全 文 ：植物生理学通讯 第 46卷 第 3期, 2010年 3月 245
黄瓜中CBF1基因的克隆及其表达分析
李丹, 蒋欣梅 *, 于锡宏 *
东北农业大学园艺学院蔬菜生理与设施园艺研究室, 哈尔滨 150030
提要: 以黄瓜中 RNA为模板, RT-PCR扩增出 CBF1基因 cDNA序列的部分片段。测序表明此基因与黄瓜 CBF1基因的同
源性达 99.44%。RT-PCR方法检测结果显示, CBF1基因在低温和盐胁迫下的黄瓜中表达, 而在干旱和ABA胁迫下则不表
达。
关键词: 黄瓜; CBF1; RT-PCR; 基因表达
Cloning and Expression Analysis of CBF1 from Cucumber (Cucumis sativus L.)
LI Dan, JIANG Xin-Mei*, YU Xi-Hong*
Vegetable Physiology and Installation Horticulture Laboratory, College of Horticulture, Northeast Agricultural University, Harbin
150030, China
Abstract: The CBF1 gene were obtained by RT-PCR from cucumber (Cucumis sativus). The sequence showed
high homology (99.44%) to the published sequences of CBF1. The expression patterns of the CBF1 gene in
response to low temperature, drought, ABA and NaCl stresses at different time points were further investigated
by using RT-PCR. The results showed that CBF1 gene could express under low temperature and NaCl treatment
in cucumber. However, it could not express under drought and ABA treatment.
Key words: cucumber (Cucumis sativus); CBF1; RT-PCR; gene expression
收稿 2009-11-16 修定 　2010-02-10
资助 黑龙江省教育厅项目(11 5 31 0 1 9)、哈尔滨市科技创新
人才研究专项基金项目(2 00 7 RFLXN 0 04 )、东北农业
大学创新团队课题(CXT0 02-2-3 )、黑龙江省教育厅寒
地蔬菜生物学重点实验室。
* 通讯作者(E-mail: yxh100@sohu.com/jxm0917@163.
com; Tel: 0451-55190300)。
黄瓜属于典型的冷敏型植物, 其所有组织以及
果实都对低温敏感, 通常温度在10~12 ℃以下时其
生理活动失调, 生长减缓或停止发育, 5 ℃以下则
难以适应(山东农业大学 2000)。近几年来, 人们用
分子生物学技术提高植物抗寒能力的研究进展迅
速, 特别是一类能调节许多抗寒相关基因COR (cold
responsive)的转录激活因子CBF (CRT/DRE-binding
factor)的研究甚多(Stockinger 等 1997; Liu等
1998)。CBF转录因子是AP2/EREBP类转录因子,
它们特异地结合到含有CRT/DRE元件的COR基因
启动并激活COR基因的表达, 进而提高植物的抗寒
性。组成型表达 CBF基因导致拟南芥上多个含有
CRT/DRE元件的 COR基因表达, 且不需冷诱导就
可以提高拟南芥整株的抗寒性(Liu等1998; Kasuga
等 1999), CBF基因在提高抗寒性中的功能也促进
了分离鉴定其他植物中 CBF类似基因的研究。除
了拟南芥以外, 人们已从油菜、小麦、黑麦(Jgalo
等 2001)、水稻(Chen等 2003)、番茄(Zhang等
2004)、烟草、草莓(王占斌等 2008)、葡萄(Xiao
等2006)和樱桃(赵纯和归燕2009)等植物中分离出
CBF类似基因并证明其有与CBF相似的功能。越
来越多的研究表明, 拟南芥CBF冷响应途径高度保
守地存在于高等植物中。据此, 本文以黄瓜为试
材, 克隆黄瓜 CBF1基因, 并研究其在低温、盐胁
迫、外源喷施ABA和干旱条件下的表达, 以补充
黄瓜CBF基因家族的研究, 并为今后研究黄瓜中的
低温信号转导途径提供参考。
材料与方法
试验材料为我们实验室保存的黄瓜(Cucumis
sativus L.)品种 ‘Y081’, 随机选取三叶一心期的黄
瓜幼苗置于 4 ℃的培养箱中, 8 h后取 0.1 g嫩叶,
按Trizol试剂方法(Invitrogen公司)提取总RNA, 并
用于 CBF1基因片段克隆。低温胁迫处理时, 将幼
苗转移到4 ℃的培养箱中处理0、2、4、8、12、24 h
后取叶片混匀提取总 RNA。干旱处理时, 将幼苗
植物生理学通讯 第 46卷 3期, 2010年 3月246
从土中取出, 根系除去土壤洗净后用滤纸吸干表面
水分, 放在滤纸上凉干 0、4、8、12、24 h, 取
叶片混匀提取总RNA; ABA处理时, 向生长幼苗的
