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几种外源含氮化合物对草麻黄愈伤组织增殖和麻黄碱含量的影响



全 文 :植物生理学通讯 第43卷 第1期,2007年2月 49
几种外源含氮化合物对草麻黄愈伤组织增殖和麻黄碱含量的影响
杨广兴1,李胜1,2,*,李唯1,张真1,李婷1,王新宇2,杨德龙1,王彦军1
1 甘肃农业大学生命科学技术学院植物组织培养研究室,兰州730070;2兰州大学生命科学学院细胞生物学研究所,兰
州730000
提要:在 20 和 40 mg·L-1 的亚硝酸钠以及 50 mg·L-1 的苯丙氨酸处理下草麻黄茎段愈伤组织增殖量增大,而酪氨酸和蛋氨
酸处理的愈伤组织增殖量则下降, 且随着这类外源物质浓度的增大其下降幅度也增大。60 mg·L-1 蛋氨酸、20 mg·L-1 酪氨
酸和50 mg·L-1苯丙氨酸可以有效提高草麻黄愈伤组织中麻黄碱的生成量。
关键词:生物量;水分散失量;添加物;愈伤组织
Effects of Extro-Nitrogenous Compounds on Callus Multiplication and Ephe-
drine Production in Ephedra sinica Stapf Cell Culture
YANG Guang-Xing1, LI Sheng1,2,*, LI Wei1, ZHANG Zhen1, LI Ting1, WANG Xin-Yu2, YANG De-Long1, WANG Yan-Jun1
1Laboratory for Plant Tissue Culture, College of Life Science & Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070,
China; 2Institute for Cell Biology, School of Life Sciences, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China
Abstract: Multiplication of the calli from E. sinica stem increased under supplementing with 20 and 40 mg·L-1
sodium nitrite and 50 mg·L-1 phenylalanine. However, adding ammonia and methionine in medium made callus
multiplication decreased, and the higher the concentration of them, the lower the callus multiplication ability.
It’s effective to enhance the production of ephedrine in the callus under supplementing with 60 mg·L-1 methionine,
20 mg·L-1 ammonia and 50 mg·L-1 phenylalanine.
Key words: biomass; water loss amount; superaddition; callus
收稿 2006-09-15 修定  2007-01-08
资助 兰州大学博士后基金(31455)、甘肃省自然科学基金
(3ZS051-A25-063)、甘肃农业大学科技创新基金
(GAU-CX0515)和甘肃农业大学大学生科学研究训练计
划基金(GAU-030602)。
*通讯作者(E-mail:lish@gsau.edu.cn;Tel:0931-
7631547)。
草麻黄(E. sinica)是麻黄属的一种草本状小灌
木,从中提取的麻黄碱具有兴奋中枢神经、发
汗、利尿、抗过敏等作用,是制药业提取麻黄
素的重要原料(林盛秋1989)。目前在国际上,麻
黄碱的人工合成工艺虽已成熟,但由于从植物中
提取成本低,副作用小等优点,所以人工合成所
占比例并不高,麻黄碱的生产仍主要从麻黄草中
提取。本文以草麻黄愈伤组织为研究对象,用几
种含氮化合物作处理后,测定其麻黄碱含量变
化,以期对麻黄碱的生物合成进行有效控制,为
麻黄碱的植物细胞规模化生产提供前期参考。
材料与方法
材料是我们研究室从草麻黄(Ephedra sinica
stapf)无菌苗茎段诱导并继代保存2年的草麻黄愈
伤组织。诱导培养基为MS+1.1 mg·L-1 2,4-D+0.2
mg·L-1 KT,继代培养基为MS+0.5 mg·L-1 2,4-D+
0.2 mg·L-1 6-BA (高玉红等2005)。愈伤组织转移
到含不同浓度亚硝酸钠(NaNO2)、蛋氨酸(Met)、
酪氨酸(Try)和苯丙氨酸(Phe)的继代培养基(表1)中
培养(光强为17.34 mmol·m-2·s-1,24 h照光,温
度为25 ℃±2 ℃),每瓶接种大小一致的5块愈伤
表1 添加物的种类与浓度
Table 1 Type and concentration of the substances

