全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 052839204
铁蟹过敏原的分离、鉴定和快速纯化
张明琦1 ,2 　支玉香3 　吕淑霞1 　李淑荣2 　董晓颖1 　潘家荣2 　高美须2
(11 沈阳农业大学生物科学技术学院 ,沈阳 辽宁　110161 ; 21 中国农业科学院农产品加工研究所 ,北京　100193 ;
31 北京协和医院变态反应科 ,北京　100052)
摘 　要 :应用免疫印迹 (Western blot) 的方法鉴定铁蟹过敏原组分 ,然后利用电泳洗脱的方法快速纯化主
要过敏原。取磷酸盐缓冲液制备的铁蟹肉浸出液 ,经十二烷基磺酸钠2聚丙烯酰胺凝胶电泳 ( SDS2
PAGE)分离 ,测定各组分的相对分子量 ,然后利用 18 例蟹过敏患者的血清进行免疫印迹 ,鉴定出主要和
次要过敏原 ,利用普通垂直电泳槽快速洗脱主要过敏原蛋白 ,并鉴定活性。结果显示 ,SDS2PAGE显示铁
蟹肉可辨条带有 16 条 ,相对分子质量在 1615～168kD 之间。Western blotting 结果表明 ,铁蟹肉浸出液共
有 10 条过敏条带 ,其中相对分子质量为 76kD 的蛋白条带 ,阳性反应率为 100 % ,纯化后获取了 76kD 的
主要过敏原 ,经过免疫印迹鉴定其具有免疫活性。表明相对分子质量 76kD 的组分为铁蟹主要过敏组
分 ,快速电洗脱可以纯化相对分子量为 76kD 的过敏原组分。
关键词 :铁蟹肉 ;过敏原 ;十二烷基磺酸钠2聚丙烯酰胺凝胶电泳 ;免疫印迹 ;蛋白质纯化
ALLERGEN SEPARATION, IDENTIFICATION AND RAPID PURIFICATION FROM IRON CRAB
ZHANG Ming2qi1 　ZHI Yu2xiang3 　LU Shu2xia1 　LI Shu2rong2 　DONG Xiao2ying1 　PAN Jia2rong2 　GAO Mei2xu2
(1. College of Bioscience and Technology , Shenyang Agricultural University , Shenyang , Liaoning 　110161 ;
2. Institute of Agro2food Science & Technology , Chinese Academy of Agricultural Sciences , Beijing 　100193 ;
3. Department of Allergy , Peking Union Medical College Hospital , Beijing 　100052)
Abstract :Allergen components from iron crab were analyzed and purified by rapid method. . The crude extracts were prepared
through phosphate buffer saline. Proteins from the extract were separated by SDS2PAGE. The allergen proteins were identified
through reaction to 18 crab allergic patients’sera. Ordinary Electrophoresis Apparatus was used to purify and identify the
major allergen. SDS2PAGE profiles revealed that the proteins from iron crab comprised at least sixteen discrete protein bands
with the molecular weight ranging from 1615kD to 168kD. Western blotting assay showed that there were ten allergenic bands
in the crude extract , and the band of 76kD was the major allergenic component . The positive rate of the 76kD major allergen
protein was one hundred percent . The major allergenic component maintained immunocompetence after purification. The major
allergen from iron crab was protein with molecular weight of 76kD and could be purified by Ordinary Electrophoresis
Apparatus.
Key words :iron crab ; allergen ; SDS2PAGE ; Western blot ; protein purification
收稿日期 :2009204224 　接受日期 :2009205206
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30470999) ,农业部农业公益性行业科研专项经费项目“核技术农业应用”资助 (200803034)
作者简介 :张明琦 (1983 年2) ,女 ,辽宁沈阳人 ,硕士研究生 ,专业为生物化学与分子生物学。E2mail :zhangmingqi111 @163. com.
