全 文 ：分子植物育种，2016年，第 14卷，第 1期，第 66-71页
Molecular Plant Breeding, 2016, Vol.14, No.1, 66-71
研究论文
Research Article
蜻蜓凤梨 AfPIF4-1基因的克隆与遗传转化
石玲玲 1,3 王之 2,3 李志英 3 雷明 3 徐立 3*
1海南大学农学院,海口, 570228; 2海南大学园艺园林学院,海口, 570228; 3中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所,农业部华南热带
作物基因资源与种质创制重点开放实验室,儋州, 571737
*通讯作者, xllizhiying@vip.163. com
摘 要 为了解析蜻蜓凤梨(Aechmea fasciata)开花机理，本研究根据转录组中的片段信息，利用 RACE技术从
蜻蜓凤梨中获得一个光敏色素因子(PIFs)的 cDNA全长序列，并将其命名为 AfPIF4-1。AfPIF4-1基因 cDNA全
长 1 343 bp，开放阅读框为 1 296 bp，编码 431个氨基酸。利用 NCBI分析氨基酸序列结果显示：AfPIF4-1含有
bHLH 蛋白家族共有的功能结构域，与海枣(Phoenix dactylifera)，大豆(Glycine max)，玉米(Zea mays)，番茄
(Solanum lycopersicum)中的 PIF同源性分别为 52%、49%、42%、39%。进一步构建了 35S：：AfPIF4-1过表达载
体，并获得转基因拟南芥植株，可为进一步探究凤梨科植物开花机理，进而调控市场应用前景奠定了基础。
关键词 蜻蜓凤梨, AfPIF4-1,光敏色素因子, RACE,遗传转化
Cloning and Genetic Transformation of AfPIF4-1 in Aechmea fasciata
Shi Lingling 13 Wang Zhi 2,3 Li Zhiying 3 Lei Ming 3 Xu Li 3*
1 College of Agriculture, Hainan University, Haikou, 570228; 2 College of Horticulture and Landscape, Hainan University, Haikou, 570228; 3 Institute
of Tropical Crop Genetic Research, Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences, Ministry of Agriculture Key Laboratory of Tropical Crop
Genetic Research and Germplasm in Southern China, Danzhou, 571737
* Corresponding author, xllizhiying@vip.163.com
DOI: 10.13271/j.mpb.014.000066
Abstract In order to uncover the flowering mechanism of Aechmea fasciata, A phytochrome-interacting factor
(PIFs) gene, named as AfPIF4-1, was cloned from A. fasciata using rapid amplification of cDNA ends (RACE)
technology. The cDNA sequence of AfPIF4-1 is 1 343 bp, which has an Open Reading Frame (ORF) of 1 296 bp,
and encodes a protein of 431 amino acids. Analysis of NCBI indicated that AfPIF4-1 has high homology domains
belonging to bHLH super family. Phylogenetic analysis of AfPIF4-1 demonstrated that the deduced protein had
52%, 49%, 42%, 39% sequence identities with that of Phoenix dactylifera, Glycine max, Zea mays and Solanum
lycopersicum respectively. Based on these, we successfully constructed 35S::AfPIF4-1 overexpression vector, and
screened the positive transgenetic Arabidopsis plants. These results may supply references for further exploration
on the regulation mechanism of growth and development of A. fasciata.