添加物
添加物浓度/ mg·L-1
对照 浓度1 浓度2 浓度3 浓度4
N a N O 2 0 20 40 60 80
Met 0 60 100 140 180
Try 0 20 40 60 80
Phe 0 25 50 75 100
植物生理学通讯 第43卷 第1期,2007年2月50
组织。实验设 1 个对照和 16 个处理,每个处理
20个重复。每2 d称重(三角瓶+瓶塞 +培养基+
愈伤组织) 1 次,根据起始重(瓶重 +瓶塞重+培
养基重)计算出测定时愈伤组织重量(不考虑培养基
的水分散失)。为了排除水分散失造成的误差,以
含有培养基但不含愈伤组织的培养瓶为对照,重
复20个,每2 d同时测定该培养瓶的总重量(含瓶
塞),30 d后根据起始重与测定值的差值计算出水
分散失的累积量,根据水分散失累积量及时间建
立水分散失量( y )与培养时间( x )的方程式 y =
0.4854x+1.0782,r=0.9885。然后根据公式:M=
(Mn+Wn) (n≤30)计算出测定当天愈伤组织实际的
生物量。式中:M 为第 n 天时的愈伤组织实际重
量;M n 为第 n 天时的测定重量;W n 为依据上述
方程计算出的第n天时培养基的水分散失累积量。
所有培养基均附加 3% 蔗糖,0.4% 琼脂,pH 为
5.8,121 ℃灭菌 20 min。各种生长调节物质和
氨基酸在灭菌前制备培养基时加入。
麻黄碱提取按以下流程:(1)取继代培养30 d
的草麻黄愈伤组织在105 ℃下杀青,再于80 ℃
中烘干至恒重。(2)称取2~5 g愈伤组织(干重),研
成粉末,转入 50 mL 的三角瓶中,加入 0.2% 的
稀 HCl 浸泡一昼夜。(3)滤去残渣,收集滤液,用
饱和Na2CO3 溶液调节滤液 pH 至 10。(4)将上述浸
提液以 NaCl 饱和,后用 30 mL 乙醚分 3 次萃取,
合并乙醚萃取液,在 45 ℃水浴中蒸干乙醚,得
到麻黄碱粗提物(展雪峰等1995)。
麻黄碱含量按以下流程测定:(1)精确称取盐
酸麻黄碱100.2 mg 置于 100 mL 容量瓶中,加水
溶解至 100 mL,摇匀制成1.002 mg·mL-1 对照品
的贮备液。(2)精确吸取 5 mL 置于 50 mL 容量瓶
中,加水至刻度摇匀,制成 A 液。(3 )精确吸取
1、3、5、7、9、11、13 m L A 液,分别置
于 50 mL 容量瓶中,加入 10 mL 次氯酸钠溶液,
再依次加入 19、17、15、13、11、9、7 mL
蒸馏水,至总体积为 30 mL,于 40 ℃水浴中保
温 20 min,冷却到室温,定容至 50 mL,摇匀。
空白对照液不加样品,其他方法与上相同。(4)用
S2000型紫外分光光度计测定波长在249 nm处的
吸光度,经回归处理得回归方程:A=6.12×10-4+
6.618×10-2 C,r=0.9996 [A:麻黄碱含量(mg·mL-1) ;
C:249 nm 下的吸光度值]。
测定样品中麻黄碱含量时,在盛有麻黄碱粗
提物的 50 mL 三角瓶中加入 10 mL 浓度为 1% 的
次氯酸钠溶液,再加入蒸馏水20 mL,放在 40 ℃
水浴中保温 20 min 后,冷却到室温,再定溶至
50 mL;用紫外分光光度计测定溶液的吸光度(龙
进 2004)。最终所得的数据用Duncan新复极差法
进行分析。
结果与讨论
1 不同外源含氮化合物对草麻黄愈伤组织增殖的
影响
不含NaNO2 的培养基上,愈伤组织在前14 d
内迅速增长,12 d 后达到高峰,14 d 后,重量
开始下降。浓度 1 下的愈伤组织生物量保持持续
上升趋势,30 d 后的总生物量比不加 NaNO2 的
高。浓度 2 下的愈伤组织早期保持缓慢增长的趋
势,14 d 后缓慢下降,22 d 又开始缓慢增加,
30 d 后的最终生物量又增加。浓度3和浓度4下
的愈伤组织生长速度均显著低于不加NaNO2 的(图
1-a)。
在不同浓度Met、Try或Phe培养基上的愈伤
组织虽然与对照的生长变化基本相同,即在前
12~14 d迅速增长,14 d时达到最高,14 d后开
始下降,24 d 时最低,此后,又都缓慢回升。
但在含Met、Try或 Phe的培养基上的愈伤组织生
长均显著比不加这些物质的差,表明添加外源的
Met、Try或Phe不利于草麻黄愈伤组织生长(图1-
b~d)。
第30天数据的差异显著性分析表明,在含不
同浓度 NaNO2 的培养基上,浓度 1 与浓度 2 下愈
伤组织的重量均高于不加添加物的,并达极显著
水平,浓度 1 下的效果最佳;在含不同浓度 Met
或Try的培养基上的草麻黄愈伤组织生长速度均显
著低于不加添加物的;而在含50 mg·L-1 Phe的培
养基上,草麻黄愈伤组织生长速度略高于不加添
加物的。从愈伤组织增殖生物量来看,培养基中
附加20 mg·L-1 NaNO2 的增殖水平最佳。
2 不同外源物对草麻黄愈伤组织中麻黄碱含量的
影响
由表2 可知,与不加添加物的相比,培养基
植物生理学通讯 第43卷 第1期,2007年2月 51
中附加20~80 mg·L-1 NaNO2 的草麻黄愈伤组织中
麻黄碱含量均显著下降,附加20 mg·L-1 Try、60
mg·L-1 Met 或 50 mg·L-1 Phe 的则显著增加,分别
增加1.5倍、1.2倍和1.1倍,而附加其他浓度的
Try、Met 或 Phe 则显著下降。附加 80 mg ·L-1
图1 亚硝酸钠和几种氨基酸对草麻黄愈伤组织增殖的影响
Fig.1 Effects of sodium nitrite and several kinds of amino acids on the multiplication of E. sinica callus
a :亚硝钠各浓度;b :蛋氨酸各浓度;c :酪氨酸各浓度;d :苯丙氨酸各浓度。
NaNO2或 60和 80 mg·L-1 Try的草麻黄碱含量增长
完全受抑制。
根据同一种营养添加物对草麻黄愈伤组织增
殖和麻黄碱含量的不同影响的结果(图 1、表 3),
我们认为应从草麻黄愈伤组织的增殖和麻黄碱含量
表2 不同含氮化合物对草麻黄愈伤组织中麻黄碱含量的影响
Table 2 Effects of different nitrogenous compounds on content of ephedrine in E. sinica callus


