全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 4期，2008年 8月 693
苦瓜中与AGAMOUS相似基因启动子的克隆和表达载体的构建
彭书明 1,2, 雷泞菲 1,2, 陈放 1, 唐琳 1,*
1四川大学生命科学学院, 成都 610064; 2成都理工大学材料与化学化工学院, 成都 610059
提要: McAG2基因是苦瓜中分离得到的与AGAMOUS相似基因, 在花器官和果实中特异表达, 参与花的第三轮和第四轮器
官的形成。文章采用染色体DNA步移技术克隆得到长为 1 417 bp的McAG2基因 5 上游片段。序列分析显示此片段含有
典型的 TATA-box、CAAT-box、丰富的激素应答调控元件。为了研究这些调控元件, 还构建了McAG2基因 5 侧翼缺失和
内含子缺失表达载体。
关键词: 苦瓜; AGAMOUS相似基因; 启动子; 载体构建
Cloning of an AGAMOUS-like Gene Promoter from Momordica charantia L.
and Construction of Expression Vector
PENG Shu-Ming1,2, LEI Ning-Fei1,2, CHEN Fang1, TANG Lin1,*
1College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, China; 2College of Materials and Chemistry and Chemical Engineering,
Chengdu University of Technology, Chengdu 610059, China
Abstract: McAG2 gene is an AGAMOUS-like gene, which was cloned from Momordica charantia. It especially
expressed in floral organ and young fruit and had a crucial role in the third and fourth whorl floral organ
development. The 1 417 bp 5 up stream region of the McAG2 gene was isolated by the DNA walking technology.
Sequence analysis reveals that it contains classical TATA-box, CAAT-box, which are conserved in eukaryotic
gene promoters, and other regulation elements regarding to hormones. For further study on those regulator
elements, the vectors were constructed with the deletion in the 5 region and intron of McAG2.
Key words: Momordica charantia; AGAMOUS-like gene; promoter; vector construction
收稿 2008-04-22 修定 2008-07-14
资助 教育部博士点基金(2 00 206 10 88 )。
* 通讯作者(E-ma i l : t a n gl in@ scu . edu .c n; T e l : 0 2 8 -
8 5 4 1 7 2 8 1 )。
MADS-box基因是一类转录因子, 控制植物发
育过程。根据拟南芥和金鱼草研究中的结果, Coen
和Meyerowitz (1991)以及Weigel和Meyerowitz
(1994)提出了花发育的ABC模型, 后来又在矮牵牛
花和拟南芥中发现了D功能基因(Colombo等1995)
和 E功能基因(Becker和 Theiβen 2003), 花发育的
ABC模型进一步发展为 ABCE模型(Colombo等
1995)。AGAMOUS基因就是最早从模式植物拟南
芥中克隆得到的C功能基因, 它在花发育过程中的
性别器官形成中起作用(Bowman等 1989), 参与花
的第三轮和第四轮器官形成。近年来, 大量与
AGAMOUS相似基因被克隆, 它们的功能研究已较
为深入, 但其转录调控的研究则相对较少。据报
道, 与 AGAMOUS相似的基因在基因组DNA中含
有不同数目的内含子, 最多达 8个。这些内含子长
短不一, 内含子1一般都在5 端非翻译区(Yanofsky
等 1990; Bradley等 1993; Savidge等 1995; Rutledge
等 1998; Davies等 1999; Brunner等 2000); 内含子
2最长, 达 3~5 kb。AGAMOUS基因内含子 2含有
LEAFY 蛋白结合相关的增强序列, 其转录需要
LEAFY蛋白结合在内含子 2上(Busch等 1999),
Hong等(2003)的研究也证实内含子 2具有转录调
控元件。而对于 5 非翻译区内的内含子和其他内
含子, 以及基因上游序列的调控的研究很少(de
Folter和Angenent 2006)。因此, 本文在苦瓜中得
到与AGAMOUS相似基因的全长 cDNA序列(命名
为McAG2, GenBank登录号为DQ299943)的基础上
(Peng等 2008) , 采用 DNA 步移技术克隆得到
