全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 5期，2007年 10月 821
紫茎泽兰类黄酮 3-羟化酶基因的克隆、序列分析和原核表达
黄文坤 1,2，程红梅 3，郭建英 1，高必达 2，万方浩 1,*
1中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室, 北京 100094；2湖南农业大学生物安全科学技术
学院, 长沙 410128；3中国农业科学院生物技术研究所, 北京 100081
提要：用基因特异引物对紫茎泽兰 F3H基因进行 PCR扩增、T-A克隆及测序，采用DNAMAN 5.0和MEGA 3.0等生
物信息学软件进行序列分析，并对F3H基因的组织表达特性及原核表达产物进行了分析。结果表明紫茎泽兰F3H基因
cDNA全长为 1 722 bp (GeneBank登录号 EF137714)，编码 570个氨基酸，与翠菊、大豆和非洲菊 F3H基因的氨基酸序
列同源性分别为 64.4%、57.3%和54.5%。Southern杂交表明该基因为单拷贝。Northern杂交表明F3H基因在紫茎泽兰叶
中表达量最高，且其表达受泽兰酮诱导。SDS-PAGE电泳表明F3H基因经 IPTG诱导后在大肠杆菌中能表达 56.8 kDa的
目的蛋白。
关键词：类黄酮 3-羟化酶；紫茎泽兰；入侵植物；基因克隆；原核表达
Cloning, Sequence Analysis and Expression in Escherichia coli of Flavonoid 3-
hydroxylase Gene of Eupatorium adenophorum Sprengel
HUANG Wen-Kun1,2 , CHENG Hong-Mei3, GUO Jian-Ying1, GAO Bi-Da2, WAN Fang-Hao1,*
1State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural
Sciences, Beijing 100094, China; 2College of Bio-Safety Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128,
China; 3Institute of Biotechnology Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China
Abstract: The F3H gene of Eupatorium adenophorum was amplified using particular primers, cloned by T-A
method and sequenced. The nucleotide and amino acid sequences among different species were compared and
analyzed with DNAMAN 5.0, MEGA 3.0 softwares. Our results showed that the complete nucleotide sequence
of F3H gene of Eupatorium adenophorum contained 1 722 base pairs from which deduced 570 amino acids
(GenBank accession No. EF137714). The homology rates of amino acid sequences of F3H gene between
Eupatorium adenophorum and Callistephus chinensis, Glycine max and Gerbera hybrida were 64.4%, 57.3%,
54.5% respectively. Southern blot analysis showed that there was only one copy of F3H in Eupatorium
adenophorum. Northern blot analysis showed that the highest expression level of F3H was detected in the leaf
and the expression of F3H was induced by the allelochemical 9-oxo-agerphorona. SDS-PAGE analysis of
IPTG induced recombinant Escherichia coli showed that a predicted 56.8 kDa fusion protein was expressed in
the culture.
Key words: flavonoid 3-hydroxylase; Eupatorium adenophorum; invasive species; gene cloning; prokaryotic
expression
收稿 2007-05-11 修定 2007-08-28
资助 国家“9 7 3”计划( 2 0 0 2 C B 1 1 1 4 0 0 )。
* 通讯作者 ( E - m a i l：wanfangh@public3 .bta .net.cn；
T e l / F a x：0 1 0 - 6 8 9 7 5 2 9 7 )。