添加物
麻黄愈伤组织中麻黄碱的含量/ mg·g-1 (FW)

对照
添加物浓度/ mg·L-1
浓度1 浓度2 浓度3 浓度4
N a N O 2 0.1541±0.0072Aa 0.05328±0.015Bc 0.04975±0.024Bc 0.08399±0.003Bb 0Cd
Met 0.1541±0.0015Bb 0.1775±0.025Aa 0.04463±0.013Dd 0.1346±0.008Cc 0.07209±0.001CDcd
Try 0.1541±0.015Bb 0.2387±0.017Aa 0.01165±0.019Cc 0Dd 0Dd
Phe 0.1541±0.023ABa 0.04678±0.032Dd 0.1748±0.029Aa 0.09173±0.001Cc 0.1282±0.002Bb
  表中数据代表 20 个重复的平均值。
植物生理学通讯 第43卷 第1期,2007年2月52
表3 不同含氮化合物对愈伤组织中麻黄碱总量的影响
Table 3 Effects of different nitrogenous compounds on total content of ephedrine in E. sinica callus

添加物
麻黄愈伤组织中麻黄碱的含量/ 10-2 mg (FW)·瓶-1

对照
添加物浓度/ mg·g-1 (FW)
浓度1 浓度2 浓度3 浓度4
N a N O 2 0.8370±0.023Cc 1.9010±0.123Aa 1.4990±0.079Bb 0.8420±0.010Cc 0Dd
Met 0.8370±0.032BCbc 2.4970±0.089Aa 0.3790±0.029Cd 1.0910±0.021Bb 0.6220BCcd
Try 0.8370±0.012Bb 3.0100±0.051Aa 0.1860±0.081Cc 0Dd 0CDd
Phe 0.8370±0.041Cc 0.5060±0.028Cd 2.5470±0.012Aa 1.2730±0.065Bb 1.2670±0.021Bb
  表中数据为每个三角瓶的愈伤组织中麻黄碱平均含量。
或者合成量来评价草麻黄碱产量的高低。按麻黄
碱的平均含量和每瓶愈伤组织平均产量计算每个处
理的麻黄碱平均产量(麻黄碱平均含量×愈伤组织
平均重量),从差异显著性分析的结果中可以看
出,NaNO2 (浓度 1)、NaNO2 (浓度 2)、Try (浓
度 1)、Met (浓度 1)、Phe (浓度 2)、Phe (浓度
3)和Phe (浓度4)的麻黄碱总量与不加添加物之间
差异极显著,其中Met (浓度1)、Try (浓度1)和
Phe (浓度2)与不加添加物的差异最大,分别为不
加添加物的2.9 倍、3.6 倍和 3.0 倍。
Robinson (1955)认为麻黄碱是由酪氨酸和丙氨
酸为起始物合成的。原子示踪技术证明,在麻黄
植物中对二甲氨乙基苯酚是由酪氨酸和酪胺合成
的,其会进一步形成麻黄碱。Yamasaki等(1969)
根据原子示踪技术研究山岭麻黄(E. geradiana)代谢
途径,认为麻黄碱的合成是由苯丙氨酸开始经过
肉桂酸和未确定的 C2-N 的碎片合成的(Robinson
1955;Yamasaki等 1969,1973)。由此可知Met、
Try和Phe通常用作麻黄碱合成的前体物。据此可
以推测,在麻黄愈伤组织增殖培养基中附加一定
浓度的Met、Try和 Phe可望提高愈伤组织中麻黄
碱的合成量。本文结果也间接证实了这一推断。
NaNO 2 在植物的代谢中起作用。本文结果表明,
从麻黄碱的生成量来看,NaNO2 的效果次于上述
3 种氨基酸添加物,而且其提取成分中 NO2- 含量
增加,降低了麻黄碱生产的安全性(即碱中NO2-含
量增加)。因而NaNO2 在麻黄愈伤组织中的增殖和
麻黄碱合成中的作用应作综合分析和评价。
参考文献
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