全 文 ：植物生理学通讯 第41卷 第6期，2005年12月 755
中药植物黄山药发根基因的遗传转化
顾月华* 李艳
中国科学技术大学生命科学学院，合肥 230027
提要 以发根农杆菌菌株 A4 转染已预培养 1 d 的黄山药茎段后，共感染 3 d，其转化效果最佳；转化毛状根在无生长调节
物质的 MS 培养基上培养可获得丛状芽，并发育成植株。
关键词 黄山药；发根农杆菌；转化；再生植株
Genetic Transformation of Dioscorea panthaica with Agrobacterium rhizogenes
GU Yue-Hua*, LI Yan
School of Life Sciences, University of Science and Technology of China, Hefei 230027, China
Abstract The perfect efficiency of genetic transformation of Dioscorea panthaica stem from pre-cultivation 1
d and co-cultivation 3 d, was got by the combination of strain A4 and Agrobacterium rhizogenes. Clustered
shoots could grow from hairy roots in MS medium without growth regulators and then could form regenerated
plants.
Key words Dioscorea panthaica; Agrobacterium rhizogenes; transformation; plant regeneration
收稿 2005-03-28 修定 　2005-08-29
*E-mail: yhgu@ustc.edu.cn, Tel: 0551-3601446
黄山药(Dioscorea panthaica)的组培快繁国内
已有所报道，但再生植株率不高，成本较高，难
以在生产中应用[1]。因此，探索其它有效途径解
决黄山药的资源问题显得很重要。本文探讨影响
发根农杆菌转化黄山药外植体形成再生植株的一些
因 素 。
材料与方法
发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)菌株
TR105和 A4 由合肥工业大学罗建平先生惠赠，黄
山药(Dioscorea panthaica)试管苗是我们实验室保
存 的 。
取黄山药试管苗，在无菌条件下接种到 M S
培养基上扩繁，留作感染实验。培养温度为
(25±2)℃，12 h光照(光强36.4 mmol·m-2·s-1)/12 h
黑 暗 。
发根农杆菌菌株先在27.5℃的黑暗中培养活
化 2 d 后，接种到 LB 固体培养基上，以相同的
条件培养 2~3 d，得到单菌落，待用。
分别挑取一定量活化的单菌落，置于LB液体
培养基中(30 mL· 瓶-1)，于 28℃黑暗条件下振荡
(120 r·min-1)培养 24 h。在此过程中，每隔2 h
取出 1瓶，用分光光度计测其OD 值(l=600 nm)，
绘制菌株生长曲线。另挑取两菌株单菌落经液体
培养(分别为 14 和 20 h，培养条件同上)，离心
(2 130×g)取沉淀，后用LB培养基悬浮使其OD值
(l=600 nm)达到 0.6~0.8，留作感染[2,3]。
发根农杆菌感染植物时，取扩繁 2 周后的无
菌苗，茎段切成约1 cm的小段，幼叶切成0.5 cm2
大小，然后以不含生长调节物质的 MS 培养基上
分别预培养0、1、2、3 d 后用于转化。培养条件
为：(25±2)℃，12 h光照(光强36.4 mmol·m-2·s-1)/12
h 黑暗。预培养后的外植体置于备用的菌液中，
处理 20~30 min 后用无菌滤纸吸去表面的菌液，
再置于不含生长调节物质的MS培养基上分别共培
养2、3、4、5 d，后转移到含有头孢噻圬钠(Cef)
500 mg·L-1 的MS培养基上。以未感染农杆菌的外
植体为对照，重复 3 次。培养条件为(25±2)℃，
黑 暗 。
作毛状根诱导及植株再生时，感染的外植体
培养 1~2 周后，毛状根陆续出现。每隔 10 d 更
换培养基 1 次，Cef 量依次减少，减至 5 次后即
将外植体转移到无Cef 的 MS 培养基上生长。3周
后，毛状根处出现丛状芽，剪下转移到MS 培养基
上，于(25±2)℃、12 h光照(光强36.4 mmol·m-2·s-1)/
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12 h黑暗条件下进行诱导分化培养，再生植株。
结果与讨论
1 发根农杆菌的生长
如图1所示，TR105菌株和 A4菌株生长速率
分别于 14 和 20 h 达到最大值，是菌株生长最旺
盛阶段，对外植体细胞的附着和 T-DNA 的转化十
分有利，在离体感染中转化效率较高[4]。
2 毛状根的诱导
外植体经菌液感染6~7 d 后，其切口处开始
膨大突起，这些突起在无生长调节物质的 MS 培
养基上3 d后即诱导出现毛状根(图2-a); 也有些转
化的外植体在切口处膨大伸长，长出的愈伤组织
变成淡黄色，后出现毛状根。诱导出的毛状根呈
乳白色且粗壮，表面有白色细小绒毛，根向地性
生理特征消失，向培养基各个方向辐射生长(图2-
b、c)。对照组外植体约在 1 个月后分化长出正
常根，根呈黑褐色细长状，并有明显的向地生长
特 性 。
3 影响毛状根诱导的因素
3.1 菌株和外植体 菌株TR105感染的外植体一般
在12 d 出现毛状根，菌株A4 则稍早些(大约为9
d)。感染菌株TR105 的茎段发根的致根率显著低
于菌株 A 4 。从对单个外植体诱导来看，菌株
