫或原卟啉IX处理时, RCCR会被运
输到线粒体或细胞质基质中, 参与调控细胞的程
序性死亡(Yao和Greenberg 2006)。
1.4 最终降解产物的生成
pFCCs或epi-pFCCs在经过一系列修饰后, 会
被多种转运蛋白转运到液泡内, 在低pH的环境下
发生分子异构, 自发转变为相应的NCCs (Hörten-
steiner和Kräutler 2011)。利用HPLC分离叶绿素降
解代谢的产物, 鉴别出了多种FCCs和NCCs, 在拟
南芥中已被证明有五种不同种类的NCCs; 这些产
物的多样性表明植物体内存在多种酶促反应, 催
化修饰pFCCs或epi-pFCCs (Müller等2006)。最近,
Christ等(2013)利用HPLC及MS检测拟南芥衰老叶
片中叶绿素的降解产物时发现, 有近75%的降解产
物是NDCCs (nonfluorescent dioxobilin-type chloro-
phyll catabolites), 只有少部分是NCCs。进一步的
研究发现, 一种定位于内质网的细胞色素P450蛋
白CYP89A9能够催化FCCs发生脱甲酰基反应, 并
使其转化为相应的FDCCs (fluorescent dioxobi-
lin-type chlorophyll catabolites); FDCCs被转运到液
泡后, 在低PH的环境下自发转变为相应的NDCCs
(Christ等2013)。
2 叶绿素降解的调控
2.1 NYE1/SGR1调控衰老叶片和成熟种子/果实中
的叶绿素降解
SGR1 (STAY-GREEN 1)/NYE1 (NON-YEL-
LOWING 1)的鉴别是叶绿素降解调控研究中的一
个里程碑事件。Ren等(2007)通过图位克隆从拟南
芥中鉴别出了AtNYE1; 在拟南芥叶片的衰老进程
中, AtNYE1的表达显著上调, nye1-1突变体衰老叶
片中叶绿素的降解受到显著抑制, 叶绿素结合蛋
白也明显滞留。新近的研究发现, AtNYEs也调控
成熟种子中叶绿素的降解(Wu等未发表数据)。通
过图位克隆从水稻中也鉴别出了AtNYE1的同源基
因OsSGR; 分析发现, 水稻中OsSGR可以与LHCII
结合, 在sgr突变体中叶绿素及LHC蛋白的降解受
到严重阻滞(Park等2007; Jiang等2011)。此外, 在
豌豆、番茄、甜椒、柑橘和大豆等物种中, 也先
后发现SGR1/NYE1不仅调控衰老叶片中叶绿素的
降解, 也调控种子/果实成熟过程中叶绿素的降解
(Sato等2007; Alós等2008; Barry等2008)。
植物体内的叶绿素分子主要通过脂肪烃侧链
插入到叶绿体的类囊体膜中, 这是叶绿素分子能
够在植物体内稳定存在的原因 ( S t a n d f u s s等
2005)。在衰老进程中, 这种复合体的解离被认为
是叶绿素降解的前提(Hörtensteiner 2009)。新近的
研究表明, SGR1/NYE1蛋白不仅可以与LHC II互
作, 而且还可以与叶绿素降解关键酶(chlorophyll
catabolic enzymes, CCEs)互作。据此推测, SGR1/
NYE1在体内可能起到招募CCEs的作用, 并在LHC
II上形成一个复合体(SGR-CCEs-LHC II), 促使叶
绿素分子从LHC II上解离, 并构成一个有助于叶绿
素快速降解的“代谢通道” (Sakuraba等2012)。
2.2 ABI3调控种子成熟过程中的叶绿素降解
Nambara等(1994)在20多年前就报道了脱落
陈俊毅等: 绿色器官衰老进程中叶绿素降解代谢及其调控的研究进展 1319
酸(ABA)信号途径关键组分ABI3的基因突变能够
导致种子产生滞绿表型, 其中的调控机理一直没
