全 文 ：植物生理学通讯 第 40 卷 第 1期，2004 年 2 月 75
收稿 2003-01-17 修定　 2003-06-06
资助　 国家攀登预选项目(J00-A-005,G19990116)和国家自然科
学基金课题(30070361)。
* 通讯作者（E-mail:shunongb@pku.edu.cn, Tel:010-
62755870）。
一种利用普通垂直电泳槽回收PAGE 胶蛋白条带的简便方法
王东辉 韩 韬 龚化勤 张 力 白书农*
北京大学生命科学学院, 北京 100871
A Simple Method for Protein Recovery with Ordinary Electrophoresis Apparatus
WANG Dong-Hui, HAN Tao, GONG Hua-Qin, ZHANG Li, BAI Shu-Nong*
College of Life Sciences, Peking University, Beijing 100871
提要 植物总蛋白样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离之后，直接用考马斯亮蓝染色、切胶回收目的条带，再用聚丙烯酰
胺凝胶电泳槽电洗脱纯化得到单一条带的目的蛋白。此法可得到有活性的黄瓜衰老叶片中被特异激活的 DNA 酶，对样
品中含量少，特别是与其他分子量相近的蛋白质十分有效。
关键词 蛋白质纯化；电洗脱；DNase
最近我们在研究黄瓜单性花发育分子机制时
发现，雌花雄蕊中出现特异的、与叶片衰老时
出现的 DNA 酶活性相同的蛋白[1]。如何分离这一
区域中特异激活的 DNA 酶成了急需解决的问题。
常用的层析和电泳方法对我们的实验有一些困
难。前者需要的样品量大，而黄瓜幼花本身很
小，要取其中包含雄蕊的区域所得到的样品量更
少，难以用于目的蛋白的纯化。后者虽然可以
用于少量材料的蛋白分析，但从复杂的蛋白条带
中分离出目的条带常用的活性染色方法[2,3]，由于
其分辨率低，很难准确分离出目的条带。为了
解决这一问题，我们尝试在以 PAGE 胶从样品中
分离蛋白之后，直接用常规的考马斯亮蓝染色，
切胶回收目的条带，再用常规的 PAGE 胶电泳槽
电洗脱纯化目的蛋白，成功地从雌花雄蕊区域和
衰老叶片中得到了纯化且具有相同活性的 D N A
酶。现介绍如下。
材料与方法
1 试剂
Tris、SDS、甘氨酸等蛋白电泳试剂购自北
京化学试剂公司；低分子量标准蛋白购自上海东
风试剂公司。
2 方法
2.1 蛋白质的提取 可溶性蛋白按照Mittler 和
Lam[4]的方法获得。材料用液氮冷冻、在研钵中
磨碎后，每克加入1 mL提取缓冲液[100 mmol.L-1
3-（N-吗啡啉）乙磺酸(Mops), pH 6.8；5 mmol.
L-1 抗坏血酸盐；2 mmol.L-1 还原性谷胱苷肽；1
mmol.L-1 氯化钙；1 mmol.L-1 氯化镁；0.5 mmol.
L-1 苯甲基磺酰氟 (PMSF); 10 mmol.L-1 氯化锌]浸提
2 h,离心后以12 000×g于4℃下离心10 min，上
清液即为粗蛋白。
2.2 蛋白质的分离与分析 SDS-PAGE方法主要
按照文献4方法进行。浓缩胶4％，分离胶12％。
电泳槽用BioRad Mini3型。氯化钾染色用预冷的
0.5 mol.L-1 KCl 染 SDS-PAGE胶 5 min[2,3]。考马
斯亮蓝染色、脱色也按照文献5进行; 振荡染色2
h（100 mL 染色液：0.25 g 考马斯亮蓝、45 mL
甲醇、45 m L 水、10 mL 冰醋酸），用脱色液
(100 mL 脱色液：45 mL 甲醇、45 mL 水、10 mL
冰醋酸)脱色直至背景清晰。
2.3 电洗脱纯化目的蛋白 将含目的蛋白的凝胶切
下后装入合适的透析袋中，加入 1 mL 电洗脱液
（50 mmol.L-1 Tris、50 mmol.L-1 甘氨酸、0.1%
技术与方法Techniques and Methods
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SDS, pH 8.9）。在普通 SDS-PAGE 上、下电泳
槽中加入适量的电洗脱液，将装好的透析袋放入
上槽中，再装好电泳槽，100 V 电压，洗脱2 h。
洗脱完毕后，将透析袋中溶液取出，并弃去碎
胶，溶液用 SDS-PAGE 电泳检查效果。鉴定后正
确的蛋白溶液装入透析袋中，用 PBS 溶液于 4℃
下透析过夜。其间换 PBS 溶液 2~3 次。透析好的
蛋白冻干浓缩后，用以进行转膜测序或制备抗
体 。
2.4 DNA酶活性的胶内测定 主要参照 Mittler 和
Lam[4]方法进行，略有修改。在普通的 SDS-PAGE
胶中，每10 mL分离胶加入50 μL 2 mg. mL-1鲑
精 DNA 后，进行电泳。电泳完毕后，卸下的SDS-
PAGE胶在洗脱缓冲液（100 mmol.L-1 Tris-Cl、1
mmol.L-1 EDTA、1 mmol.L-1 EGTA、 1% β - 巯
基已醇、1 mmol.L-1 PMSF ，pH 8.5）中震荡洗