营养钵中浇灌 100 μmol·L-1 ABA溶液, 每营养钵施
用 50 mL, 于处理后 0、4、8、12、24 h取叶片混
匀提取总RNA; 盐处理时, 向生长植株的营养钵中
浇灌 250 mmol·L-1 NaCl溶液, 每营养钵施用50 mL,
于处理后 0、4、8、12、24 h取叶片混匀提取总
RNA。每处理10株。
根据GenBank中登录的黄瓜CBF1基因编
码区的cDNA序列(GenBank登录号DQ776899),
采用 Pr imer 5 .0 软件设计引物 , 正向引物为 :
5 AACTTGGCGAATTACGTTGC 3, 反向引物为:
5 TATCGAATATTAGTAACTCCAAAGC 3, 委托北
京华大基因科技公司合成。按照 Easy Script First-
Strand cDNA Synthesis Super Mix 试剂盒(Trans公
司)反转录合成 cDNA。PCR反应体系为: 4 μL模
板、5 μL 10×Taq缓冲液、4 μL 2.5 mmol·L-1
dNTP、正反向引物各 1 μL、0.5 μL Taq DNA聚
合酶, 加水至 50 μL, 以 Actin基因为内标基因。扩
增引物(PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 目
的片段回收后与载体连接, 转化大肠杆菌, 挑选阳
性克隆, 委托北京华大基因科技公司测定DNA序
列。
结果与讨论
1 黄瓜 CBF1基因的克隆与序列比对
以黄瓜总RNA为模板, 进行RT-PCR扩增, 扩
增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳检测, 得到预期大小
的长为 710 bp左右的 CBF1片段(图 1), 回收产物,
经克隆、测序, 结果表明: 此片段为 716 bp, 将序
列在DNAMAN 5.0中进行多序列比对, 结果(图 2)
表明其与黄瓜 CBF1全长基因(GenBank登录号
DQ776899)的同源性高达 99.44%, 与拟南芥、白
菜和大麦 C B F1 基因的同源性分别为 9 5 . 5 2 %
(GenBank登录号NM_118681)、75.74% (GenBank
登录号 DQ402470)、51.61% (GenBank登录号
AF418204), 说明扩增出的基因片段是CBF1基因的
编码区。
2 CBF1基因表达模式分析
低温对 CBF1基因表达有影响。如图 3所示,
未经冷处理的幼苗在 4 ℃冷诱导 2 h后其CBF1基
因开始表达, 8 h达到最高峰, 随后开始下降。这
种表达特征与包括拟南芥在内的多种植物 CBF基
因的(Jgalo等 2001)相似, 这说明CBF1参与黄瓜的
冷应答过程, 可能在黄瓜的冷调节过程中起一定的
作用。此外, CBF基因多为低温诱导基因, 如拟南
芥中 CBF1、CBF2、CBF3基因在 4 ℃下处理 15
min后强烈表达(Stockinger等 1997; Gilmour等
1998)。黄瓜 CBF1的表达也受低温诱导, 4 ℃下
处理2 h后可检测到转录产物, 随着时间的延长, 转
录产物逐渐增加, 8 h达到最高, 之后逐渐下降, 24 h
时转录产物最低。
干旱、ABA及盐处理对 CBF1基因表达也有
影响。如图 4~6所示, 在干旱和ABA处理下均未
测到 CBF1的表达, 说明黄瓜的 CBF1基因可能属
于冷特异诱导基因。一般认为, 外源ABA进入植
物体后, 可引起一系列物质代谢与能量代谢的改变,
从而使植物产生对低温的适应能力(郭确和潘瑞炽
1984)。植物体内许多冷诱导基因受ABA的调控,
如外源ABA比低温驯化更能使冷诱导基因RAB18
表达(吴楚和王政权2000), 本结果显示在喷施外源
ABA条件下, CBF1基因并不表达, 说明CBF1基因
可能是通过 ABA非依赖途径而参与冷应答过程
的。盐胁迫 8和 12 h时可测到 CBF1的转录, 随
后消失。
图 1 黄瓜CBF1基因的RT-PCR产物电泳图谱
Fig.1 Electrophoresis of RT-PCR products
of CBF1 gene in cucumber
1: 目的基因; M: DNA分子量标准 DL2000。
植物生理学通讯 第 46卷 第 3期, 2010年 3月 247
图 2 黄瓜CBF基因克隆片段与其他植物CBF1基因序列的同源性比较
Fig.2 Homology comparison of CBF1 sequences in cucumber and other plants
GenBank 登录号分别为黄瓜(D Q7 768 99 )、拟南芥(N M_1 18 681 )、白菜(D Q4 024 70 )、大麦(AF4 182 04 )。
图 3 低温胁迫下CBF1基因的表达
Fig.3 Expression of CBF1 under low temperature stress
图 4 干旱胁迫下CBF1基因的表达
Fig.4 Expression of CBF1 under drought stress
图 5 ABA处理时的CBF1基因表达
Fig.5 Expression of CBF1 under ABA treatment
图 6 盐胁迫下CBF1基因的表达
Fig.6 Expression of CBF1 under NaCl stress
植物生理学通讯 第 46卷 3期, 2010年 3月248
参考文献