Keywords A. fasciata, AfPIF4-1, Phytochrome-interacting factor, RACE, Genetic transformation
基金项目：本研究由国家自然科学基金(31372106)和中央级科研院所基本科研业务费专项(1630032014018)共同资助
凤梨科(Bromeliea)植物属于单子叶植物，多数可
供观赏。蜻蜓凤梨(A. fasciata)属于观赏性凤梨，自上世
纪 80年代引入国内后，作为室内盆花，非常受人们喜
爱(刘慧春等, 2007)。但是其生长发育机理则未可知。
光敏色素因子(PIFs)是 bHLH蛋白家族成员，在
光形态形成(Castillon et al., 2007)，温度转导(Proveniers
and Zanten, 2013)等多种途径里扮演着重要的角色。
在光途径中，PIFs是一种负调控因子，可促进早期植
物的暗形态形成(Leivar and Quail, 2011)；在温度途
径中，随着温度的升高，PIFs转录因子家族的 PIF4
可直接激活 FLOWERING LOCUS T (FT)基因的表
达，促进植物提前开花(Kumar et al., 2012)。除上述两
种途径外 PIFs在多种激素调控途径中也发挥着重要
的作用。在赤霉素(GA)的调节中，GA的缺失可导致
图 1蜻蜓凤梨心叶总 RNA的琼脂糖凝胶电泳图谱
注: 1~3:蜻蜓凤梨心叶 RNA
Figure 1 Agrose electrophoresis results of total RNA extracted
from the cotyledon of A. fasciata
Note: 1~3: The RNA extracted from the cotyledon of A. fasciata
图 2 AfPIF4-1 的 RACE PCR扩增(A,B)和编码区全长扩增(C)的琼脂糖凝胶电泳图谱
注: M: DL2000 marker; 1: 5-RACE PCR; 2: 3-RACE PCR; 3:AfPIF4-1CDS区全长
Figure 2 Agrose electrophoresis results of RACE PCR amplification (A,B) and cloning the full length encoding sequence of AfPIF4-1(C)
Note: M: DL2000 marker; 1: 5-RACE PCR; 2:3-RACE PCR; 3: Full length ofAfPIF4-1 CDS sequences
DELLA蛋白的升高使其与 PIFs蛋白发生互作，从而
调节相关联基因的表达，进而调控植物的生长发育
(Feng et al., 2008)；而在生长素调节过程中，高温环
境下 PIFs转录因子家族的 PIF4可通过调控生长素的
水平以及合成生长素关键基因的表达促进植物的伸
长增长(Franklin et al., 2011; Koini et al., 2009)。由此说
明 PIFs在植物的生长发育过程中具有很重要的作用。
本研究在 PIF4基因现有的研究基础上，想进一
步验证 PIF4基因在蜻蜓凤梨里的功能，旨在为深入
研究 AfPIF4-1 基因的功能及其对蜻蜓凤梨生长发
育过程中的作用提供一些理论数据。
1结果与分析
1.1蜻蜓凤梨总 RNA的提取
本研究提取蜻蜓凤梨心叶的总 RNA，测其
OD260/280比值分别为 1.990 9、1.899 1、1.980 5，均在
1.8~2.0范围内，琼脂糖凝胶电泳显示结果(图 1)，质
量达到后续所需。
1.2 AfPIF4-1基因全长的克隆
该研究通过 RACE 技术获得了AfPIF4-1 的 5
端序列 528 bp (图 2A)和 3端序列 1 190 bp (图 2B)，
将其拼接后获得 AfPIF4-1的 cDNA全长，为 1 343 bp。
根据所得 cDNA片段，寻找 AfPIF4-1的开放阅读框
为 1 296 bp，据此再次设计带有 KpnⅠ和 XbaⅠ酶切
位点的特异性引物，利用 PCR技术扩增得到目的片
段(图 2C)，测序结果显示与 RACE拼接序列相同，验
证了 AfPIF4-1基因 CDS区全长为 1 296 bp。
1.3 AfPIF4-1的生物信息学分析
1.3.1 CDS序列及理化性质分析
AfPIF4-1的 CDS区全长为 1 296 bp，推测其编
码了 431 个氨基酸(amino acids, aa)；其编码的氨基
酸等电点(PI)是 5.47，分子量是 47.653 kD，所带负电
荷氨基酸(Asp+Glu) 50 个，正电荷氨基酸(Arg+Lys)
38个，蛋白不稳定指数为 64.15，是一类非稳定蛋白。
1.3.2同源性比对、结构域、系统进化树的分析