类黄酮 3-羟化酶(flavonoid 3-hydroxylase，
F3 H)属于细胞色素P450单加氧酶(CYP450s)，具
有催化多种依赖NADPH或NADH的底物氧化反应
的功能(Graham和 Peterson 1999；Werck-Reichhart
和 Feyereisen 2000；Schuler和Werck-Reichhart
2003)。14C标记的查尔酮(chalcone)示踪实验表
明，F 3 H 基因分别将 4 , 5 , 7 - 三羟基黄烷酮
(naringenin)和二氢莰非醇(dihydrokaempferol，
D H K )转化成圣草酚( e r i od ic t yo l )和二氢栎精
(dihydroquercetin，DHQ)后形成不同的花色素
苷，因而植物表现出不同的花色( D oos t da r 等
1995) ；它可通过黄烷酮类物质参与乙酸 -丙二酸
途径(acetic-malonic acid pathway)，保护植物免受
动物、植物和病原微生物等的侵害(Shin等 2000；
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Olofsdotter等 1995；徐正浩等 2004)。
紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum)是一种恶
性外来入侵杂草，近几年来，在我国西南地区
广泛蔓延，严重影响我国的农业、林业和畜牧
业生产以及生物多样性的安全(万方浩等 2005)。
随着生物检测方法的不断完善和外来生物入侵机
制 研 究 的 深 入 ， 紫 茎 泽 兰 的 化 感 物 质
(allelochemicals)已经得到有效的分离和鉴定，主
要有酚类(如类黄酮)、萜类(如泽兰酮)和生物碱类
等(闫乾胜等 2006；Yang等 2006)，对与化感物
质相关基因的克隆和功能基因的定位尚未见报道。
为了探索 F3H 基因在紫茎泽兰次生代谢中的作
用，本文克隆了紫茎泽兰 F3H (CYP75B)基因，
经 Southern杂交和Northern杂交分析确定了该基
因的拷贝数，并对该基因的组织表达特性作了初
步研究。
材料与方法
从云南省景洪市、贵州省贵阳市、重庆市巴
南区采集的紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum
Sprengel)种子在中国农业科学院温室中繁殖，出
苗 2个月后取幼嫩的组织(嫩叶、幼根、茎尖)用
液氮速冻后立即提取 RNA。
采用 Invitrogen GeneRacerTM kit进行 F3H基
因的 5RACE、3RACE及全长 cDNA克隆。实验
所用大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α由本实验室
提供，克隆载体 pMD18-T Vector购自 TaKaRa生
物技术公司，原核表达载体pET32a与E. coli BL21
(DE3)由中国农业科学院植物保护研究所张杰先生
惠赠。泽兰酮由本实验室杨国庆先生提供。
引物由上海生工生物技术公司合成，序列
为：G S P 5，5 - G G G A G A G T G G T G T -
T G A A G G G T G G A G T C - 3 ；G S P 3，5 -
ACAGTGGAATGGGCAATAGCGGAA-3；FSP5，
5 -CGCGAGCTCAAATGACCATACTAAC-
CC TACTGC -3 ；FS P3，5 -G CCG TC GAC-
CAACCATCTTAACAACTTTCG-3。
用苯酚法提取总 RNA为模板，以Oligo(dT)
为引物，按照 Invitrogen试剂盒说明书进行反转录
得到单链 cDNA后，分别用GSP3、GSP5基因特
异引物进行 3RACE与 5RACE。序列拼接后，在
完整编码区的全长引物 FSP5和 FSP3的 5端分别
加上 Sac I和 SalI酶切位点，进行完整编码区的
cDNA片段扩增。反应程序为：94 ℃ 5 min；
94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，35个
循环；72 ℃ 10 min。扩增的完整编码区片段用
SacI和 SalI酶切后转化DH5α感受态细胞，挑选
阳性克隆进行 PCR鉴定和酶切鉴定后测序。用
ABI377型自动测序仪测序。用DNAMAN 5.0和
MEGA 3.0进行DNA序列拼接、分析和氨基酸序
列比对。
采用改进的 CTAB法提取分别来自云南、贵
州、重庆等不同地区的紫茎泽兰基因组总 DNA
(黄文坤等 2006)。总DNA经EcoRI限制性内切酶
酶切后，用琼脂糖凝胶电泳分离后转移至
Hybond-N+尼龙膜(Amersham)上。用王东兰等
(2005)克隆的紫茎泽兰 644 bp片段作探针，然后
用 Random Primer Labelling Kit (TaKaRa)和 a-32P-
dCTP进行探针标记，按分子克隆实验指南中介绍
的方法进行杂交(Sambrook和 Russell 2001)。
总 RNA的提取采用苯酚法(王关林和方宏筠
2002)。从云南省临沧地区提取的紫茎泽兰根、
茎、叶 RNA经甲醛琼脂糖变性凝胶电泳后，转
移至Hybond-N+尼龙膜(Amersham)上后进行North-
ern杂交。探针标记与Northern杂交按分子克隆实
验指南方法(Sambrook和 Russell 2001)进行。
为了检测泽兰酮诱导对紫茎泽兰F3H基因表
达的影响，将长势一致的紫茎泽兰幼苗置于含 2