脱1 h,再换新的洗脱缓冲液洗脱过夜，翌日再换
新的洗脱缓冲液洗脱 1 h。最后，于加终浓度为
10 mmol.L-1 锰离子的新的洗脱缓冲液中，37℃下
静置保温10 h以上。进行溴化乙啶染色，紫外灯
下观察。
结果与讨论
为了检测纯化效果，我们以黄瓜衰老叶片所
提取的蛋白为材料比较了氯化钾染色法和考马斯亮
蓝染色法在 PAGE 胶蛋白检测中的分辨率。从图
1 可见，在 DNA 酶所在的 33~37 kD 区域，氯化
钾染色的胶中有一片较宽的白色不透明蛋白带；
而在考马斯亮蓝染色的胶中则可以清晰地分辨出3
条带。其中箭头所指为胶内活性测定（in gel
assay）中确定的 DNA 酶蛋白带。用刀片切下该
蛋白带，放入含电洗脱缓冲液的透析袋中。将收
集有目的蛋白条带胶块的透析袋放在BioRad 电泳
槽的上槽中，上、下槽均加入电洗脱缓冲液。根
据我们的经验，在BioRad小型电泳槽中稳压100
V电泳2 h，即可将透析袋中的蛋白从胶块中洗脱
出来。取出透析袋中的胶块，经过适当的透析和
冻干，即可得到纯化的目的蛋白。回收的蛋白为
单一的条带（图 2 ）。
为了证明所得到的蛋白是否是所需要的 DNA
酶蛋白，我们对所回收纯化的分子量为 35 kD 蛋
白进行了胶内活性测定。结果表明，所纯化的蛋
白与直接从黄瓜衰老叶片中所提取的粗蛋白一样，
具有明显的 D N A 酶活性（图 3 ）。
以上结果说明，用常规的电泳仪对 PAGE 胶
图1 两种染色方法的比较
图中两种染色方法所用的为同一块胶。1.先用预冷的0.5
mmol.L-1 KCl 染色。2.照相后再将此胶以考马斯亮兰染色。大
括号所标出的区域用考马斯亮蓝染色可以分辨出多个蛋白条带；
而以 KCl 染色则基本上无法分辨出蛋白条带。箭头所示为本实
验中所要回收的分子量为 35 kD 目的蛋白。该蛋白在 KCl 染色
方法中无法分辨，而在考马斯亮蓝染色中则可辨清晰。1和2中
4 条泳道为同一样品的重复。
图2 回收纯化的蛋白
图中结果是以考马斯亮蓝染色方法染色后用电洗脱方法回
收的分子量为 35 kD 目的蛋白。泳道 1、2 为含 DNA 酶活性的
黄瓜衰老叶片总蛋白。箭头所示为 35 kD 具有 DNA 酶活性的
蛋白。泳道 3、4 为用电洗脱方法纯化的 35 kD 目的蛋白单一
条带。
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中的目的蛋白进行回收纯化是非常简便的。根据
我们的经验，无论是什么样品的蛋白，或用什么
方法提取蛋白，只要是常规 SDS-PAGE 胶中能够
分辨的蛋白，都可以用这种方法进行回收纯化，
其回收效率也相当高。在我们的实验中，从 2 个
胶块中回收的蛋白，即可用作 DNA 酶蛋白电泳纯
度鉴定；而从 10 个胶块中即可制备得到 2 m g
D N A 酶蛋白。此外，我们还用此方法成功回收
纯化了分子量高达120 kD的蛋白。我们认为这种
方法对分离纯化样品中含量少，特别是与其他蛋
白分子量相近的蛋白是十分有效的。
参考文献
1 Hao YJ, Wang DH, Peng YB et al. DNA damage in the early
primordial anther is closely correlated with stamen arrest in the
female flower of cucumber (Cucumis sativus L.). Planta, 2003,
217:888~895
2 Dahmusme HC. Rapid visualization of protein bands in prepara-
tive SDS-polyacrylamide gels. Anal Biochem,1979,93:257~260
3 Lee C, Levin A, Branton D. Copper staining: a five-minute pro-
tein stain for sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gels. Anal
Biochem,1987,166:308~312
4 Mittler R, Lam E. Identification, characterization, and purifica-
tion of a tobacco endonuclease activity induced upon hypersen-
sitive response cell death. Plant Cell, 1995,7:1951~1962
5 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T.金冬雁，黎孟枫译.分子
克隆实验指南.第2版.北京：科学出版社,1992. 880~886
图3 纯化的35 kD蛋白的DNase活性检测
1.衰老叶片总蛋白; 2.绿色叶片总蛋白; 3.回收纯化的35kD
蛋白。回收纯化的 35 kD 蛋白有与衰老叶片中蛋白相同的 DNA
酶活性（箭头所示条带）。