郭确, 潘瑞炽(1984). ABA对水稻幼苗抗冷性的影响. 植物生理
学报, 10 (4): 295~303
山东农业大学主编(2000). 蔬菜栽培学总论. 北京: 中国农业出
版社, 206~210
王占斌, 黄哲, 郑苗苗(2008). 抗冻诱导因子 CBF基因及其在木
本植物的抗寒应用. 林业科技开发, 22 (5): 9~13
吴楚, 王政权(2000). 脱落酸及其类似物与植物抗寒性之间的关
系. 植物生理学通讯, 36 (6): 562~567
赵纯, 归燕(2009). CBF转录因子在植物抗冷育种中的应用. 农
业科技通讯, 6: 92~94
Chen JQ, Dong Y, Wang YJ, Liu Q, Zhang JS, Chen YS (2003).
An AP2/EREBP-type transcription-factor gene from rice is
cold-inducible and encodes a nuclear-localized protein. Theor
Appl Genet, 107: 972~979
Gilmour SJ, Zarka DG, Stockinger EJ, Salazar MP, Houghton JM,
Thomashow MF (1998). Low temperature regulation of the
Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional activators as
an early step in cold-induced COR gene expression. Plant J,
16: 433~442
Jgalo KR, Kleff S, Amundsen KL, Zhnag X, Hakae V, Zhnag JZ,
Dei ts T , Thomashow MF (200 1). Components of the
Arabidopsis C-repeat/dehydration-responsive element bind-
ing factor cold-response pathway are conserved in Brassica
napus and other plant species. Plant Physiol, 127: 910~917
Kasuga M, Liu Q, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki K, Shinozaki K
(1999). Improving plant drought, salt, and freezing toler-
ance by gene transfer of a single stress-inducible transcrip-
tion factor. Nat Biotechnol, 17: 287~291
Liu Q, Kasuga M, Sakuma Y, Abe H, Miura S, Yamaguchi-Shinozaki
K, Shinozaki K (1998). The transcription factors, DREB1
and DREB2, with an EREBP/AP2 DNA binding domain sepa-
rate two cellular signal transduction pathways in drought-
a nd l ow - te mp er a t u re -r es p on si ve ge ne e xp r es si on ,
respectively, in Arabidopsis. Plant Cell, 10: 1391~1406
Stockinger EJ, Gilmour SJ, Thomashow MF (1997). Arabidopsis
thaliana CBF1 encodes an AP2 domain-containing tran-
scription activator that binds to the C-repeat/DRE, a cis-
acting DNA regulatory element that stimulates transcrip-
tion in response to low temperature and water deficit. Proc
Natl Acad Sci USA, 94: 1035~1040
Xiao H, Siddiqua M, Braybrook S, Nassuth A (2006). Three grape
CBF/DREB1 genes respond to low temperature, drought and
abscisic acid. Plant Cell Environ, 29: 1410~1421
Zhang X, Fowler SG, Cheng H, Lou Y, Rhee SY, Stockinger EJ,
Thomashow MF (2004). Freezing-sensitive tomato has a
functional CBF cold response pathway, but a CBF regulon that
differs from that of freezing-tolerant Arabidopsis. Plant J,
39: 905~919