全 文 ：植物生理学通讯 第41卷 第6期，2005年12月 741
诱导二倍体和同源四倍体白菜细胞质雄性不育系不定芽培养基的筛选
孙敏红 张蜀宁* 邓云
南京农业大学蔬菜研究所，南京210095
提要 以二倍体和四倍体白菜细胞质雄性不育系的子叶为外植体，采用正交设计研究 TDZ (0.1、0.5、1.0 mg·L-1)、NAA
(0.1、0.5、0.8 mg·L-1)和 AgNO3 (0、5、10 mg·L-1)三因素三水平诱导不定芽的结果表明：二倍体的不定芽再生优化培养基
为 MS+1.0 mg·L-1 TDZ+0.8 mg·L-1 NAA+5 mg·L-1 AgNO3 (其再生率为 80.7%)，三因素影响的顺序为: NAA>AgNO3>TDZ；
四倍体的不定芽再生优化培养基为 MS+0.5 mg·L-1 TDZ+0.5 mg·L-1 NAA+10 mg·L-1 AgNO3 (再生率为 83.3%)，三因素影响
的顺序为: AgNO3>NAA>TDZ。后者所需 TDZ/IAA 的比值低于前者。
关键词 白菜；同源四倍体；细胞质雄性不育系(CMS); 正交设计；不定芽诱导
The Selection of the Medium for the Adventitious Shoots Induction of Cyto-
plasmic Male Sterility in Diploid and Autotetraploid Brassica campestris ssp.
chinensis (L.) Makino
SUN Min-Hong, ZHANG Shu-Ning*, DENG Yun
Institute of Vegetable, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract Using cotyledons of cytoplasmic male sterility (CMS) in diploid and autotetraploid Brassica campestris
ssp. chinensis (L.) Makino as explant, the effects of TDZ (0.1, 0.5 and 1.0 mg·L-1), NAA (0.1, 0.5 and 0.8
mg·L-1) and AgNO3 (0, 5.0 and 10.0 mg·L
-1) on adventitious shoot induction were studied by L9(3
4) orthogonal
design. The experimental results showed that the optimal medium for adventitious shoot induction of 2x CMS
was MS+1.0 mg·L-1 TDZ+0.8 mg·L-1 NAA+5.0 mg·L-1 AgNO3, and the frequency of adventitious shoot regen-
eration was 80.7%, the sequence of effecting factors was NAA>AgNO3 >TDZ. The optimal medium of 4x
CMS was MS+0.5 mg·L-1 TDZ+0.5 mg·L-1 NAA+10.0 mg·L-1 AgNO3, and the frequency of adventitious shoot
regeneration was 83.3%, the sequence of effecting factors was AgNO3>NAA>TDZ. The ratio on TDZ/IAA of
autotetraploid was lower than that of diploid.
Key words Brassica campestris ssp. chinensis (L.) Makino; autotetraploid; cytoplasmic male sterility (CMS);
orthogonal design; adventitious shoot induction
收稿 2005-03-15 修定 　 2005-07-07
资助 江苏省“十五”科技攻关项目(BE2001 321-1)。
*通讯作者(E-mail: snzhang@njau.edu.cn，Tel: 025-
84395332)。
白菜又称不结球白菜或小白菜，北方称油
菜。自第 1 个同源四倍体白菜品种 ——“南农矮
脚黄”问世以来[ 1 ]，由于其优质、高产、抗病
和抗逆性强，不仅在国内大面积推广，还引至多
个国家栽培。白菜细胞质雄性不育系(cytoplasmic
male sterility, CMS)在杂种优势利用中是优化的制
种手段，同时也是转基因和生物技术育种的好材
料。同源四倍体白菜 CMS 是我所首次由二倍体白
菜 CMS 直接加倍获得的[2]，它为四倍体杂优利用
开辟了新途径[3]。普通二倍体白菜再生体系研究
已有报道[4~9]，但四倍体白菜 CMS 和二倍体白菜
再生体系的报道尚未见。本文采用正交设计筛选
二倍体和四倍体白菜 CMS 再生的培养基以期能为
基因转化技术和生物技术育种提供参考。
材料与方法
实验白菜[Brassica campestris ssp. chinensis (L.)