McAG2基因上游调控序列, 为深入研究苦瓜McAG2
基因的表达建立了基础。
材料与方法
苦瓜(Momordica charantia L.)品种 ‘长白 ’种
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植于四川大学生命科学学院药用植物园。大肠杆
菌(Escherichia coli) Top10由实验室保存。测序
和亚克隆 pMD18-T载体购自宝生物工程(大连)有
限公司。植物原生质体瞬时表达载体 pBI221由四
川大学杨毅先生惠赠。
小量胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有
限公司, H. Q. & Q.质粒小量提取试剂盒购自安徽
优晶生物工程有限公司。TaKaRa Ex TaqTM, T4
DNA 连接酶, 各种 DN A 限制性内切酶 Dr a I、
Ec oRV、Pv u I、St u I 等均购自 Ta KaR a 公司;
Tryptone和Yeast Extract为OXOID产品; 琼脂糖、
琼脂粉、Tris、SDS为 Amersham产品; 氨卞青
霉素购自TaKaRa公司; IPTG、X-gal为Fluka公司
产品; 其他化学药品为进口或国产分析纯试剂。
苦瓜总DNA的大量提取采用CTAB方法(略有
修改) (Doyle和 Doyle 1987)。DNA经 RNase
(DNase free)除去其中的 RNA后储存于-20 ℃中
备用。
基因组 D N A 步移文库的构建参照 B D
GenomeWalkerTM Universal Kit中的方法进行。基
因组DNA分别采用DraI、EcoRV、PvuI和 StuI
平末端酶酶切, 酶切产物与接头连接, 构建了 4个
基因组步移文库。
苦瓜McAG2基因启动子克隆分 2轮。第一轮
PCR反应: 在4个0.5 mL的EP管(C1~C4)中分别以
构建好的DNA文库(DL1、DL2、DL3和DL4)为
模板, 以基因特异引物SP1 (5 GGCTGGAGAAAAC-
GATGAGAGCAACCT 3)和接头引物 AP1 (5
GTAATACGACTCACTATAGGGC 3)在PTC-100TM
(MJ)热循环仪上进行PCR反应。反应程序为: 95 ℃
预变性 5 min; 随后紧接着 30个循环为 94 ℃ 30 s,
62 ℃ 30 s, 72 ℃ 3 min; 然后, 72 ℃ 保温 7 min。反
应完成后, 将上述4管PCR产物稀释10倍(D1~D4)
用于第二轮 PCR扩增。第二轮 PCR反应: 以基因
特异引物SP2 (5 TTGAGCAGCCCATTGCGTCTCT-
TACAG 3)和接头引物AP2 (5 ACTATAGGGCA-
CGCGTGGT 3)进行 PCR扩增, 反应程序同上, 仅
改变循环数为 35次。所得 PCR产物经 1%琼脂糖
凝胶电泳检测, 产物胶回收、连接和转化, 验证后
送北京三博生物技术公司测序。
为进一步研究McAG2基因启动子可能的转录
调控元件和McAG2基因的转录起始位点至翻译起
始位点之间的内含子的调控作用, 分别对McAG2
启动子序列进行 5侧翼缺失和 5上游ATG转录翻
译起始位点和转录起始位点之间的缺失。构建缺
失表达载体所需引物序列见表 1, 相应的引物位置
表 1 启动子缺失表达载体引物
Table 1 Primers of expression vectors with deleted promoter
上游引物(下划线示 PstI酶切位点) 下游引物(下划线示 BamHI酶切位点)
PFa: 5 TTCTGCAGTTTAAATGTCGAGTGAC 3 PRa: 5 GCAGGATCCTTTCTTCTTGATTCTGGA 3
PFb: 5 GTACTGCAGGGCTGAGGATGCTTCTAT 3 PRb: 5 GCAGGATCCGATATGTAGAGAAAGATGG 3
PFc: 5 GGGCTGCAGGTATTTGAACATATACAT 3 PRc: 5 GAGGATCCGGAAGGTAGCTAAAAGGTG 3
PFd: 5 GGCCTGCAGATGGATTCTTACATCTTTA 3
PFe: 5 GATCTGCAGTCCATTTCCCTCTTCTCCT 3
见图2。
制备缺失片段时, 分别以下列引物对扩增缺
失片段: P1 (PFa和 PRa)、P2 (PFa和 PRc)、P3
(PFb和 PRc)、P4 (PFb和 PRb)、P5 (PFb和
PRa)、P6 (PFc和 PRa)、P7 (PFd和 PRa)、P8
(PFe和 PRa)。然后将上面获得缺失片段定向插
入 pBI221载体上, 取代原有的CaMV 35S启动子,
然后转化大肠杆菌, 经酶切和测序确定载体构建的
正确性。
结果与讨论
1 苦瓜McAG2基因启动子片段的克隆
用染色体DNA步移技术, 从步移文库DL3中
克隆得到长1 300 bp左右的片段(图1-a), 该片段长
1 305 bp, 与McAG2基因的 5端部分片段重合。
根据测序结果, 在新得到片段 5端设计了 2条特异
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引物SP3 (5 TGTGAGTGGTGACTGTTAAGGTTTG
3)和SP4 (5 GACAGGGATGTTGGAATAAGTTGCA
3), 从步移文库DL3又扩增得到约 600 bp的片段,
除去重叠部分得到了约 290 bp (图 1-b)的片段。经
过2轮DNA步移技术, 总共克隆得到长约1 417 bp