通讯作者 :高美须 (19652) ,女 ,河北藁城人 ,副研究员 ,从事食品辐照研究和应用。E2mail :meixugao @21cn. com ;Tel : 010262815961　　食物过敏是当前食品安全领域内较为突出的问题之一。在联合国粮农组织提出的八大类容易引起过敏的食物中 ,虾和蟹是常见的成年人过敏原。根据流行 病学调查显示 ,在美国约有 10 %～30 %的成年人受到过敏性疾病的困扰 ,儿童的发病率为 40 % ,其中甲壳类动物过敏的发病率为 015 %[1 ] ,我国沿海地区食蟹
938　核 农 学 报　2009 ,23 (5) :839～842Journal of Nuclear Agricultural Sciences
及其制品的过敏率较高[2 ] ,其临床表现有腹痛、腹泻、
呕吐、皮疹、鼻炎、头痛、血管性水肿、哮喘等症状。国
外曾对雪蟹加工厂的工人进行调查 ,结果显示他们普
遍患有职业性哮喘 ,并伴有胸闷 ,呼吸困难和咳嗽等症
状[3 ] 。铁蟹又称铁　蟹 ,是市场上流行的一种美食蟹 ,
本试验对铁蟹过敏原进行分离、鉴定和纯化 ,以对该过
敏性疾病特异性临床诊断和进一步开展分子生物学方
面的研究奠定理论基础。
1 　材料与方法
111 　材料与试剂
鲜活的铁蟹在当地市场购买 ,18 例蟹过敏患者特
异性血清由北京协和医院变态反应科提供。
主要实验设备 : TGL216A 高速冷冻离心机 (长沙
平凡仪器厂) 、DYY26C 型电泳仪、DYCZ224D 型垂直电
泳槽及转印装置 (北京六一仪器厂) 、WD29405B 型水平
摇床 (北京六一仪器厂) 、Genesis25XL 冷冻干燥机 (美
国 Virtis) 。
试剂 : 丙烯酰胺 (Acr) 、甲叉双丙烯酰胺 (Bis) 、十
二烷基磺酸钠 (SDS) 、巯基乙醇、TEMED、甘氨酸、Tris、
吐温220、硝酸纤维膜 (NC)和辣根过氧化物酶标记的羊
抗人抗体均购自 Sigma 公司 ;预染的蛋白 Maker (62
175kDa) 购自 NEW ENGLAND Biolabs Inc。其他均为国
产分析纯试剂。
112 　方法
11211 　铁蟹肉粗浸液的制备 　提取方法参考 Myung2
woobyun 等的方法并略做修改[4 ] ,鲜活铁蟹于蒸馏水中
煮沸 30 min ,去蟹壳及内脏 ,取蟹肉 ,用丙酮浸泡 48 h ,
待丙酮挥发完全后取蟹肉 ,按 1g 蟹肉加入 0101 molΠL
磷酸盐缓冲液 (pH 714) 8 ml 的比例提取铁蟹粗浸液 ,
4 ℃条件下提取 48 h ,每天搅拌 1 次 ,每次搅拌 30 min。
再经 10000 rΠmin 离心 15 min ,取上清液 ,即为蟹肉蛋白
粗浸液。
11212 　SDS2PAGE 分析 　采用不连续凝胶垂直板电
泳 ,对蟹肉粗浸液组分进行分析。浓缩胶浓度为 5 % ,
分离胶浓度为 15 %。样品和上样缓冲液混合后于
100 ℃沸水中加热 3～5 min ,快速离心后直接上样 ,电
泳电压采用 100V ,待溴酚蓝指示剂接近底部时停止电
泳 ,用考马斯亮蓝 R2250 染色 20 min ,然后用蒸馏水反
复冲洗后 ,再用 0125 molΠL 的 KCl 溶液脱色 ,整个过程
约 1h 左右。
11213 　Western 　blot 鉴定 蟹粗浸液按照 11212 的方
法电泳结束后 ,小心剥离分离胶 ,用转印缓冲液浸泡后
正确放置在转印装置上 ,100V ,2 h 电转移至 NC 膜上 ,
转印后 ,将膜用丽春红染色 5 min ,然后用蒸馏水冲洗
膜 ,确证蛋白已转印到膜上。已转印的 NC 膜用 5 %的
脱脂奶粉室温摇床封闭 1 h ,然后加入一抗 (18 例病人
血清和阴性血清用封闭液以 1∶5 稀释) 4 ℃孵育过夜 ,
次日取出膜 ,用 TBST 洗膜 5 次 ,摇床上每次 5 min ,然
后加入用 TBST(1∶1000)稀释的二抗 (羊抗人 IgE2HRP)
室温孵育 1h ,同上方法洗膜 ,最后采用二氨基联苯胺
(DAB)避光显色 15 min ,以蒸馏水终止反应。
11214 　过敏蛋白的电泳洗脱纯化 　按照 11212 的方
法进行电泳后 ,取下分离凝胶 ,将凝胶置于干净的平皿
内 ,重蒸水漂洗 3 次 ,加入事先预冷的 0125 molΠL 的
KCl 显色 ,出现明显的蛋白条带后立即倒去显色液 ,切
下按 11213 Western blot 鉴定的主要致敏蛋白的目标蛋
白。参照王东辉的方法略做改良[5 ] ,将切下的目标蛋
白装入合适的透析袋中 ,加入电极缓冲液至浸没凝胶 ,
将透析袋放在垂直电泳槽的上槽中 ,接好装置 ,250V
电压下洗脱约 4h。洗脱完毕后 ,将透析袋中溶液倾
出 ,弃去碎胶 ,溶液用 SDS2PAGE 电泳检查效果。鉴定
