全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 5期，2008年 10月 877
用AFLP分子标记探讨吴茱萸的遗传多样性
黄海 1,*, 冉贵萍 1, 刘杨 1, 何顺志 2, 黄金宝 1, 黄韵祝 1, 张小蕾 1, 黄健 1
1贵阳医学院医学检验系, 贵阳 550004; 2贵阳中医学院药学系, 贵阳 550002
提要: 用AFLP标记分析研究吴茱萸与其变种石虎和疏毛吴茱萸之间的遗传多样性。采用AFLP技术, 从 18对引物中筛选
出 3对引物, 对 19株不同地域的 3种吴茱萸AFLP指纹图谱进行了分析, 计算不同品种间的遗传距离和构建吴茱萸的聚类
分析树状图。3对引物共扩增出93条带, 其中57条(61.3%)呈多态性, 吴茱萸种质内遗传距离为0.059~0.765; 在相似系数
0.48的水平上, 19份吴茱萸材料可以大致分为2个类群。吴茱萸不同品种间遗传距离差异较大, 遗传分类在一定程度上与
传统的分类方法是一致的, 这暗示遗传变异与地域分布有相关性。
关键词: 吴茱萸; 扩增片段长度多态性; 遗传多样性; 聚类分析
Exploring Genetic Diversity in Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth. by AFLP as
Molecular Markers
HUANG Hai1,*, RAN Gui-Ping1, LIU Yang1, HE Shun-Zhi2, HUANG Jin-Bao1, HUANG Yun-Zhu1, ZHANG Xiao-Lei1, HUANG
Jian1
1Department of Clinical Laboratory Science, Guiyang Medical College, Guiyang 550004, China; 2Department of Pharmacy,
Guiyang College of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550002, China
Abstract: The AFLP was used to study the genetic diversity of 19 cultivars of Evodia rutaecarpa, Evodia
rutaecarpa var. officinalis and Evodia rutaecarpa var. bodmieri. The 3 pairs of primers were selected from 18
pairs of AFLP primers to amplify the 19 cultivars of E. rutaecarpa from 5 origins. The genetic distance analysis
and cluster analysis were performed. A total of 93 bands were detected with 3 pairs of AFLP primers and 57 of
them were polymorphic. The result of genetic distance analysis indicated that genetic distance was 0.057–0.765
among 3 varieties of E. rutaecarpa. Similarity index was 0.48 at species level, 19 cultivars could be divided into
two major clusters. The genetic differentiation of various E. rutaecarpa were abundant based on the AFLP
results, as well as which showed its regional difference.
Key words: Evodia rutaecarpa; AFLP; genetic diversity; clustering analysis
收稿 2008-05-23 修定 2008-08-21
资助 贵州省中药现代化项目(黔科合农 20 05 [5 04 7]号)。
* E-mail: huanghai828@gmc.edu.cn; Tel: 0851-6773630
吴茱萸为常用中药, 始载于《神农本草经》,
具有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻的功效。原
药材来源于芸香科植物吴茱萸[Evodia rutaecarpa
(Juss.) Benth.]、石虎[Evodia rutaecarpa (Juss.)