根据 AfPIF4-1 基因编码区序列推导的蛋白序
列，利用 NCBI对 AfPIF4-1蛋白进行 Blastp同源性
比对分析，显示其与番茄(SlPIF4 NP_001294937.1)、
大豆(GmPIF4L XP_006586042.1)、玉米(ZmPIF5 XP_
008665523.1)、拟南芥(AtPIF4 NP_565991.2)以及海枣
(PdPIF4L XP_008776592.1)的同源性分别为 39%、
49%、42%、37%、52%(图 3)。使用NCBI中的Conserved
domains对 AfPIF4-1蛋白序列进行分析，结果显示
AfPIF4-1具有 bHLH家族的保守氨基酸结构域 bHLH
(250aa~310aa) (图 3)。
从 NCBI上下载与 AfPIF4-1蛋白同源的序列，使
用MEGA 6.0软件构建 PIF蛋白的进化树(图 4)，进化
树显示 AfPIF4-1和芭蕉的 PIF5L (XP_009407082.1)
亲缘关系比较近。
1.4 AfPIF4-1表达载体的构建
使用限制性内切酶 KpnⅠ和 XbaⅠ酶切 pEASY-
蜻蜓凤梨 AfPIF4-1基因的克隆与遗传转化
Cloning and Genetic Transformation of AfPIF4-1 in Aechmea fasciata 67
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 3 AfPIF4-1同源性比对分析
注:横线为 AfPIF4-1结构域;黑色方框内为 DNA结合域;虚线方框内为二聚体结合位点; #为 E-box/N-box特异性位点;蜻蜓
凤梨: AfPIF4-1;番茄：SlPIF4 NP_001294937.1;大豆: GmPIF4L XP_006586042.1;玉米: ZmPIF5 XP_008665523.1;拟南芥: At-
PIF4 NP_565991.2;海枣: PdPIF4L XP_008776592.1
Figure 3 Homology comparison analysis of AfPIF4-1
Note: Underline is AfPIF4-1domain; Black columns are DNA binding region; Dashed line columns are dimerization interface; # is
E-box/N-box specificity site; Aechmea fasciata: AfPIF4-1;Solanum lycopersicum: SlPIF4 NP_001294937.1; Glycine max: GmPIF4L
XP_006586042.1; Zea mays: ZmPIF5 XP_008665523.1;Arabidopsis thaliana: AtPIF4 NP_565991.2;Phoenix dactylifera: PdPIF4L
XP_00877659
blunt-AfPIF4-1 (图 5A)和 CaMV35S，利用 T4连接酶
将目的基因与酶切好的空表达载体 16℃过夜连接，
转化 DH5α后，提取 CaMV35S-AfPIF4-1的质粒，用
KpnⅠ和 XbaⅠ进行双酶切鉴定(图 5B)，说明该重组
载体已构建完成。将 CaMV35S-AfPIF4-1转化农杆
菌，获得阳性菌液。
1.5 AfPIF4-1基因转拟南芥植株的分子鉴定
提取野生型和转基因拟南芥单株的总 RNA，反
转录成 cDNA，以此为模板，利用 AfPIF4-1的特异性
引物 AfPIF4-1-SEN-KpnⅠ和 AfPIF4-1-ANT-XbaⅠ
对其进行 PCR扩增检测。凝胶电泳结果(图 6)显示野
生型拟南芥和转空载体 CaMV35S拟南芥没有扩增
出 AfPIF4-1条带，转基因拟南芥可以扩增出 AfPIF4-1
条带，说明 AfPIF4-1基因已成功转入拟南芥。
2讨论
通过对蜻蜓凤梨 AfPIF4-1蛋白同源性比对分
析，我们发现其编码的蛋白和其它物种的 PIF具有
较高的同源性，进一步对 AfPIF4-1结构分析显示该
蛋白含有 PIFs蛋白家族的保守结构域 bHLH。在其
他物种中，PIFs蛋白中 bHLH保守结构域中含有的
HLH结构可介导 PIFs蛋白之间形成同源或异源二
聚体，共同调控相关基因的表达(Hornitschek et al.,
2009)，而其含有的碱性 DNA结合区则可与 E-box
中的 G-box (5-CACGTG-3)结合调控下游基因的转
录水平(Zhang et al., 2013)，进而调控植物的生长发
育。本研究的蜻蜓凤梨 AfPIF4-1蛋白含有的结构域
中也包含相应的螺旋双螺旋结构 (helix-loop-helix,
HLH)、碱性 DNA结合区、二聚体结合位点和 E-box
