全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第5期，2006年10月826
石刁柏胚性细胞诱导过程中的内源激素和多胺含量变化
陈小飞 萧浪涛* 鲁旭东 童建华
湖南农业大学湖南省植物激素与生长发育重点实验室，长沙410128
提要 用高效液相色谱法分析石刁柏愈伤组织胚性细胞诱导过程中不同时期内源激素和多胺含量的结果表明，在胚性细
胞诱导过程中，Put 和 GA3 一直呈上升趋势，胚性细胞出现时，IAA、Put 和 GA3 含量都达到最高水平，显示高含量的IAA
以及高比例的 Put/(Spd+Spm)可能有利于胚性细胞的形成。
关键词 石刁柏；胚性细胞；内源激素；内源多胺
Changes in Endogenous Phytohormone and Polyamine Contents during Em-
bryogenic Cells Induction of Asparagus officinalis L.
CHEN Xiao-Fei, XIAO Lang-Tao*, LU Xu-Dong, TONG Jiang-Hua
Hunan Provincial Key Laboratory of Phytohormones and Development, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China
Abstract The changes in endogenous phytohormone and polyamine contents during embryogenic cells induc-
tion of Asparagus officinalis L. were analyzed by HPLC. The results showed that Put and GA3 contents in-
creased during embryogenic cells induction. IAA, Put and GA3 contents reached the highest level when em-
bryogenic cells began to appear. It indicated that the high level of IAA and high ratio of Put/(Spd+Spm) were
maybe advantageous to embryogenic cells induction of A. officinalis.
Key words Asparagus officinalis L.; embryogenic cell; endogenous phytohormone; endogenous polyamine
收稿 2006-04-29 修定 　2006-08-21
资助 国家自然科学基金(30540019)和教育部留学生基金(教
外司 1999363)。
*通讯作者(E-mail: ltxiao@hunau.net, Tel: 0731-4635259-
800 1)。
体细胞胚胎发生过程可分为胚性细胞诱导和
胚胎发育 2 个阶段，前者是体细胞胚发生过程中
的关键步骤，胚性愈伤组织质量高低直接影响体
胚发生发育状况(陈以峰等1998)。胚性愈伤组织
也是种质资源离体保存、外源基因转化以及体细
胞融合的理想材料。植物激素的调节作用是体细
胞胚胎发生过程中最重要的因素，一般认为生长
素是诱导体细胞胚发生的关键因素，内源 IAA 含
量上升或维持在较高水平可能是胚性细胞出现的一
个共同标志，但也有与此观点不同的报道
(Auborio等 1989；王丽等1998)。多胺能促进植
物细胞生长、分化和增殖，并参与胚胎发育、花
芽分化、延缓衰老等生命活动(Walden 等 1997；
Wallace等2003)。关于离体培养中内源激素和多
胺含量变化的研究较多(张木清和余松烈1996；田
长恩 1992；黄学林和李筱菊 1995；林红和程井
辰1991；崔凯荣和刑更生2000)，但在胚性细胞
诱导过程中将激素和多胺结合起来考虑的报道尚
少。本文以石刁柏(Asparagus officnalis L.)
