全 文 ：植物生理学通讯 第 4 4 卷 第 l期 , 20 08 年 2 月
不同碳源对白桦愈伤组织生长和三菇积累的影响
王博 , 范桂枝 , 詹亚光 ‘ , 李康
东北林业大学生命科学学院 , 哈尔滨 15 0 0 4 0
提要 : 在一个继代周期中 , 培养基中添加 10 一50 g. L 一 , 的蔗糖 、 葡萄糖和果糖后 , 白桦愈伤组织 的鲜重均上升 , 浓度为
20 ~3 0 9
·
L
一 ’的三种糖 , 其鲜重积累量均较高。 培养基中添加不同浓度葡萄糖和果糖的白桦愈伤组织中三菇物质含量先上
升后 下降 , 而添加蔗糖的则呈直线上升 。 其中 , 葡萄糖 、 果糖和蔗糖浓度为 30 9 ·L 一 , 的三菇类物质积累量最高。
关键词 : 白桦 ; 生长 ; 三菇物质 ; 碳源
E f eC ts o f D iffe r e n t C a r b o n S o u r c e s o n C a llu s G r o w th a n d A c C u m u la tio n
o fTr it
e rPe n o id s in B ir c h (B etu la Pla加匆la S u k ·)
从A N o B o , 队 N G u i一z hi, ZH A N Ya 一G u a n g ‘ , L l K a n g
Co lle g
e of L毋 S e ien e e , NO rth e a s lFO re s rry Un iv e rs ity , 月门rb in l万0 04 0, Ch in a
A b str a e t : Th e fre
sh w e ig h t o f b irc h c a llu s in e a llu s in d u e tio n m ed ia su pp le m e n t w ith l〕5 0 9 ·L 一 1 o f su e ro se ,
g lu e o se an d fr u eto se sho w e d a n u pw ar d tre n d d u rin g th e se e o n d su be u ltu r e
,
2〕3 0 9 ·L 一 1 su g ar w ere o ptim u m
fo r in e re a se o ffre sh w e ig h t in birc h e a llu s
.
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e e o n te n ts o f tri te rp en o id in ere a se d d u ri n g 于 15 o r 20 d , a n d the n
d e c re a sd d u rin g 1 5 o r 2 0一25 d in c a llu s in d u e tio n m e d ia su pple m en t o f 10一5 0 9 ·L 一 1 g lu e o se an d fru
c to se
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g lu c o se
,
fr u e to se a n d su e ro se w e re su ita ble fo r tr ite rp e n o id a e e u m u la tio n
.
K ey w o r d s : bire h (B e ru la Pla tyP hyll
a ): g r o w th ; tri te rp e n o id : earb
o n so u r e e
白桦含有的三菇物质具有很强的抗炎 、 抗过
敏 、 降血糖 、 抗病毒等作用(孟艳秋等 2 0 0 4 ; 张
云峰等 2 0 0 6) , 还具有抗肿瘤活性 , 尤其是对人
类黑色素瘤(M e lZ I、 M e I22 和 M e I24 )和神经外胚
层肿瘤具有特异性活性(李岩等 2 0 00) 。 最近又验
证认为三菇类物质是 l一 型艾滋病病毒(H IV 一 l) 的特
异抑制剂 , 并且其作用高效而低毒(张庆云等
2 0 0 6)
。 因此 , 作为最有潜力的新型药物制剂源
的白桦三菇类物质(如白桦酷醇及其衍生物) , 有
广阔的潜在应用前景而深受人们的注视 。
大规模培养植物细胞技术因具有不受地区 、
季节 、 资源 限制 、 不破坏环境 、 以及可通过 自
动化手段控制细胞生长和合理调节代谢过程生产植
物药品也受到人们的关注 。 但我们前期的工作表
明白桦愈伤组织中的三菇类物质含量较低 , 仅为
1
.