后将目标蛋白溶液装入透析袋中 ,用 PBS 溶液于 4 ℃
下透析过夜 ,其间换 PBS 溶液 2～3 次 ,透析好的蛋白
冻干浓缩 ,储存于 - 80 ℃冰箱中。
11215 　过敏蛋白免疫学活性的 Western blot 检测　将
电泳洗脱的冻干蛋白 ,重新溶于 PBS 溶液中。再按照
11212 和 11213 的方法重新鉴定纯化的过敏蛋白的
活性。
2 　结果
211 　铁蟹肉粗浸液 SDS2PAGE结果
SDS2PAGE结果显示 (图 1) ,铁蟹粗提液中可辨条
带有 16 条 ,分布在 1615～168 kD 之间 ,其中主带有 10
条 ,分子量是 168、144、128、108、92、83、76、51、43 和
1615kD。赵绮华等[6 ] 对梭子蟹进行了分析 ,其结果显
示梭子蟹浸出液可辨条带有 19 条 ,分子量大小与本试
验鉴定的结果相近。
212 　蟹主要过敏原蛋白的 Western blot 鉴定
从图 2 可以看出 ,经过 Western blot 鉴定后 ,蟹肉
浸出液中有 10 条过敏条带 ,其中分子量为 76kD 的蛋
白质与 18 例蟹肉过敏患者血清特异性 lg E 显阳性反
应 ,阳性反应率为 100 % ,为铁蟹的主要过敏蛋白 ;83
和 43kD 为铁蟹的次要过敏蛋白 ,阳性反应率分别为
7212 %和 6617 % (见表 1) ,而正常人血清则呈阴性反
应。
048 核　农　学　报 23 卷
图 1 　铁蟹肉粗提液蛋白 SDS2PAGE结果
Fig. 1 　SDS2PAGE analysis of total
protein in iron crab
M:预染标准分子量蛋白 ;1 :铁蟹肉粗提液
M: marker ; 1 : crude proteins
图 2 　铁蟹肉过敏原免疫印迹鉴定图
Fig. 2 　Western blotting identification of allergens in iron crab
M为预染标准分子量蛋白 ; 1～18 为过敏患者血清 ;19 为正常人血清
M: marker ; 1～18 : allergic patients’sera ; 19 : normal sera
表 1 　通过 Western blotting 鉴定的铁蟹过敏原主要组分
Table 1 　Identification of the allergic components
of separated crab extract by Western Blotting analysis
条带编号
No. of band
分子量
Mr ( ×103)
阳性反应
positive reaction
n 百分率 percent ( %)
1 12810 3 1617
2 10810 5 2718
3 9213 2 1111
4 8310 13 7212
5 7610 18 10010
6 7010 2 1111
7 5910 4 2212
8 5110 9 5010
9 4310 12 6617
10 3215 4 2212
213 　铁蟹主要过敏原电泳洗脱结果
将电泳洗脱后的透析袋内溶液直接与上样缓冲液
混合后 ,再按照 11212 的方法电泳检测分析表明 ,利用
普通垂直板电泳槽可以纯化过敏蛋白 ,结果见图 3。
214 　铁蟹主要致敏原分离纯化后的活性鉴定结果
将透析好的纯化样品重新溶于 PBS 缓冲液中 ,按
照 11213 的方法进行免疫印迹检测 ,结果在膜上出现
条带 ,说明纯化后的蛋白仍具有活性 (图 4) 。
图 3 　铁蟹主要过敏蛋白纯化后 SDS2PAGE结果
Fig. 3 　SDS2PAGE analysis of the purified
allergen in iron crab
1 :为铁蟹肉粗提液蛋白条带 ;2 :为纯化的主要过敏蛋白 ;
M:为预染标准分子量蛋白
1 : crude proteins ; 2 : purified allergenic protein ; M: marker
3 　讨 　论
目前 ,国内外对蟹过敏原研究的报道很少 ,Patrick
148　5 期 铁蟹过敏原的分离、鉴定和快速纯化
图 4 　铁蟹分离纯化后的主要过敏蛋白 Western blot 鉴定
Fig. 4 　Western blot identification of the purified
allergen in iron crab
1 :为粗提液中的过敏蛋白 ; 2 :为纯化的主要过敏蛋白 ;
M:为预染的标准分子量蛋白
1 :allergenic protein at crude extract ; 2 : purified major
allergenic protein ; M: marker
S. C. Leung 等[7 ]报道 34kD 分子量的蛋白为雪蟹主要