‘UC800’ 为材料，用高效液相色谱(HPLC)分析了
胚性细胞诱导过程中内源脱落酸(ABA)、玉米素
(ZT)、吲哚乙酸(IAA)、赤霉素3 (GA3)和内源腐
胺(Put)、亚精胺(Spd)、精胺(Spm)的含量变化。
材料与方法
外植体为长 10 cm 左右的石刁柏 ‘UC800’
(Asparagus officnalis L. cv. UC800)嫩茎，经0.1%
升汞消毒8~10 min，无菌水洗后切成切段，接种
在MS+1 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 6-BA+2 mg·L-1 2,4-
D 培养基上(MS 培养基加 3% 蔗糖、0.8% 琼脂，
pH 5.8，下同)，于 40 mmol·m-2·s-1光照下培养诱
导初始愈伤组织，每日光照时间 16~18 h。25 d
左右，转入MS+0.5 mg·L-1 NAA+10 mg·L-1 2,4-D
培养基上继续培养。分别在接种0、10、25、35、
70和 85 d 取材测定。外植体用接种0 d 表示。
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内源激素的提取纯化参照王若仲等(2002)的方
法。多胺的提取和处理参照Flore和Galston (1982)
的方法。内源激素和内源多胺测定均用 HPLC 分
析。内源激素测定以乙腈、三乙胺和超纯水为流
动相，恒流1 mL·min-1，检测波长为254 nm (ZT、
ABA)或 270 nm (IAA、GA3)，柱温 35℃。内源
多胺测定以甲醇:水(V/V=64:36)为流动相。检测波
长为 230 nm，流速 0.7 mL·min-1，柱温 30℃。
实验结果
1 石刁柏愈伤组织诱导胚性细胞
接种3 d的外植体两端开始膨大，10 d的茎
切段两端开始有绿色愈伤组织出现，25 d左右时
形成大量致密、坚硬、表面光滑的愈伤组织，此
时将愈伤组织转入胚性愈伤组织诱导培养基上，
第 70 天开始有胚性细胞形成，第 85 天左右有较
多的胚性细胞形成(图 1)。
2 石刁柏胚性细胞诱导过程中的内源激素含量变化
如图2 所示，4 种激素中的 ZT 和 GA3 含量较
高，ABA 和 IAA 水平相对较低。诱导后不同阶段
的激素水平也有差异。在整个诱导过程中，ABA
和 ZT 水平变化幅度不大，ZT 在转入胚性细胞诱
导培养基上10 d后(第35天)达到顶峰，其后各阶
段都比这一时期低。ABA 则在胚性细胞开始出现
时(第70天)达到最高峰。在整个诱导过程中，IAA
和 GA3 有相似的变化趋势，即胚性细胞诱导阶段
(35~85 d)明显高于初始愈伤组织诱导阶段(0~25
d)，第 70 天达到最大值，之后略低于这一水平。
70 d时，IAA和GA3比25 d时的分别高出147.23%
和 107.709%；此时，胚性细胞开始出现，说明
IAA 和 GA 3 含量的增加与胚性细胞的出现有关。
IAA 在初始愈伤组织形成过程中一直保持较低水
平，转入诱导培养基上10 d后(第35天)即迅速上
升，直至胚性细胞出现。
图1 石刁柏胚性细胞诱导过程
Fig.1 Embryonic cells induction of A. officnalis
a: 外植体开始产生愈伤组织; b: 愈伤组织大量形成; c: 胚性愈伤组织开始形成; d: 较多胚性愈伤组织形成。
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3 石刁柏胚性细胞形成过程中的多胺含量变化
如图3 所示，愈伤组织胚性细胞诱导的不同
时期，Put 和 Spd 含量都高于Spm，Put 占的比例
最大，Put 变化趋势决定总多胺的变化趋势。从
接种开始到愈伤组织胚性细胞出现，Put含量一直
呈上升的趋势，尤其是在愈伤组织转入诱导培养
基后几乎呈直线上升，在胚性细胞开始出现(70 d)
时达到最高[613.46 nmol·g-1 (FW)]，一直持续到
大量胚性细胞产生时(85 d)，仍保持在589.14 nmol·
g-1 (FW)的水平。从外植体接种直至 35 d，Spd
水平一直下降，接种3 d内降幅最大，3~35 d期
间都是缓慢下降，胚性细胞出现时略有回升。35 d
后 Spm水平一直低于25 d前的水平，胚性细胞出
现时最低，这暗示低水平的 Spm 可能有利于愈伤
组织胚性细胞出现。在愈伤组织胚性细胞诱导过
程中，3种多胺比值[Put/(Spd+Spm)]一直呈不断
上升趋势，25~35 d 时的上升幅度最大(超过 3
倍)，70 d时的比值为25 d的3.082倍。 　
讨 论
细胞胚性能力的获得主要取决于细胞的分
化，而细胞分化是细胞内原有信息清除或更变的
结果。紫花苜蓿脱分化的细胞只需用NAA 和 2,4-