4 2 9 (D w )
。 为了提高白桦愈伤组织的三菇物
质含量 , 本文 以蔗糖 、 果糖 、 葡萄糖 为碳源 ,
以白桦茎段诱导的愈伤组织为材料 , 研究不同碳
源种类及浓度对 自桦愈伤组织的生长和三菇类物质
积累的影响 , 从而筛选出有利于 白桦愈伤组织中
三菇类物质积累的碳源种类和浓度 , 以期能为规
模化生产白桦三菇类物质提供参考 。
材料与方法
白桦(B et u la p la仰勺 lla S u k . )母树取自本校白
桦强化种子园五至七年生嫁接优树(接穗 3 0 年
生) , 外植体取 自其诱导的组培苗 。 选择生长状
态良好的白桦组培苗 , 在超净工作台上取其茎段
切成 1 c m 左右 , 去掉茎段上的叶片及侧芽 , 接
种于 白桦愈伤组织诱导培养基上 , 每瓶 3 个外植
体 , 进行白桦愈伤组织诱导 。 白桦愈伤组织诱导
与继代培养基为 15 + 0 . 6 m g. L 一’ N A A + 0 . 8 m g. L 一’6 -
B A
、
20 g’L 一 , 蔗糖 、 5. 3 g. L 一 , 琼脂粉 , pH 值为 6. 0 -
6. 5
。 每 2 5 d 继代 1 次 。 每瓶 3 个外植体 。 培养
基均以 12 1 ℃高压灭菌 2 0 m in , 培养温度为 25 一
收稿
资助
2 0 0 7
一
0 9
一
2 6 修定 2 0 0 8 一0 1 一0 2
黑龙江省科技攻关项目(G A 0 6 B 3 0 1一 4 一 3 )和东北林业人
学引进人才项 日(0 1 0 一6 0 2 0 2 3 ) 。
通讯作者(E 一 m a i一: y a g u a n g z h a n @ 1 2 6 . e o m ; T e一:
0 4 5 1
一
8 2 1 9 17 5 2 )
。
植物生理学通讯 第 4 4 卷 第 1 期 , 20 0 8 年 2 月
27 oC
, 光照强度为 40 卿0 1·m 一 , · s 一’, 光照 16 h · d 一’,
湿度为 4 0 % 一5 0 % 。
诱导出的愈伤组织在第 2 次继代时 , 从中选
择大小形态一致的愈伤组织进行不同碳源处理 。
蔗糖、 果糖和葡萄糖的浓度梯度为 10 、 20 、 3 0 、
4 0
、
5 0 g. L
一 ’。 在愈伤组织培养 25 d 的过程中 ,
每 s d 取一次样 , 称其鲜重并检测三菇类物质含
量 。 实验重复 3次 , 每个重复均为 10~2 0 个外植体 。
测定三砧类化合物含量的标准曲线以齐墩果
酸为标准样品绘制 。 精密称取 0 . 0 2 0 0 9 齐墩果
酸 , 溶解于 95 % 的乙醇中 , 定容至 10 0 m L , 配
制成浓度为 0. 2 m g’m L 一’标准储备液 。 然后从中取
0
.
1
、
0
.
2
、
0
.
3
、
0
.
4
、
0
.
5
、
0
.
6 m L 分别置于玻
璃试管中 , 加热挥发去溶剂 , 加入 0 . 2 m L 新配
制的 5 % 香草醛 一 冰醋酸和 0 . 8 m L 高氯酸 , 置于
70 ℃恒温水浴中巧 而n 后流水冷却至室温 , 加入
乙酸乙醋定容至 5 m L , ‘摇匀 , 测定波长 5 51 n m
处的吸光值 。 以乙酸乙酷试剂为空白对照 , 绘制
标准曲线(弓晓峰等 2 0 0 6 ) 。 在所测试的 3 . 3 一 24
m g
·
L
一 ’浓度范围内具有良好的线性关系 , 回归方
程为 夕= ZI . l ls x 一 3 . 2 9 6 7 , 相关系数尺2 = 0 . 9 94 4 。
制备三菇类化合物检测样品时 , 取新鲜的愈
伤组织于 8 0 ℃下烘干至恒重研磨后 , 精确称取
0
.