有得到阐明。Delmas等(2013)新近的研究发现,
ABI3通过直接结合SGR1/NYE1和SGR2/NYE2的启
动子正调控它们的表达, 进而促进种子成熟过程
中叶绿素的降解。
3 叶绿素降解的生物学意义
叶绿素是地球上含量最丰富的色素分子, 每
年估计有100亿吨的叶绿素被降解掉(Hendry等
1987)。在发育成熟的细胞内它们结合在捕光色素
蛋白复合体上, 构成了类囊体结构的组成成份; 衰
老进程中, 叶绿素的降解是叶绿素结合蛋白降解
及类囊体结构解体的前提。叶绿素结合蛋白在植
物体内含量丰富, 是植物衰老进程中氮素营养动
员与再利用的重要来源之一。有研究表明, 光系
统反应中心的叶绿素结合蛋白占到细胞总蛋白量
的20%左右, 这部分氮源的高效再利用对植株的生
长发育及植物物种的生存繁衍具有举足轻重的作
用(Hörtensteiner 2006)。
游离的叶绿素及叶绿素降解代谢的中间产物
在高浓度氧或强光条件下能够产生自由基, 导致
膜脂氧化损伤和核酸碱基羟基化, 进而造成细胞
的程序性死亡(programmed cell death, PCD)。因
此, 叶绿素降解的不及时和不充分对植物细胞可
能产生潜在的光毒性, PAO的突变体(acd1)和RCCR
的突变体(acd2)的光损伤表型就是很好的例证
(Pružinská等2003, 2007)。换言之, 叶绿素的高效
有序降解, 是衰老细胞的一种解毒方式, 有助于维
持衰老进程中的细胞活性, 以保障营养物质的充
分动员与再利用。因此, 叶绿素及时与充分的降
解具有重要的发育生物学意义(Hörtensteiner和
Kräutler 2011; Hörtensteiner 2013)。
叶绿素的降解产物还具有抗氧化的作用。有
研究表明, NCCs具有较强的抗氧化作用, 可能在维
持衰老细胞的活性方面具有重要的作用(Müller等
2007)。此外, 有一些具有荧光的叶绿素降解产物,
如FCCs (尤其是hmFCCs), 可能是水果成熟的信号,
可以吸引动物的食用, 以便于实现种子的远距离
传播(Moser等2008)。
4 研究展望
过去十多年中, 借助于分子生物学、基因组
学、化学及生物化学等分析技术, 叶绿素的降解
代谢及其调控方面的研究取得了许多实质性乃至
突破性的进展, 叶绿素降解的主要生化途径已被
基本阐明清楚。但是, 仍存在不少问题有待深入
探索和进一步澄清。首先, 叶绿素降解过程中的
脱镁反应是如何进行的？其次, SGRs/NYEs在叶
绿素降解过程中的确切生化功能和分子功能也尚
待进一步澄清。此外, 植物体内是否存在其他的
叶绿素降解代谢途径？Shemer等(2008)发现, 在柑
橘类果实的成熟阶段叶绿素酶CLH参与了叶绿素
的降解代谢, 这是否意味着不同物种间的叶绿素
降解代谢存在差异？
叶绿素降解是绿色器官衰老的特征性过程之
一, 与其他特征性过程(光合功能下降, 亚细胞结构
特别是类囊体的解体, 大分子物质的降解与转运
等)存在相对独立但又相互关联的协同调控关系。
叶绿素降解与其他衰老特征性过程协调调控的途
径是什么？存在哪些交叉调控节点？另外, 衰老
启动与进程相关的外界环境信号、内源激素以及
多种转录因子(WRKY、NAC、MYB、bZIP和
bHLH等 )是如何调控叶绿素降解的 (Buchan-
an-Wollaston等2003; Li等2012; Guo 2013)？调控
叶绿素降解的各种信号途径间是否存在交互作用
(cross-talk)？叶绿素降解的代谢产物能否反馈调
节叶绿素的降解乃至绿色器官的衰老？这些问题
都有待深入探明。
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