Makino]均来自我校我所。2x CMS 为二倍体白菜
Polima CMS (02P秋 -33); 4x CMS为四倍体白菜
Polima CMS (02P秋 -41)。
白菜 2x CMS 和 4x CMS 的种子用70%的酒
精表面消毒 30 s，再用 0.1% 的 HgCl2 溶液消毒
植物生理学通讯 第41卷 第6期，2005年12月742
15 min，无菌水冲洗4~5 次后，接种于1/2MS 培
养基上，放入组培室培养。切下培养 5 d 的无菌
子叶，接种在盛有不同浓度生长调节物质的 M S
分化培养基的三角瓶中，添加 3% 蔗糖、0.8% 琼
脂。放在温度为(25±2)℃、光周期为 12 h·d-1、
光强为50 mmol·m-2·s-1的培养室中培养。每个三角
瓶接 6 个外植体。每个处理接 6 瓶，重复 3 次。
培养 20 d 后，按公式计算：不定芽再生率 =(产
生不定芽的外植体数 / 接种的总外植体数) ×
10 0 % 。
正交实验设计与数理统计参考文献10，设定
TDZ、NAA 和 AgNO3 作为 3 个影响因子，每个因
子取3个水平[11]。选用 L9(34)正交表(表 1)。
将长至1~2 cm 的不定芽转至MS+0.5 mg·L-1
IBA 的生根培养基上进行生根培养，40 d 可得到
组培苗(图1)。组培苗根尖染色体鉴定按文献12和
13的方法并稍有改动。取组培苗根尖用2 mmol·L-1
8-羟基喹啉预处理3 h，蒸馏水冲洗2次后用卡诺
固定液(无水乙醇∶冰醋酸=3∶1)固定20 h，再用
混合酶液(4% 纤维素酶 +1% 果胶酶，pH=4 . 0 )
酶解 30 min。取根尖压片。在Olympus BH-2 光
学显微镜下镜检，观察30个分散良好的细胞，确
定染色体数目。
组培苗移栽在混合营养土中进行驯化。
结果与讨论
1 白菜2x CMS不定芽的诱导
2 x C M S 子叶接种在添加有 TDZ、NA A 和
AgNO3 的 MS 培养基上，12 d 左右其子叶切口处
开始分化，直接形成不定芽(图 2)。以不同浓度
生长调节物质组合诱导2x CMS不定芽的结果(表2)
表明，2x CMS 的不定芽再生优化培养基为配方
9：MS+1.0 mg·L-1 TDZ+0.8 mg·L-1 NAA+5.0 mg·L-1
AgNO3，其再生频率为 80.7%，所需 TDZ/IAA 的
浓度比值为1.25。极差分析(表 2)表明，三因素
的优水平是 A1B3C2 ，但最佳培养基配方并不出现
在所做的 9 个配方中。进一步验证 A1B3C2 的结果
表明，其不定芽的诱导率为 50.0%，比最佳配方
9 的诱导率低。采用正交设计可以减少试验次
数，但由于因素间的互作，正交试验中常出现分
析得到的最佳组合在实验中的表现并不是最好
的[14]。故以9号配方培养基作为2x CMS再生优化
的配方。
极差分析表明，三因子对不定芽诱导的作用
大小依序为：NAA>AgNO3>TDZ (表 2)。进一步
进行方差分析显示，三因素中 NAA 对不定芽诱导
的影响达显著水平，AgNO3 和 TDZ 的影响不显著
(表 3)。
2 白菜4x CMS不定芽的诱导
接种在不同培养基上的4x CMS 子叶 8~10 d
开始分化，子叶切口处直接产生不定芽(图3)。诱
导不定芽的结果(表 4)表明，4x CMS 不定芽再生
表1 L9(34)因素水平
Table 1 Factors and levels of L9(34)
水平 A (TDZ)/mg.L-1 B (NAA)/mg.L-1 C (AgNO3)/mg.L-1
1 0.1 0.1 0
2 0.5 0.5 5.0
3 1.0 0.8 10.0
图1 白菜2x CMS 和4x CMS 的组培苗
Fig.1 Regenerated plants of 2x CMS and 4x CMS
in B. campestris ssp. chinensis
a: 2x CMS；b: 4x CMS。
图2 白菜2x CMS不定芽的诱导
Fig.2 Adventitious shoot induction of 2x CMS
in B. campestris ssp. chinensis
植物生理学通讯 第41卷 第6期，2005年12月 743
优化培养基为配方 5：MS+0.5 mg·L-1 TDZ+0.5
mg·L-1 NAA+10.0 mg·L-1 AgNO3 ，再生频率为83.3%，
再生所需 TDZ/IAA 的浓度比值为 1。极差分析得
到的三因素优水平是 A2B3C3。验证 A2B3C3 试验表
明，不定芽再生率为 62.0%，比配方 5 的不定芽
诱导率低。所以认为配方 5 为最佳配方。
我们以白菜2x CMS 和4x CMS的子叶为材料
筛选不定芽诱导培养基的结果表明，4x CMS的子
叶分化时间(8~10 d)早于2x CMS (12 d)，且4x CMS
不定芽最高诱导率(83.3%)高于 2x CMS (80.7%);
4x CMS所需TDZ/IAA的比值(1.00)小于2x CMS
的(1.25)，这可能与其内源激素含量和细胞分裂
素/生长素比值有关。因为外源激素必须通过对内
源激素的平衡调节而控制器官发生的。这尚需进
一步研究证实。
极差分析显示，TDZ、NAA 和 AgN O 3 对 4x
C M S 的不定芽形成起作用的顺序为：A g N O 3 >
NAA>TDZ (表 4)。进一步进行方差分析的结果表
明，NAA、TDZ 和 AgN O 3 三因素中，AgNO 3 影
响不定芽诱导达显著水平，NAA 和 TDZ 则不显著
(表 5)。
3 组培苗驯化及染色体倍性鉴定