mmol·L-1泽兰酮的Hoagland营养液(pH 5.8)中分别
培养 0、1、3、6、12、24和 48 h后提取叶片
中的 RNA，进行 Northern杂交。
将F3H基因克隆到pET32a载体的SacI与SalI
位点，转化 BL21(DE3)大肠杆菌，PCR鉴定与酶
切鉴定后得到重组克隆 pET-CYP75。将 pET-
CYP75单菌落接种到 3 mL含有 100 µg·mL-1氨苄
青霉素的 LB培养基中，于 37 ℃下培养过夜。取
200 µL培养液，加到 20 mL含 100 µg·mL-1氨苄
青霉素的 LB培养基中，于 37 ℃下继续培养至
OD600值为 0.6，加入 0.l mol·L-1的异丙基 -β-D-硫
代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为 l mmol·L-1，于30 ℃
下诱导培养并分别在诱导 0、2、4、6、8 h时取
1.5 mL样品，离心收集菌体。菌体再悬浮于 100
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µL缓冲液(5 mmol·L-1 Tris-HC1，10 mmol·L-1
EDTA，50 mmol·L-1葡萄糖，pH 8.0)，加等体
积的 2×SDS凝胶加样缓冲液，于 100 ℃水浴中煮
沸 5 min，按照郭尧君(2003)书中的方法进行 10%
SDS-PAGE电泳分析。
实验结果
1 紫茎泽兰 F3H基因的扩增
根据已知的紫茎泽兰CYP75基因中间片段(王
东兰等2005)设计5RACE特异引物GSP5和3RACE
特异引物GSP3，按照试剂盒说明进行 PCR扩增，
分别得到 5末端 1 075bp和 3末端 753 bp cDNA
片段。根据所拼接的全长序列设计开放式阅读框
全长引物 FSP5和 FSP3，参照 pET32a上的多克隆
位点，在 2条引物的 5端分别加上相应的酶切位
点和 3个保护性碱基。以总RNA的反转录产物扩
增得到紫茎泽兰 F3H基因(GeneBank登录号：
EF137714)的编码区片段长度为 1 533 bp，与预期
片段大小相符。
2 重组克隆的酶切和序列分析
重组质粒 pET32a-CYP75经 SacI和 SalI双酶
切后，在琼脂糖凝胶上表现为约 1 500 bp的条
带。序列分析显示，已发表的紫茎泽兰 CYP75基
因片段与所克隆的F3H基因同一片段的核苷酸同
源性为 98.4%，所得F3H基因的编码区片段长度
为 1 533 bp。该基因 cDNA片段全长为 1 722 bp，
含 5非翻译区(37 bp)、编码区(1 533 bp)、3非
翻译区(152 bp)，编码 570个氨基酸，理论分子
量为 56.8 kDa。
3 原核表达及表达产物的SDS-PAGE分析
筛选正确连接的克隆并提取质粒，用 SacI与
SalI酶切后回收目的片段，用 T4 DNA连接酶连
接到 SacI与 SalI酶切过的 pET32a载体中，转化
大肠杆菌 BL21(DE3)，将鉴定正确的克隆(命名为
pET32a-CYP75)用于诱导目的蛋白。以未转入
F3H基因的 pET32a空载体转化 BL21(DE3)，诱
导表达蛋白后作对照。提取诱导前后的细菌总蛋
白，取适量的样品经 SDS-PAGE电泳。与未经诱
导和空载体转化菌相比，IPTG 诱导的重组菌在
56.8 kDa处有一条较浓的与目的蛋白分子量接近的
带(图 1)，而未经诱导的重组菌却没有此带，表
明外源蛋白在大肠杆菌中得到大量表达，并且表
达量随着时间的延长而增加。
4 Southern杂交分析
采用Southern杂交分析F3H基因在紫茎泽兰
基因组中的拷贝数的初步结果表明，该基因为单
拷贝(EcoRI在该基因中有一个切点，酶切后形成
2个片段) (图 2)，且不同地理区域的种群间拷贝
数没有差异。
图 1 BL21(DE3)大肠杆菌诱导表达蛋白的 SDS-PAGE电泳
Fig.1 SDS-PAGE analysis of the microsomes of E. coli
BL21(DE3) induced by IPTG
　　1：标准蛋白质分子量；2、3：pE T 3 2 a 空质粒 IP T G 诱
导 0、8 h；4 ~ 8：p E T 3 2 a -C Y P 7 5 I P T G 诱导 0、2、4、
6、8 h。箭头表示 F3 H 基因表达条带。
图 2 不同地区的紫茎泽兰基因组DNA的Southern 杂交分析
Fig.2 Southern blot analysis of genomic DNA of Eupatorium
adenophorum with the F3H fragment
5 F3H基因在植物组织中的表达特性分析
紫茎泽兰在北方温室中很难开花结籽，为了
研究紫茎泽兰F3H基因的表达模式，取从紫茎泽
兰根、茎和叶中提取的 RNA，以王东兰等(2005)
已克隆的 C YP75 基因 6 44 bp 片段为探针进行
Northern杂交的结果表明，紫茎泽兰的根、茎和
叶中均有 F3H基因产物，在叶中的表达量最高，
根中最低(图 3)。
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6 泽兰酮对 F3H基因表达的诱导
泽兰酮是紫茎泽兰的主效化感物质之一，对白
三叶、旱稻和紫花苜蓿等十几种植物的种子萌发和
幼苗生长具有不同程度的抑制作用(郑丽和冯玉龙
2005；Yang等 2006)。图 4的结果表明，泽兰酮对
F3H基因的表达有明显的诱导作用。经泽兰酮处理
后的紫茎泽兰F3H基因表达量在 6 h后开始升高，
