全 文 ：植物生理学通讯 第 40 卷 第 3期，2004 年 6 月 311
文冠果的体细胞胚胎发生
顾玉红 高述民* 郭惠红 李凤兰
北京林业大学生物科学与技术学院, 北京 100083
提要 文冠果种子在 MS+6-BA 1.0 mg.L-1+2,4-D 1.0 mg.L-1+NAA 1.0 mg.L-1+3% 蔗糖的固体培养基上暗培养，形成愈伤组
织，愈伤组织在 B5+6-BA 0.5 mg.L-1+NAA 0.5 mg.L-1+2% 蔗糖的培养基中弱光悬浮培养形成体细胞胚。在蔗糖为 1% 时，
子叶状胚萌发形成完整小植株。细胞学观察表明，文冠果体细胞胚源于胚性愈伤组织的外层细胞，此区域细胞富含淀粉
粒。
关键词 文冠果; 体细胞胚胎发生; 悬浮培养
Somatic Embrygenesis of Xanthoceras sorbifolia
GU Yu-Hong, GAO Shu-Min*, GUO Hui-Hong, LI Feng-Lan
College of Biological Science and Technology, Beijing Forestry University, Beijing 100083
Abstract The callus was obstained from ripe seed of Xanthoceras sorbifolia which was cultured on the solid
MS medium+6-BA 1.0 mg.L-1+2,4-D 1.0 mg.L-1+NAA 1.0 mg.L-1+3% sugar in the dark condition. The somatic
embryo was induced from callus which was suspensively cultured in the liquid B5 medium+6-BA 0.5
mg.L-1+NAA 0.5 mg.L-1+2% sugar. The cotyledon shaped somatic embryo germinated and formed plantlets in
the liquid medium with 1% sugar. The results of cytological observation showed that somatic embryogenesis
was originated from the outer cells of embryonic callus where the cells richly contained starch grains.
Key words Xanthoceras sorbifolia; somatic embryogenesis; suspension culture
收稿 2003-07-29 修定 　 2003-12-01
资助　 国家自然科学基金(30070612)。
* 通讯作者(E-mail:gsm6 8 9 @soh u .com, Tel:010-
62338717)。
自然状态下生长的文冠果靠根蘖繁殖，后代
变异性大，呈现严重的退化现象。生产上以播种
繁殖为主，素有“千花一果”之称，种源严重
不足。植物组织培养技术是实现快繁、保持植株
优良性状的有效措施。目前，文冠果组织培养的
研究很少。只有张桂琴等[1]、王永明和陈颖[2]分别
用嫩茎、茎尖端的嫩茎为外植体进行过离体培养，
但繁殖系数低，不能满足生产中对苗木的需要。体
细胞胚胎发生在植物组织培养中普遍存在[3]。体细
胞胚胎的悬浮培养是植物离体快繁的途径之一，此
法与由茎段诱导植株相比，有繁殖速度快、繁殖
系数高的优点[4]，能用于大规模的生产。迄今为
止，文冠果体细胞胚胎的悬浮培养尚属空白。本
文用文冠果种胚，初步建立了文冠果体细胞胚胎发
生和快速成苗的悬浮培养体系，为文冠果的产业化
和规模化快繁开辟了可能的途径。同时，也为文冠
果从细胞水平上，采用遗传操作技术进行品种改
良，以及人工制种提供了值得考虑的技术和方法。
材料与方法
材料为成熟的文冠果(Xanthoceras sorbifolia)种
子，采自本校苗圃。
在超净工作台上，种子用 5% KMnO4 溶液消
毒 5~8 min，无菌水漂洗 5 次，剥去种皮。种胚
先用75% 酒精处理10 s，无菌水漂洗3次，再以
0.1% HgCl2溶液消毒2 min，无菌水漂洗5次，然
后将种胚切成0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小的碎块，
接种到MS+6-BA 1.0 mg.L-1+2,4-D 1.0 mg.L-1+NAA
1.0 mg.L-1+3%蔗糖 +0.6%琼脂的培养基(pH 5.8)
上。培养温度为(25±1)℃，暗培养10～15 d，获
得质地松散、白色、明亮的愈伤组织，转接到
B5+6-BA 0.5 mg.L-1+2,4-D 0.5 mg.L-1+NA A 0.5 mg.