1司 . 2 9 样品放入 5 0 mL 离心管中
, 加入 95 % 乙
醇 10 m L 浸泡过夜(3 次), 合并提取液后加入 0. 5 9
活性碳于 40 ℃下超声(超声频率为ro 妞2) 40 而n ,
以 7 16 0 x g 离心 一0 m in , 取上清液 , 过滤纸 、
浓缩 、 蒸干 , 以 2 m L 乙酸乙酷复溶后即是样
口口口 。
三砧类物质含量以紫外分光光度法测定(孙宏
和张泽 20 05 )。 精密移取 10 0一 200 林L 待检测的样
品 , 放入试管中 , 于 7 0 ℃水浴中蒸干 。 加入 2 00
匹新配制的5 % 香草醛 一 冰醋酸溶液 , 再加入 80 0
林L 高氯酸后摇匀 , 置于 7 0 ℃的恒温水浴中巧
m in
, 流水冷却至室温 , 加乙酸乙酷定容至 5
m L
, 摇匀 , 同时以试剂为空白对照 , 用 1 c m
比色皿测定 5 51 n m 处的吸光值 。
结果与讨论
1 不同种类和浓度的碳源对白桦愈伤组织鲜重的
影响
图 1 显示 , 培养基中分别添加 10 一50 g’L 一 , 蔗
糖 、 果糖 、 葡萄糖的白桦愈伤组织鲜重均呈增长
趋势 。 不同浓度蔗糖对白桦愈伤组织鲜重积累有
显著影响 , 在 ro 一30 g’L 一 , 蔗糖浓度范围内 , 白桦
愈伤组织的生长与蔗糖浓度呈正相关关系 , 4 0
g
·
L
一’蔗糖中的白桦愈伤组织生长受到抑制 。 5 0
g’L 一’中的白桦愈伤组织增长先上升后受到一定的
抑制 , 原因可能是高浓度蔗糖起初可以充分提供
细胞生长所需营养物质 , 而后随着培养的进程 ,
高浓度蔗糖可能影响了细胞渗透压 , 以致细胞生
长受抑 。 添加 20 g’L 一’果糖的白桦愈伤组织鲜重增
长较快 , 最终达到 3 . 9 7 7 9 (F w 》瓶 一 ‘。 随着果
糖浓度的增加 , 白桦愈伤组织鲜重增长速度下
降。 添加 30 g’L 一’果糖的白桦愈伤组织鲜重增长在
后期呈停滞状态 。 以添加 20 g’L 一 , 葡萄糖的白桦愈
伤组织鲜重增长最快 , 鲜重达到 4. 787 9 (Pw ). 瓶 一, ,
但高浓度葡萄糖对白桦愈伤组织鲜重增长有一定的
1
.某‘之叫猫澎城娜棋
培养时间/ d
图 1 不同种类和浓度的碳源对白桦愈伤组织鲜重的影响
Fi g
.
l E fe
e ts o f d ife re
n t ki n d s a n d e o n e e n tra ti
o n s o f e ar bo n so u rc e s o n fre
sh w e ig h t ac e u mu lat i
o n in birc h eal tu s
植物生理学通讯 第 44 卷 第 l期 , 2 00 8 年 2 月 9 9
抑制作用 。
2 不同种类和浓度的碳源对白桦愈伤组织中三菇
类物质含量的影响
愈伤组织中三菇类物质含量对培养基中添加
的糖种类和浓度的响应趋势与鲜重不 同 。 从图 2
可见 , (l )培养基中分别添加 1 0 一5 0 g’L 一 ’蔗糖 、 果
糖 、 葡萄糖后 , 白桦愈伤组织中三菇类物质的积
累趋势皆不同。 添加果糖和葡萄糖的白桦三菇类
物质含量达到最高值的时间比在蔗糖中的早 。 这
与侯学文和郭勇(2仪刃)的结果相符 。(2) 含量以 50 g. L ’
蔗糖的最高, 白桦愈伤组织中三菇类物质积累量
达到 4 . 04 0 m g ·g 一 ’(D W )。
果精
L
一1
L
一 1
10 1 5 2 0 2 5
培养时间/ d
‡卜O„丫的·旨\如州锌川
图 2 不同种类和浓度的碳源对白桦愈伤组织中三菇类物质含量的影响
Fig Z E fe
e ts o f d ife
r e n t ki n d s a n d e o n e e n tr a ti o n s o f e ar bo n so u rc e s o n tri t e rp e n e s in e o n t e n t in b irc h e a llu s
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