Benth. var. officinalis (Dode) Huang]及疏毛吴茱萸
[Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth. var. bodmieri (Dode)
Huang]的干燥近成熟果实。吴茱萸的药材商品分
为大花吴茱萸与小花吴茱萸两种, 小花吴茱萸就是
石虎和疏毛吴茱萸的果实, 且小花吴茱萸优于大花
吴茱萸品质。生吴茱萸为外用, 长于祛寒燥湿, 因
其性热有小毒, 入药多为炮制品, 盐制引药入肾, 适
于疝气疼痛(中国医学科学院药物研究所 1997)。
吴茱萸的有效成分主要为生物碱和柠檬苦素(孟娜
等 2006), 不同品种和不同产地的药材其有效成分
含量存在较大差异, 因此品种鉴定非常重要。
目前, 吴茱萸的鉴定基本上依靠性状特征、
显微判断和理化等手段, 这已不能满足中药材逐步
走向规范化种植(good agricultural practices, GAP)
的需要。近年来, DNA分子标记已成为近缘种或
品种鉴定的发展方向(孔祥彬等2005), 国内扩增片
段长度多态性( a mp l i f i e d f r a gme n t l e ng t h
polymorphism, AFLP)技术的应用已经广泛, 如分析
猕猴桃的种质资源(陈华等2007)和鉴定天麻遗传变
异鉴定(谢渊等 2007)等。因此采用AFLP技术对
吴茱萸鉴定和评价种植资源的遗传多态性, 对于指
导吴茱萸的道地性研究、新品种的选育、种质资
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源研究以及GAP提供分子生物学依据等也均有意
义。
本文采用AFLP技术, 对 19株产于贵州石阡、
铜仁、余庆和陕西西安的不同品种的吴茱萸的遗
传多样性进行了检测, 并对不同来源吴茱萸遗传多样
性和遗传结构、种内居群间的亲缘关系作了分析。
材料与方法
吴茱萸[Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth.]、石
虎[Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth. var. officinalis
(Dode) Huang]及疏毛吴茱萸[Evodia rutaecarpa
(Juss.) Benth. var. bodmieri (Dode) Huang]新鲜叶片
分别采自贵州余庆、贵州石阡、贵州松桃和陕西
西安植物园(表1), 所有样品均经贵阳中医学院中药
研究所何顺志先生作过鉴定, 于 -80℃下保存。
基因组DNA提取采用我们实验室建立的改良
CTAB法(冉贵萍等 2007), 模板DNA经A260/A280测
定、琼脂糖凝胶电泳检测合格后, 调整浓度为 300
ng·µL-1, 置于-20℃贮存备用。
AFLP实验方法参照本实验室建立的优化的
AFLP体系和方法(冉贵萍等 2008), 反应体系包括
酶切 - 连接、预扩增、选择性扩增、6% 聚丙烯
酰胺凝胶电泳、银染。
内切酶组合为EcoRI+MseI, 从 18对分别延伸
3个碱基的 E/M引物组合中筛选出 3对片段数量
多、清晰度高、片段大小分布均匀的引物组合,
分别为: E-AGC/M-CAG、E-AGC/M-CTG、E-
ACG/M-CTG, AFLP人工接头和引物序列(表2)均由
上海生物工程公司合成。选择性扩增产物与上样
缓冲液混合, 于 95℃下变性 10 min, 然后迅速放置
冰浴中, 以6%的变性聚丙烯酰胺凝胶功率为80 W
预电泳 40 min, 再以功率为 60 W电泳 1.5 h, 最后
用银染检测。
表 1 实验采集的吴茱萸品种和产地
Table 1 Cultivars and origins of E. rutaecarpa
used in the experiment
编号 品种 产地
1 石虎 200701 贵州余庆种植基地
2 石虎 200702 贵州余庆种植基地
3 石虎 200703 贵州余庆种植基地
4 石虎 200704 贵州余庆种植基地
5 石虎 200705 贵州石阡种植基地
6 石虎 200706 贵州石阡种植基地
7 石虎 200707 贵州石阡种植基地
8 石虎 200708 贵州石阡种植基地