D短时间刺激(几分钟)即可进行胚胎发育(Pasternak
等2002)。2,4-D普遍都被看作是诱导胚性的有效
物。前人在水稻中的研究结果表明，水稻胚性细
胞出现与 IAA 有直接关系，愈伤组织中积累较多
的IAA是胚性细胞形成的一个必需条件(陈以峰等
1998)。石刁柏愈伤组织胚性细胞出现时 GA3 和
IAA 都保持在一个相对高的水平，而且 IAA 在愈
伤组织转入高浓度2,4-D (10 mg·L-1)的培养基上
10 d后(即培养全程的第35天)即升高，显示2,4-
D 是诱导细胞转变成胚性细胞的有效因子。至于
其作用的机制，有不同的说法：有人认为是通过
改变内源IAA起作用(邢更妹等2002)，也有人认
为是影响IAA结合蛋白起作用的(Nag等2001)。从
本文结果来看，前一个说法的可能性较大。但2,4-
D 究竟是如何作用的，尚待进一步研究。诱导胚
性愈伤组织用高浓度的2,4-D (10 mg·L-1，一般为
2.2 mg·L-1以下)，这在文献中较少报道。Pasternak
(2002)等发现，紫花苜蓿原生质体在不同浓度2,4-
D的培养基上会分化成形态和大小等特征不同的胚
图2 石刁柏胚性细胞诱导过程中内源激素含量变化
Fig.2 Changes in endogenous phytohormones contents during embryogenic cells induction of A. officinalis
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性和非胚性细胞，而且在培养 4~5 d 时，原生质
体内源 IAA 水平都出现瞬时上升，但具有胚性特
征的细胞其IAA 峰要出现早些。关于GA3 的作用，
目前研究得较清楚的是促进植物茎和叶生长、解
除种子和块茎等的休眠、促进萌发等。最近，
Asahina 等(2002)发现，子叶产生的GA3 是黄瓜、
马铃薯胚轴切割后重新形成组织时细胞分裂所必需
的。本文中，GA3 含量从培养开始到胚性细胞大
量出现一直呈增加趋势(图2)，显示GA3可能参与
细胞的分裂和增殖。
多胺也参与植物细胞增殖和分化调控(王丽等
1998；Walden 等 1997；Wallace 等 2003)，调节
细胞增殖的多胺主要是Put。有报道显示，Put是
通过调节细胞周期影响细胞增殖的，主要作用在
G1到S期(Maki等1991)。据邢更妹等(2002)报道，
枸杞继代的愈伤组织开始启动分化时，Put含量即
迅速上升，并形成第1个峰值(为对照的3倍)，胚
性愈伤组织形成期 Put 含量也维持较高水平，因
而他们认为此时Put含量升高与细胞启动分化和胚
性细胞形成有关。本文结果也表明，在诱导石刁
柏胚性细胞过程中，愈伤组织转入诱导培养基上
后 Put 含量即剧增，胚性细胞形成的整个过程均
保持高水平，而 Spd 和 Spm 则是低水平。胡萝卜
胚胎发生过程细胞转入胚性培养基上也表现出类似
的结果(Montague 等 1978)，说明高比例的Put/
(Spd+Spm)有利于胚性细胞的形成。
S-腺苷蛋硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)
是乙烯和多胺合成共同的前体，合成的酶分别是
1-氨基环丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-car-
boxylic acid, ACC)和氨基氧化乙酸(aminooxyacetic
acid, AOA)。在燕麦叶片和黑松体胚发育过程中，
A B A 通过减少 A C C 酶合成来调节乙烯形成( E l
Meskaoui 和 Tremblay 2001)。ACC 合成减少后，
细胞内的SAM转向 Put合成，因此Put水平增高。
本文结果显示，在愈伤组织转入胚性细胞诱导培
养基上后，ABA 和 Put 两者的变化趋势一致(图 2
和 3)，说明可能与此也有关。当然，Put 呈直线
上升的趋势，也可能与分解代谢变弱或是转化成
Spd 的量减少有关(图 3)。但前人大多认为内源
IAA和Put两者可能起协同效应(Tiburiso等1989；
图3 石刁柏胚性细胞诱导过程中的内源多胺含量变化
Fig.3 Changes in endogenous polyamine contents during embryogenic cells induction in A. officinalis
植物生理学通讯 第42卷 第5期，2006年10月830
邢更妹等 2002)。本文结果也表明，在诱导石刁
柏胚性愈伤组织过程中Put和IAA的变化趋势类似
(图 2和 3)，也说明Put和 IAA有协同效应。但其
间具体机制待进一步研究。
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