24 h达到最高。据此推测F3H基因可能在紫茎泽兰
的防御反应或化感作用等次生代谢过程中起作用。
讨　　论
紫茎泽兰F3H基因与其它植物F3H基因在氨
基酸序列上有很高的同源性(表 1)，其中与翠菊
(Callistephus chinensis Linn)的相似性最高，大豆
(Glycine max L.)、非洲菊(Gebera hybrida Hort)和
万寿菊(Osteospermum hybrida M.)次之。根据氨
基酸序列的同源性，可将氨基酸序列同源性大于
40%的归为同一个家族，氨基酸序列同源性超过
55%的归为同一个亚族(Holton等1993；Tanaka等
1996；Nielsen和 Podivinsky 1997)。据此认为，
紫茎泽兰 F3H基因可归为翠菊 F3H基因所在的
CYP75B亚家族。
氨基酸序列比对显示，不同物种F3H氨基酸
序列的主要差异在于N端约 30个氨基酸，这段序
列含有疏水氨基酸残基，是膜插入点的信号序列
图 3 紫茎泽兰不同组织中 F3H基因表达的
Northern 杂交分析
Fig.3 Northern blot analysis of F3H gene in various organs
of Eupatorium adenophorum
图 4 泽兰酮对紫茎泽兰 F3H表达水平的诱导
Fig.4 F3H transcripts level in Eupatorium adenophorum
induced by 9-oxo-agerphorona
表 1 16个物种 F3H基因氨基酸序列同源性
Table 1 Amino-acid sequences identity of F3H between Eupatorium adenophorum and 15 organisms
物种 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
1 紫茎泽兰 100
2 翠菊 64.4 100
3 大豆 57.3 44.0 100
4非洲菊 54.5 54.2 45.2 100
5万寿菊 36.2 35.6 30.3 37.5 100
6 火葱 34.4 35.3 30.7 32.5 34.7 100
7 葡萄 21.7 24.1 11.8 9.6 9.3 9.3 100
8 牵牛花 10.8 11.8 10.8 10.8 39.0 18.9 10.8 100
9 茑萝 10.5 10.8 11.1 10.5 39.9 18.3 10.2 89.2 100
10 天竺葵 10.2 9.0 7.7 22.0 19.2 6.2 9.0 8.4 8.0 100
11 高粱 9.9 6.5 9.0 11.1 10.8 10.2 5.6 7.7 9.6 7.1 100
12 紫罗兰 9.0 12.7 9.3 9.3 24.1 10.5 11.5 43.0 43.7 8.0 7.4 100
13 夏堇 9.3 10.5 9.0 12.1 28.2 18.3 10.2 26.0 26.0 9.9 8.7 13.9 100
14 紫苏 6.5 6.8 6.5 6.2 7.1 6.8 6.5 8.4 9.3 9.3 10.2 7.1 6.2 100
15 水稻 5.6 5.3 5.6 6.2 6.8 8.4 5.9 8.0 9.0 9.0 6.8 8.0 7.1 10.2 100
16 龙胆 4.3 5.3 5.9 8.4 5.3 8.0 5.3 5.6 5.6 5.6 7.7 8.0 5.9 10.8 37.2 100
　　单位：% 。
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(图 5)。起始于第 32位左右的“PFGF”序列是 细胞色素 P450酶系的基序，连接膜的锚定位点和
图 5 不同物种来源的 F3H基因多序列比对图
Fig.5 Multiple alignments of F3H from different organisms
　　Soybean：大豆(Glycine max); Callistephus：翠菊(Callistephus chinenis); Eupatorium：紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum);
Gerbera：非洲菊(Gerbera hybrida )。
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酶蛋白的球体部分，在不同物种中是高度保守区
(Nielsen和Podivinsky 1997)。I螺旋基序始于约300
位氨基酸的“AGTDT”高度保守序列，I 螺旋
基序与底物的选择和结合有关，也有人认为是促
使形成氧分子的结合域(Kraus和Kutchen 1995)。
C端血红素的结合区(HBR) “FGAGRRICXG”(始
于 437位氨基酸)在不同的物种中也是高度保守
的，这段序列受半胱氨酸的调节，左右各氨基酸
围绕半胱氨酸形成特定结构(Bolwell等 1994)。除
了已知功能的基序外，不同物种的F3 H基因可能
有很多高度保守的氨基酸区域，值得深入探讨。
此外，自 Brugliera等(1999)克隆矮牵牛 F3H
基因并鉴定其功能以来，有关F3H基因克隆和功
能鉴定的报道越来越多，但主要集中在花色育种
方面(Vern等 2004；Christian等 2006)，而从F3H
基因序列的保守性研究其在植物次生代谢中的功能
和地位的工作尚少，有待进一步研究。
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