9 疏毛 200701 贵州余庆种植基地
1 0 疏毛 200702 贵州余庆种植基地
1 1 疏毛 200703 贵州余庆种植基地
1 2 疏毛 200704 贵州余庆种植基地
1 3 疏毛 200705 贵州松桃种植基地
1 4 疏毛 200706 贵州松桃种植基地
1 5 疏毛 200707 贵州松桃种植基地
1 6 疏毛 200708 贵州松桃种植基地
1 7 疏毛 200709 贵州松桃种植基地
1 8 吴茱萸 200701 贵州余庆种植基地
1 9 吴茱萸 200702 陕西西安种植基地
表 2 人工接头和AFLP引物序列
Table 2 DNA adapter and AFLP primer sequences
引物 序列
EcoRI接头 5 CTCGTAGACTGCGTACC 3
5 AATTGGTACGCAGTCTAC 3
MseI接头 5 GACGATGAGTCCTGAG 3
5 TACTCAGGACTCAT 3
E 5 GACTGCGTACCAATTC 3
E-AAC 5 GACTGCGTACCAATTCAAC 3
E-AGC 5 GACTGCGTACCAATTCAGC 3
E-ACG 5 GACTGCGTACCAATTCACG 3
M 5 GATGAGTCCTGAGTAA 3
M-CAG 5 GATGAGTCCTGAGTAACAG 3
M-CAC 5 GATGAGTCCTGAGTAACAC 3
M-CTG 5 GATGAGTCCTGAGTAACTG 3
M-CTA 5 GATGAGTCCTGAGTAACTA 3
M-CCT 5 GATGAGTCCTGAGTAACCT 3
M-CAT 5 GATGAGTCCTGAGTAACAT 3
记录标准写在相同迁移率上, 有带记为 1, 无
带记为 0, 转换成 01距阵, 只记录清晰易辨的扩增
带, 统计每个引物扩增出的总带数和其中的多态性
带数。将优选的3对引物产生的AFLP扩增带数据
输入到数据矩阵, 在NTSYS-PC Version 2.0统计分
析软件系统中, 按Nei和Li (1979)的方法计算AFLP
扩增片段的遗传相似系数(GS)和遗传距离(GD)。
计算公式为GSij=2a/(2a+b+c), GD=1-GS, 其中 a为
材料 i和 j共有的扩增带数目; b为材料 i有而材料
j中缺失的扩增带数目; c为材料j中有而材料 i中没
有的扩增带数目。根据遗传相似系数(GS)按非加
权配对法(UPGMA), 进行 SAHN (Rohlf 2000)聚类
分析。
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实验结果
1 提取的吴茱萸基因组DNA质量
用改进的 CTAB法提取植物基因组DNA, 纯
度较高, 能满足AFLP分析的要求(电泳图未列出)。
2 不同品种吴茱萸的AFLP指纹图谱
采用优化筛选出的 3对引物组合(E-AGC/M-
CAG、E-AGC/M-CTG、E-ACG/M-CTG)对 19株
吴茱萸进行AFLP分析, 共扩增出93条清晰可辨条
带, 其中 57条具有多态性, 比例为 61.3%, 平均每
个引物扩增出 31条带, 片段大小在 150~2 200 bp。
AFLP图可分为 3个区域: I区大片段区, 分布范围为
1 000~1 500 bp, 该区多态性较强; II区为 400~
1 000 bp, 该区多态性最强, 条带清晰度最高; III区
为 200~400 bp, 该区多态性最低。3对引物对 19
株吴茱萸进行选扩获得36条共有条带, 这可能是吴
茱萸的基本带, 可提供作为制定吴茱萸标准指纹图
谱的分子标记的依据。来自不同种植地的同一品
种条带也存在差异, 在一定程度上也反映出遗传背
景不同。用引物 E-AGC/M-CTG对 19株吴茱萸分
析的AFLP指纹图谱(图 1)。
图 1 19株吴茱萸 E-AGC/M-CTG引物的AFLP指纹图谱
Fig.1 AFLP fingerprint of 19 E. rutaecarpa by E-AGC/M-CTG primer pairs
图中编号同表 1。
表 3 吴茱萸、石虎和疏毛吴茱萸的引物组合
E-AGC/M-CTG的AFLP指纹谱带
Table 3 AFLP fingerprint of E. rutaecarpa, E. rutaecarpa var.