TR105 的发根诱导密度也低于菌株 A4。显示菌株
A4 诱导毛状根的效果较强于菌 TR105。叶片在感
染2 种菌液后都未长出毛状根(表1)。
图1 TR105和A4菌株生长进程
Fig.1 Growth course of A. rhizogenes TR105 and
A4 strains in LB liquid medium
表2 预培养时间对毛根诱导的影响
Table 2 Effect of pre-cultivation time of explants on induction
of hairy root by A. rhizogenes TR105 and A4
预培养 致根率/% 毛根诱导密度 时间/d TR105 A4 TR105 A4
0 11.0 20.5 1.2 1.3
1 16.6 24.3 1.7 2.7
2 8.0 14.4 1.1 1.2
3 4.0 11.0 1.0 1.0
3.2 预培养时间 从表2可见，茎经预培养1 d后诱
导效果最好，致根率和发根密度都最高。
3.3 共培养时间 经过共培养的茎段，其与TR105
菌株共培养5 d 的诱导效果最好，A4菌株以共培
养3 d 的效果最佳。从致根率和毛根诱导密度来
看，随着菌株 TR105 与茎段共培养时间的增加，
菌液的诱导效果逐渐增强，5 d 达到最高。A4 菌
株从 2 d 起诱导效果逐渐增强，3 d 最强，后明
显下降(表 3)。这与前人的结果[5,6]基本一致。
表1 菌株和外植体对黄山药毛根诱导的影响
Table 1 Induction of hairy root from stem and leaf explants of D. panthaica infected by A. rhizogenes TR105 and A4
茎段 叶片
处理 处理 产生毛根外 毛根总 致根率/ 毛根诱 处理 产生毛根外 毛根总 致根 毛根诱
数 /个 植体数/个 数/个 % 导密度 数 /个 植体数/个 数/个 率/% 导密度
对照 411 0 0 0 0 210 0 0 0 0
TR105 420 43 62 10.2 1.4 205 0 0 0 0
A 4 415 74 156 17.8 2.1 200 0 0 0 0
表中为菌液感染外植体后1个月的统计结果。致根率(%)＝(产生毛根外植体数/处理数)×100，发根诱导密度＝毛根总数/产生
毛根外植体数。
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4 植株再生
外植体感染2周后在无生长调节剂的MS培养
基上生出的毛状根逐渐长芽，毛状根周围呈簇
状。再将丛状芽剪下接种到无生长调节剂的 M S
培养基上，约7~8 d后转化芽开始生根，呈毛状。
继代后，转化苗出现大量正常根，有些植株的茎
节处还会长出新的毛状根(图2-f)。约1个月，转
化苗可再生成植株。转化与未经转化无菌苗，在
形态上有一些差异，转化苗的叶片大而略微有皱
表3 共培养时间对茎毛状根诱导的影响
Table 3 Effect of co-cultivated time of explants with A.
rhizogenes TR105 and A4 on induction of hairy root
共培养 致根率/% 毛根诱导密度 时间/d TR105 A4 TR105 A4
2 6.23 9.56 1.01 1.31
3 9.22 25.11 1.16 2.97
4 10.19 13.27 1.35 1.71
5 15.37 6.53 1.82 1.66
图2 毛状根诱导和植株再生
Fig.2 Induction of hairy roots and plant regeneration
　　a：感染菌液 14 d 后的茎段出现的毛状根；b：感染菌液 20 d 的茎段出现的毛状根；c：未感染菌液的茎段；d：转化植
株(整体图)；e：转化植株(局部图)；f：转化植株(有毛根)；g：未转化植株(整体图)；h：未转化植株(局部图)。
5 Holford P, Hernandez N, Newbury HJ. Factors influencing
the efficiency of T-DNA transfer during co-cultivation of
Antirrhinum majus with Agrobacterium tumefaciens. Plant
Cell Rep, 1992, 11: 196~199
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Unguiculata L. Walp) using Agrobacterium tumefaciens.
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ations and root nodule formation in Agrobacterium
rhizogenes-mediated transgenic hairy roots of peanut (Arachis
hypogae L.). Ann Bot, 1998, 81: 355~362
缩，茎可伸长，根有分叉[7](图2-d~h), 可以发育
成植株。
参考文献
1 马林, 张玲, 李卫峰. 黄山药丛生芽诱导与植株快速繁殖. 生
物技术, 2004, 14(2): 53~54
2 王关林, 方宏筠. 植物基因工程原理与技术. 北京: 科学出版
社, 1998. 219~220
3 范莠容, 李广武, 沈萍. 微生物学实验. 北京: 高等教育出版
社, 1993. 117~119
4 许耀, 贾敬芬, 郑国锠. 根癌农杆菌T-DNA在向日葵离体组
织中的转移与表达. 云南植物研究, 1998, 10(2): 159~166