片段, 是苦瓜McAG2基因起始密码子ATG上游区
域, 提交GenBank的登录号为 EU586159。
2 苦瓜McAG2基因 5上游调控序列的功能元件
分析
将克隆得到的序列与McAG2基因的cDNA比
对的结果显示, McAG2基因上游序列+147~+447之
间存有一长为 300 bp的内含子, 其拼接点是 5端
的GT (+146~+147), 3端的AG (+448~+449), 为典
型的内含子拼接点。采用 PLAC E 网站(h t tp: / /
www.dna.affrc.go.jp/PLACE)和Neural Network Pro-
moter Prediction软件对克隆的苦瓜启动子进行了分
析, 结果显示在 +1处 C为可能的转录起始密码子
(图 2)。预测转录起始位点上游-30 bp和-488 bp
处有 2个 TATA-box, 另外还含有 7个 CAAT盒
(-139、-395、-401、-576、-665、-677、-923)。
除此之外, 还有一些其他调控元件: 如茁壮素应答
元件(306~314, KGTCCCAT)、促细胞分裂素蛋白
结合元件(- 5 3 1 ~- 5 2 5、- 1 7 ~- 1 1、8 5 ~ 9 1 ,
TATTAG)、赤霉素应答顺式作用元件(-348~-342,
CCTTTT)和赤霉素应答复合体中心元件(-136~
-129, TAACAAA)等, 这些元件都和激素相关, 说明
这段序列的启动活性很可能受激素调控。在
McAG2基因启动子(McAG2P)中还有大量的重复序
列, 包括间隔重复序列: AAAAAT (-857~-851、
-850~-844、168~174、378~384、385~391)、
TGATAAAG (-505~-497、-56~-48)、TTCAAAA
(-640~-633、-629~-622)、TCCCTC (8~14、
20~26)、AAAATG (-849~-843、-822~-816、
372~378、379~385、386~394); 连续重复序列:
GTATG (-801~-791)、GGAAA (-261~-251)、
GATTT (429~439)、AAAATGA (372~393); 简单连
续重复: TG (49~55)、AG (-539~-531)、TCC
(110~119); 还有一个互补序列: TGTTTAAACA
(-651~-641); 并存在 TC富含区(-349~-331、
6~30)和 AG富含区(如: -917~-889)。由此可见,
McAG2基因上游片段包含典型的TATA盒、CAAT
盒及其丰富的调控元件和多种重复序列。因此认
为, McAG2P对McAG2基因的表达有调控作用和
启动子活性。
3 McAG2基因启动子缺失表达载体构建和酶切鉴定
为了进一步研究这些预测的元件、重复序列
等, 又做了以下实验。以 PFa及 PRa引物对, 以苦
瓜幼叶中总DNA为模板扩增全长McAG2P片段。
经亚克隆测序确定正确无误后, 以之为模板, 克隆
其他缺失片段。再将 PCR扩增得到的 8条长度不
等的缺失片段(P1, 1 417 bp; P2, 937 bp; P3, 792 bp;
P4, 1 120 bp; P5, 1 270 bp; P6, 1 100 bp; P7, 716 bp;
图 1 McAG2基因启动子的克隆
Fig.1 Cloning of McAG2 gene promoter
a: 第一轮 2次扩增产物; b: 第二轮 2次扩增产物。M: 分子量标记 DL2000; DL1: PvuI酶切文库; DL2: EcoRV酶切文库; DL3:
DraI酶切文库; DL4: StuI酶切文库。
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P8, 476 bp)用 PstI和 BamHI双酶切定向插入质粒
pBI221中, 构建了8个由McAG2P1~P8驱动报告基
因GUS的植物表达载体(图 3)。将构建好的瞬时表
图 2 McAG2基因启动子序列
Fig.2 The promoter sequence of McAG2 gene
加框粗黑体为转录起始和翻译起始位点; 阴影为 TATA-box和 CAAT-box; 阴影加下划线为 5 UTR 中的内含子; 箭头为扩增引物。
达载体转化大肠杆菌Top10细胞后, 菌落PCR和质
粒提取酶切验证(图4)得到构建好的McAG2PBI1~8
瞬时表达载体。
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图 3 McAG2Pn::GUS表达载体
Fig.3 Map of McAG2Pn::GUS expression vector
P1~P8: McAG2P缺失片段; 三角形: 预测的转录起始位点; ATG: 翻译起始位点。构建所用载体为 pBI221, 由 35S启动子启动
G U S 报告基因表达。
图 4 McAG2基因启动子缺失表达载体酶切鉴定
Fig.4 Identification of McAG2 gene with promoter deletion
vectors using restriction digestion method
M: DNA分子量标记DL15000; 1~8: McAG2P1~P8缺失表
达载体用 PstI和 BamHI双酶切鉴定, 泳道中大片段为载体DNA,
小片段为插入的缺失启动子 D N A。
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