officinalis and E. rutaecarpa var. bodmieri
by E-AGC/M-CTG
品种 带型
石虎 200701 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1
石虎 200705 1 1 1 1 0 0 1 1 1 1 0 0 0 1 0 0 0
疏毛吴茱萸 200701 1 0 0 0 1 0 1 1 1 1 1 0 1 1 1 1 1
疏毛吴茱萸 200705 1 0 1 1 1 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 0 1
吴茱萸 200701 0 1 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 0 1 1 1 1
吴茱萸 200702 0 1 0 0 0 1 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1 1
3 同一品种吴茱萸的AFLP条带差异
不同地区的同一品种的吴茱萸的有效成分有
差别, 这是吴茱萸道地性的表现。我们分析余庆和
石阡地区的石虎、余庆和松桃地区的疏毛、余庆
和西安的大花吴茱萸的DNA指纹谱带, 并作比较的
结果(表 3)表明, 同一品种在DNA水平上也表现出
地域间的差异。
4 19株吴茱萸的聚类分析
根据 3对AFLP引物组合产生的多态性数据,
用Nei和Li遗传相似系数(GS)计算方法计算得到的
19份材料间的遗传距离(GD)范围为 0.059~0.765,
提示吴茱萸种质资源间的遗传多态性丰富, 品种间
遗传关系复杂。分析 19份不同产地的吴茱萸种质
资源的AFLP分子标记结果进行聚类的结果(图 2)
表明, 在 0.48的相似水平上, 聚类图将 19份材料
分为 2大群。类群 I: 除石虎 200704外, 所有来自
余庆地区的种质材料; 类群 II: 来自石阡、松桃、
西安的材料。聚类结果表明, 余庆地区种植基地的
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遗传资源具有较高的稳定性和一致性。在 0.60的
相似水平上, 类群Ⅱ又被分为3个亚群。亚群1: 包
括石虎 200704、吴茱萸 200701、吴茱萸 200702。
石虎 200704与吴茱萸 200701、吴茱萸 200702具
有较近的遗传关系, 我们推测石虎200704可能是石
虎中的一个变种, 值得进一步研究。亚群 2: 包括
石虎 200705、石虎 200706、石虎 200707、石虎
200708。这四株材料均是石阡的石虎品种。亚群
3: 包括疏毛吴茱萸 200706、疏毛吴茱萸 200707、
疏毛吴茱萸 200708、疏毛吴茱萸 200709。这四
株均为松桃地区的疏毛吴茱萸品种。二级类群划
分与传统分类法基本一致。
图 2 19株吴茱萸的聚类分析树状图
Fig.2 Dendrogram of 19 E. rutaecarpa by AFLP
讨　　论
采用 3对引物对 19株吴茱萸种质资源进行
AFLP分析, 共扩增出93条带, 其中多态性带57条,
多态性条带占总扩增条带的比例为 61.3%, 说明在
所测的位点中有 61.3%的位点(DNA一级结构)不
同材料间存在着相当大的差异, 19份材料间的遗传
距离为0.059~0.765, 这显示吴茱萸种质资源间的遗
传多态性丰富, 品种间遗传关系复杂。石虎和疏毛
吴茱萸是小花吴茱萸中的两个品种, 含有较高的吴
茱萸碱和吴茱萸次碱, 药用价值高, 是商品药材中的
主流品种, 从外观上看不易区分。但从AFLP电泳
图谱来看, 二者间具有特征性的差异DNA条带, 因
此认为, 采用AFLP-DNA指纹数据能灵敏地鉴别出
相似的品种, 但由于DNA指纹图谱技术有高度的个
体特异性和庞大的数据含量, 因此, 不能单纯依靠
基因组中的微小变异进行鉴别, 还需结合传统的形
态学观察和理化方法, 才能确定优良品种的特异性
分子标记。
从聚类分析图中可以得出一些大致的规律: (1)
品种的亲缘关系与地域分布有一定的相关性。如
除石虎200704外, 所有来自余庆地区的材料划为一
类群, 显示吴茱萸的生长受地域、气候、遗传的
综合影响, 表现出一定的道地性。(2)品种的遗传规
律与其表现性状有一定的相关性。如二级分类中,
大花吴茱萸划为为一亚群, 该品种以栽培为主, 果
实粒大, 其性状明显区分于小花吴茱萸。同时石虎
和疏毛吴茱萸各为一亚群, 说明AFLP聚类分析与
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按传统的表型性状分类基本一致。另外, 不同种植
地的同一品种吴茱萸在其AFLP指纹图谱条带上也
存在着差异, 这可能反映出多态性受地域分布和遗
传背景等的影响。
总之, 本文以3对引物, 检测到丰富的AFLP片
段多态性, 可以很好地反映出品种间的遗传差异, 通
过构建系统发育树将19份样品鉴别开, 并初步探索
了吴茱萸种植资源间的遗传规律。由于大花吴茱
萸所含的化学成分与小花吴茱萸差异较大, 能否将
理化成分与DNA指纹图谱之间建立起关系, 尚待进
一步研究。
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