组培苗驯化得到小植株(图 4)。4x CMS 植株
(图 4-b)的叶片为近圆形、叶片厚且颜色深；2x
CMS (图 4-a)叶片为卵圆，叶片薄且色浅。染色
表2 正交设计2x CMS诱导不定芽的再生率
Table 2 Frequency of adventitious shoot regeneration
of 2x CMS designed by orthogonal
编号 A (TDZ)/ B (NAA)/ C (AgNO3)/ 不定芽再生率/ mg·L-1 mg·L-1 mg·L-1 %
1 1(0.1) 1(0.1) 1(0) 33.3
2 1(0.1) 2(0.5) 2(5.0) 37.5
3 1(0.1) 3(0.8) 3(10.0) 50.0
4 2(0.5) 1(0.1) 2(5.0) 25.0
5 2(0.5) 2(0.5) 3(10.0) 33.3
6 2(0.5) 3(0.8) 1(0) 58.6
7 3(1.0) 1(0.1) 3(10.0) 16.7
8 3(1.0) 2(0.5) 1(0) 16.7
9 3(1.0) 3(0.8) 2(5.0) 80.7
K 1 120.8 75.0 108.0
K 2 116.7 87.5 143.2
K 3 114.1 189.3 100.0 T=351.6
优水平 A 1 B 3 C 2
R 2.2 38.1 18.5
　　表中浓度按L9(34)正交表排列，数据为3 次重复的平均值。
表3 2x CMS正交设计方差分析
Table 3 Variety analysis of orthogonal design of 2x CMS
方差来源 SS df M S F F0.05 F0.01
A D 7.5 2 3.8 0.03
B 2620.4 2 1310.2 9.84*
C 348.6 2 174.3 1.31 6.94 18.0
误差e 525.2 2 262.6
误差eD 532.7 4 133.2
总和 3183 8
　　* 为 0.05 水平上显著。
表4 正交设计4x CMS诱导不定芽的再生率
Table 4 Frequency of adventitious shoot regeneration
of 4x CMS designed by orthogonal
编号 A (TDZ)/ B (NAA)/ C (AgNO3)/ 不定芽再生率/ mg·L-1 mg·L-1 mg·L-1 %
1 1(0.1) 1(0.1) 1(0) 0
2 1(0.1) 2(0.5) 2(5.0) 19.5
3 1(0.1) 3(0.8) 3(10.0) 62.5
4 2(0.5) 1(0.1) 2(5.0) 5.56
5 2(0.5) 2(0.5) 3(10.0) 83.3
6 2(0.5) 3(0.8) 1(0) 33.3
7 3(1.0) 1(0.1) 3(10.0) 16.7
8 3(1.0) 2(0.5) 1(0) 0
9 3(1.0) 3(0.8) 2(5.0) 25.0
K 1 81.95 21.26 33.30
K 122.20 102.75 50.01
K 3 41.72 120.80 162.50 T=245.87
优水平 A2 B3 C3
R 26.82 33.18 43.10
　　表中浓度按L9(34)正交表排列，数据为3 次重复的平均值。
图3 白菜4x CMS不定芽的诱导
Fig.3 Adventitious shoot induction of 4x CMS
in B. campestris ssp. chinensis
植物生理学通讯 第41卷 第6期，2005年12月744
体鉴定的结果表明：有丝分裂中期，白菜2x CMS
根尖分生组织的染色体数为2n=2x=20 (图5-a)，说
明是二倍体植株；4x CMS 根尖染色体数为 2n=
4x=40 (图 5-b)，说明是四倍体植株。可见，在
培养过程中两者的无性系均未发生变异。
张智奇等[7]认为，白菜离体培养通过直接出
芽方式形成再生植株比通过愈伤组织再生芽的生长
周期短，再生芽的频率明显提高，变异减少。本
文结果也显示：2x CMS 和 4x CMS 白菜子叶形成
再生植株并不经过愈伤组织阶段，而是通过直接
发生途径产生不定器官后形成正常的再生植株。
参考文献
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图5 白菜2x CMS 和4x CMS 组培苗根尖的染色体(×1320)
Fig.5 Chromosomes of regenerated plants of 2x CMS and 4x
CMS in B. campestris ssp. chinensis (×1320)
a：2x CMS (2n=2x=20); b：4x CMS (2n=4x=40)。
图4 白菜2x CMS 和4x CMS 的组培苗
Fig.4 Plantlets of 2x CMS and 4x CMS in
B. campestris ssp. chinensis
a：2x C M S；b：4x C M S。
表5 4x CMS正交设计方差分析
Table 5 Variety analysis of orthogonal design of 4x CMS
方差来源 SS df MS F F0.05 F0.01
A 1 079.5 2 539.8 3.45
B 1 817.2 2 908.6 5.27
C 3 288.5 2 1 644.3 9.54* 6.94 18.0
误差 344.6 2 172.3
总和 6 185.2 8
　　* 为 0.05 水平上显著。