特异性位点，所以我们推测 AfPIF4-1也可以与其他
基因相互作用，参与凤梨科植物生长发育的重要调控。
进化树分析显示蜻蜓凤梨 AfPIF4-1与芭蕉的
PIF5L (XP_009407082.1)亲缘关系比较近，原因可能
是蜻蜓凤梨与芭蕉同属于热带单子叶植物，它们的进
化环境相似，AfPIF4-1的基因序列在进化上相对保守。
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蜻蜓凤梨 AfPIF4-1基因的克隆与遗传转化
Cloning and Genetic Transformation of AfPIF4-1 in Aechmea fasciata
图 5 pEasy-blunt-AfPIF4-1克隆载体(A)和CaMV35S-AfPIF4-1
表达载体(B)双酶切的琼脂糖凝胶电泳图谱
注: M: DL15000 marker; 1: pEasy-blunt-AfPIF4-1 克隆载体双
酶切; 2: CaMV35S-AfPIF4-1表达载体双酶切
Figure 5 Agrose electrophoresis results of pEasy-blunt-AfPIF4-1
clone vector (A) and CaMV35S-AfPIF4-1 expression vector (B)
double enzyme digestion
Note: M: DL15000 marke; 1: Double enzyme digestion of pEasy-
blunt-AfPIF4-1 clone vector; 2: Double enzyme digestion of Ca-
MV35S-AfPIF4-1over-expression vector
图 4 AfPIF4-1蛋白进化树分析
注 : 烟草 : Nt PIF4 XP_009602219.1;美花烟草 : Ns PIF4
XP_009757612.1;番茄 : Sl PIF4 NP_001294937.1;牵牛花 : In
PIF4 AIZ66162.1; 芝麻: Si PIF4 XP_011100371.1;油棕: Eg PIF4
XP_012830904.1;大豆: Gm PIF4L XP_006586042.1;棕榈: Th
PIF4 XP010525635.1;节节麦: At PIF3 EMT27650.1; 瓠果 : Cs
PIF4L XP_006485005.1;越瓜：Cm PIF4L XP_008464685.1;葡
萄: Vv PIF4 XP_002278399.1;白梨: Pb PIF4LXP_009356576.1;
草莓: Fv PIF4LXP_004303901.1;莲: Nn PIF5LXP_010247965.1;
海枣: Pd PIF4L XP_008776592.1;芭蕉: Mm PIF5L XP_00940-
7082.1;蜻蜓凤梨: AfPIF4-1;蒺藜苜蓿: Mt PIF1 XP_0036254-
75.1; 拟南芥 : At PIF4 NP_565991.2;二穗短柄草 : Bd PIF5L
XP_010228906.1;玉米 : Zm PIF5 XP_008665523.1;小米 : Si
PIF4 XP_011100371.1
Figure 4 Phylogenetic tree analysis of AfPIF4-1
Note: Nicotiana tomentosiformis: Nt PIF4 XP_009602219.1;Nic-
otiana sylvestris: Ns PIF4XP_009757612.1;Solanum lycopersicum:
Sl PIF4 NP_001294937.1;Ipomoea nil: In PIF4 AIZ66162.1;
Erythranthe guttatus: Eg PIF4 XP_012830904.1;Glycine max:
Gm PIF4L XP_006586042.1;Tarenaya hassleriana: Th PIF4 XP
010525635.1; Aegilops tauschii: At PIF3 EMT27650.1; Citrus
sinensis: Cs PIF4L XP_006485005.1;Cucumis melo: Cm PIF4L
XP_008464685.1;Vitis vinifera: Vv PIF4 XP_002278399.1;
Pyrus x bretschneideri: Pb PIF4LXP_009356576.1;Fragaria vesca
subsp. Vesca: Fv PIF4L XP_004303901.1;Nelumbo nucifera: Nn