L-1+2%蔗糖的液体培养基(愈伤组织状态调整培养
基) ，放在摇床上进行悬浮培养，摇床转速为
90~100 r.min-1，暗培养。培养液中出现小细胞团
后，转入B5+6-BA 0.5 mg.L-1+NAA 0.5 mg.L-1+2%
蔗糖的液体培养基中，让体细胞胚胎继续分化发
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育，悬浮暗培养。子叶状胚出现后，转入 B5+6-
BA 0.5 mg.L-1+NAA 0.5 mg.L-1+1% 蔗糖的液体培
养基中于弱光下悬浮培养，摇床转速为60 r.min-1，
光照时间为12 h.d-1。以上培养都是每7 d更换1
次培养基，培养基的 pH 均为 5.8，培养温度为
(25±1)℃。试验重复 2 次。
取胚性愈伤组织，以石蜡包埋切片，厚度为
10 mm，经番红固绿复染后，观察体细胞胚胎发
生部位。
实验结果
1 胚性愈伤组织的诱导
文冠果种胚组织块在MS培养基中培养5 d左
右开始膨大，7~10 d 后，便可观察到松散、白
色、明亮的愈伤组织。将其转移到 B5+6-BA 0.5
mg.L-1+2,4-D 0.5 mg.L-1+NAA 0.5 mg.L-1+2%蔗糖
的液体培养基中，培养 30 d，愈伤组织呈淡黄
色，结构紧密，表面出现颗粒状突起；培养40 d，
液体培养基中有淡黄色的小细胞团出现。随着培
养时间的延长，圆形和椭圆形细胞团增多。继代
时间相隔7 d 时，愈伤组织基本不褐化；相隔20
d 以上时，愈伤组织褐化率为 70%~80%，生长很
慢，不利于体细胞胚胎的发生，严重时会导致愈
伤组织死亡。因此，要及时进行继代培养。
2 体细胞胚胎的发生与发育
在不含2,4-D并附加0.5 mg.L-1 6-BA、0.5 mg.
L-1 NAA 和 2% 蔗糖的 B5 液体培养基中，悬浮暗培
养10~15 d，即可发现球形胚(图1-a); 继续培养，
球形胚经过心形胚(图1-b)、鱼雷形胚，发育成子
叶状胚(图1-c)。从球形胚发育到子叶胚大约需要
10~15 d，体细胞胚发生率 80% 左右。细胞显微
镜观察表明，体细胞胚胎起源于胚性愈伤组织的
外层细胞, 外层的胚性细胞经多次分裂，增殖发育
成多细胞原胚，在愈伤组织表面形成突起，多细
胞原胚的细胞壁较厚，始终为一层外被所包围，
且染色较深，其下部细胞则染色较浅，富含淀粉
粒，是胚发育的能量源(图 1-e)。
3 植株再生
当形成的子叶胚长期以附加0.5 mg.L-16-BA、
0.5 mg.L-1 NAA 和 2%蔗糖的 B5 液体培养基于弱光
下培养时，会长出许多叶片，但不会萌发长根。
而当转移到附加0.5 mg.L-1 6-BA、0.5 mg.L-1 NAA
和 1% 蔗糖的 B5 液体培养基中，置于弱光下悬浮
培养10~15 d时，子叶胚便萌发长出白色的根，继
图1 文冠果体细胞胚胎的各个发育时期
Fig.1 Development stages of somatic embryo in Xanthoceras sorbifolia
a.球形胚(20×); b.心形胚(20×); c.子叶状胚(45×); d. 萌发的子叶胚(10×); e.多细胞原胚(200×)。
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续培养后，胚体逐渐转为绿色，形成再生小植株
的雏形(图 1-d)。植株再生率为60%~70%。据此认
为，过高的蔗糖浓度不利于文冠果子叶胚的萌发
与根的发育。
讨 论
前人的工作表明，无论是裸子植物[5]，还是
单子叶植物、双子叶植物，它们中的绝大多数在
诱导体细胞胚胎发生时，2,4-D 都起重要作用[6]，
是诱导胚性愈伤组织时必不可少的。在胚性愈伤
组织形成后，应降低2,4-D含量或去除2,4-D；否
则，胚状体便不能正常生长。本文结果也表明，
以文冠果种胚作外植体诱导愈伤组织时，需要添
加较高浓度的2,4-D，以促进愈伤组织的产生。如
不加2,4-D，只加 NAA 1 mg.L-1，虽然会有极少
量愈伤组织产生，但生长极缓慢，不能形成体细
胞胚。在诱导胚性愈伤组织阶段，则应降低2,4-D
的浓度，否则愈伤组织不能转化成胚性愈伤组
织。体细胞胚发生后，要及时去除 2,4-D，体细
胞胚才能进一步发育、成熟。但是，也有些植物
是例外的，如五加科的刺五加、西洋参，胚性细
胞诱导和体胚分化均需要较高浓度的2,4-D，毋需
更改培养基就可以产生大量的体胚[6]。因此，不
同植物进行体胚诱导时，2,4-D的浓度应逐一进行
实验。
参考文献
1 张桂琴,徐祥龄,赵志学. 文冠果嫩茎组织诱导植株移栽初获成
功. 林业科技通讯,1980,(7):4~5
2 王永明,陈颖. 文冠果组织培养的初步研究. 林业科技通讯,
1981,7:7~9
3 胡适宜. 被子植物胚胎学. 北京:人民教育出版社,1982.236~247
4 王傲雪,李景富. 植物体细胞胚状体的诱导研究. 黑龙江农业学
报,1999,(2):39~41
5 杨映根,桂耀林,郭仲琛. 裸子植物体细胞胚胎发生和人工种子
的研究. 种子,1995,(3):24~30
6 崔凯荣,邢更生,周攻克等. 植物激素对体细胞胚胎发生的诱导
与调节. 遗传,2000,22(5):349~354