过敏原蛋白 ,这是第一个被鉴定的过敏蛋白 ,命名为
chaf 1 ,且证明为原肌球蛋白 ,它具有一个开放阅读框
架 ,共编码 264 个氨基酸 ,并且与虾原肌球蛋白 Met e1
具有高度的同源性。此外B. V. Gill 等[8 ]还发现了 25、
1815 和 1414kD 也为雪蟹的主要过敏蛋白。
我国仅有赵绮华发现 48 和 74kD 分子量的蛋白为
梭子蟹的主要变应原。本文的鉴定结果为铁蟹粗提液
中可辨条带有 16 条 ,免疫印迹后出现 10 条过敏条带 ,
通过与 18 例过敏患者的血清反应 ,确定主要过敏原组
分为 76kD 的蛋白质 ,其阳性反应率为 100 %。由于蟹
的种类和人种的差异 ,所以各实验室的结果不一致。
目前治疗过敏反应最有效的手段就是避免接触过
敏原 ,而其他的手段都不能完全摆脱过敏疾病的困扰 ,
　　　　　
主要是因为过敏原种类繁多 ,对其性质研究不够详尽 ,
纯化得到单一的过敏原困难。本文利用电泳洗脱方法
纯化出单一的过敏原 ,与其他分离纯化的方法相比 ,这
种方法可以高效快速地找到过敏蛋白 ,并且可以短时
间纯化出过敏蛋白。这种方法每次纯化出过敏蛋白的
量虽然相对较少 ,但可以满足过敏原性质的研究。因
此本文的纯化方法为过敏原的进一步研究提供了技术
支持[9 ] 。
参考文献 :
[ 1 ] 　Cecilia P M , Eduardo A P. Why is there a greater incidence of allergy to
the tropomyosin of certain animals than to that of others ? [J ] . Journal of
Medical Hypotheses , 2007 ,69 : 1070 - 1073
[ 2 ] 　王亚平 ,尉　莉. 80 例过敏性疾病患者的过敏原调查[J ] . 中国麻
风皮肤病杂志 ,2005 ,21 (12) :995 - 996
[ 3 ] 　Howse D , Gautrin D , Neis B , et al . Gender and snow crab occupational
asthma in Newfoundland and Labrador [ J ] . Journal of Environmental
Research , 2006 ,101 : 163 - 174
[ 4 ] 　BYUN M W , KIM J H. Effects of Gamma Radiation on the
Conformational and Antigenic Properties of a Heat2Stable Major Allergen
in Brown Shrimp[J ] . Journal of Food Protect , 2000 ,7 : 940 - 944
[ 5 ] 　王东辉 , 韩　韬 , 龚化勤 ,张　力 ,白书农. 一种利用普通垂直电
泳槽回收 PAGE胶蛋白条带的简便方法 [J ] . 植物生理学通讯 ,
2004 ,40 (1) :75 - 77
[ 6 ] 　赵绮华 , 王锡中 , 陈丽金 ,李 　文 ,刘永平. 梭子蟹变应原的分
离、纯化与鉴定[J ] . 中国免疫学杂志. 2007 ,23 (3) :256 - 259
[ 7 ] 　Leung P S , Chen Y C , Gershwin M E , et al . Identification and
molecular characterization of Charybdis feriatus tropomyosin , the major
crab allergen[J ] . Journal of Allergy Clin Immunol , 1998 ,102 (5) : 847
- 852
[ 8 ] 　Gill B V , Cartier A , Horth2Susin L , et al . Identification of Snow Crab
proteins that elicit IgE reactivity in Snow Crab processing workers [J ] .
Journal of Allergy Clin Immunol , 2004 ,111 (2) :S97
[ 9 ] 　张明琦 ,高美须 ,支玉香 ,潘家荣 ,李淑荣 ,吕淑霞. 辐照对蟹过敏
蛋白生化性质和抗原性的影响 [J ] . 中国农业科学 ,2009 ,42 (9) :
3259 - 3264
248 Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2009 ,23 (5) :839～842