PIF5L XP_010247965.1;Phoenix dactylifera: Pd PIF4L XP_008-
776592.1; Musa acuminata subsp. Malaccensis: Mm PIF5L
XP_009407082.1;Aechmea fasciata: AfPIF4-1;Medicago trunc-
atula: Mt PIF1 XP_003625475.1;Arabidopsis thaliana: At PIF4
NP_565991.2;Brachypodium distachyon: Bd PIF5L XP_010228-
906.1; Zea mays: Zm PIF5 XP_008665523.1;Sesamum indicum:
Si PIF4 XP_011100371.1
光作为植物生长发育至关重要的因素，不仅仅
提供了植物生长发育所需的能量，而且在植物的发
芽到开花的过程中都扮演着独特的角色。PIFs蛋白
作为光信号的负调控因子，可以从不同方面抑制光
形态形成，如抑制叶绿素和花青素的积累，促进下胚
轴和子叶的伸长(Leivar and Quail, 2011)。在拟南芥
中，PIF4 和 PIF5 可以协同促进植物的遮荫性反应
(Lorrain et al., 2008)，引起一些形态学的改变，如胚轴
和叶柄的伸长，而且发现 PIF4可以响应高温，促进
植物提前开花(Kumar et al., 2012; Kumar and Wigge,
2010)。在蜻蜓凤梨中 AfPIF4-1的过表达又会有何表
型，这些还需进一步验证。该研究通过 RACE技术获
得蜻蜓凤梨 AfPIF4-1基因的全长，构建了过表达载
体，并且获得了转基因拟南芥植株，为深入研究蜻蜓
凤梨 AfPIF4-1的功能奠定了基础。
图 6转基因拟南芥 PCR检测的琼脂糖电泳图谱
注: M: DL2000 marker; 1~2:野生型拟南芥; 3:转 CaMV35S拟
南芥; 4~9: 35S::AfPIF4-1拟南芥
Figure 6 Agrose electrophoresis results of PCR test for 35S::
AfPIF4-1 plants
Note: M: DL2000 marker; 1~2: Wild-type (Col-0) Arabidopsis
plants; 3: CaMV35S Arabidopsis plants; 4~9: 35S：：AfPIF4 -1
plants
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分子植物育种
Molecular Plant Breeding
引物功能
Primer function
RACE-3克隆
Cloning of 3 RACE
RACE-5克隆
Cloning of 5RACE
克隆载体插入片段检测
To detect fragment inserted in a cloning vector
AfPIF4-1编码区克隆
Cloning of the encode sequence
表 1 AfPIF4-1 RACE和 CDS区扩增引物
Table 1 AfPIF4-1 RACE and encoding sequence amplification primer
引物名称
Primer name
3-AfPIF4-1-out
3-AfPIF4-1-in
5-AfPIF4-1-out
5-AfPIF4-1-in
M13-R
M13-F
AfPIF4-1-SEN-KpnⅠ
AfPIF4-1-ANT-XbaⅠ
引物序列(5-3)
Primer sequence (5-3)
AGTTCAAGTAGGAGGAGGAGGAGAG
TACGGCTAACTTACGTATTGAGGCG
GCTTGAATTGTAATTATTCGCCTCA
CTCCGCTTCCTAAATTAACTGC
CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
GAGCGGATAACAATTTCACACAGG
GGGGTACCATGGAAGAGAACTCAAGATCTTTA
GCTCTAGATTAGTTTTTCCTCTCAGTAGATTT
3材料与方法
3.1材料
3.1.1植物材料
蜻蜓凤梨(A. fasciata)由中国热带农业科学院热
带作物品种资源研究所、农业部华南热带作物基因
资源与种质创制重点开放实验室提供。
3.1.2试剂与药品
Primer star Taq、rTaq、dNTPs、T4 连接酶购于
TaKaRa公司；潮霉素(Hygromycin, Hyg)、X-Gluc购于
生工生物；pEASY-blunt克隆载体、大肠杆菌 DH5α
感受态、TransScript誖Fly First-Strand cDNA Synthesis
Super-Mix 购于北京全式金公司；SMARTTM RACE
cDNA AmplificationKit购于 clontech公司；农杆菌
EH105菌株由本实验保存；引物合成单位是英潍捷
基公司。
3.2方法
3.2.1蜻蜓凤梨心叶 cDNA的获取
蜻蜓凤梨心叶总 RNA的提取采用 CTAB法(郝
宏刚, 2012)，cDNA的合成方法详见 PrimescriptⅡTM
RT-PCR Kit试剂盒(TaKaRa公司)。
3.2.2 AfPIF4-1基因的克隆
本研究以转录组数据分析为依据设计 5RACE
和 3RACE引物(表 1)，5RACE和 3RACE PCR扩增
所需的模板参照 SMARTTM RACE cDNA Amplifica-
tion Kit说明书，方法参照张鲲等(2011)。将扩增的
RACE片段回收、转化 DH5α后，菌液 PCR，将有目
的条带的菌液送英潍捷基公司测序，将结果使用
DNAMAN软件进行拼接，获得 AfPIF4-1全长。利用
ORF finder寻找其开放阅读框，据此设计特异性引物
AfPIF4-1-SEN-KpnⅠ和 AfPIF4-1-ANT-XbaⅠ(表 1)，
使用 Primer Star DNA 聚合酶(TaKaRa)进行 PCR 扩
增目的基因，PCR扩增程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，
63℃ 30 s，72℃ 1min，共 32个循环；72℃ 10min，4℃结
束。用 1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测，将 PCR扩增条带
回收，与 pEasy-blunt 载体相连，转化 DH5α，菌液验
证后送英潍捷基公司测序。
3.2.3 AfPIF4-1生物信息学分析
使用ORFfinder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/
gorf.html)查找 AfPIF4-1的开放阅读框，推测其氨基
酸序列；利用 NCBI的 Blastp (http://blast.ncbi.nlm.nih.
gov)对 AfPIF4-1氨基酸序列进行同源性比对；使用
NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrp
sb.cgi)中的 Conserved domains 在线分析 AfPIF4-1
氨基酸序列的保守结构域；利用MEGA6.0软件构建
PIF蛋白的进化树并对其进行分析；利用 ProtParam
软件 (http://www.exp asy.org/tool/protparam.html)对
AfPIF4-1氨基酸理化性质进行分析。
3.2.4 CaMV35S-AfPIF4-1表达载体的构建
提取含有 pEASY-blunt-AfPIF4-1的质粒，使用
限制性内切酶 KpnⅠ和 XbaⅠ双酶切 pEASY-blunt-
AfPIF4-1和 CaMV35S，凝胶电泳检测，切胶，回收，
使用 T4连接酶(TaKaRa) 公司 16℃过夜连接，转化
DH5α。利用 Plasmid Mini KitⅠ试剂盒(OMEGA公
司)提取 CaMV35S-AfPIF4-1 质粒，双酶切鉴定，转
化农杆菌 EHA105。阳性菌液加入 50%的甘油-80℃
冰箱保存。
3.2.5拟南芥的遗传转化
拟南芥(Arabidopsis thaliana)遗传转化参考杨彩
云(2009)方法进行。
70
3.2.6转基因植株的分子鉴定
使用 TransZol Plant 试剂盒(北京全式金公司)
分株提取野生型和转拟南芥植株的总 RNA，利用
PrimeScritⅡTM RT-PCRKit试剂盒反转录合成 cDNA。
利用 AfPIF4-1-SEN-KpnⅠ和 AfPIF4-1-ANT-XbaⅠ
两对特异性引物进行 PCR 扩增，琼脂糖凝胶电泳
检测。
作者贡献
石玲玲是本研究的实验设计和实验研究的执行
人并完成数据分析和论文初稿的写作；王之参与实
验执行，数据分析与文章修改；李志英和雷明参与项
目的构思，指导实验设计数据分析和论文修改；徐立
是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，
论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金(31372106)和中央
级科研院所基本科研业务费专项(1630032014018)共
同资助。感谢中国热带农业科学院热带作物品种资
源研究所、农业部华南作物基因资源与种质创制重
点开放实验室提供各项实验条件。
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