全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第4期，2006年8月 721
甘蓝品种‘争春’和‘寒光 2 号’的 DNA 指纹图谱构建
薄天岳1,2,* 刘冲2,3 葛才林3 任云英1 陈锦秀1 杨晓锋1,2
1 上海市农业科学院园艺研究所，上海市国家蔬菜改良分中心，上海 201106；2 上海市设施园艺技术重点实验室，上
海201106；3 扬州大学农学院，江苏扬州 225009
Establishment of DNA Fingerprinting on Cabbage (Brassica oleracea var.
capitata) Cultivars of ‘Zhengchun’ and ‘Hanguang 2’
BO Tian-Yue1,2,*, LIU Chong2,3, GE Cai-Lin3, REN Yun-Ying1, CHEN Jin-Xiu1, YANG Xiao-Feng1,2
1Horticultural Research Institute, Shanghai Academy of Agricultural Sciences, Shanghai Sub-center of Chinese National Vegetable
Improvement Center, Shanghai 201106, China; 2Shanghai Key Laboratory of Protected Horticultural Technology, Shanghai
201106, China; 3Agricultural College, Yangzhou University, Yangzhou, Jiangsu 225009, China
提要 用 SDS 法提取甘蓝(Brassica oleracea var. capitata)品种‘争春’、‘寒光 2 号’及其各自亲本的基因组 DNA，通过
SRAP、RAPD 两种分子标记方法，构建其 DNA 指纹图谱，用于种子纯度鉴定。利用 30 对 SRAP 引物组合和 200 个 RAPD
随机引物，以各品种及其亲本的基因组 DNA 为模板组进行筛选，结果显示: 多数 SRAP 引物组合对模板组的扩增带型一
致，少数组合扩增出差异，但未能找到具有互补差异的引物组合；通过 RAPD 标记方法筛选出能鉴定 2 个品种纯度的引
物分别为 S42、S103、S193 和 S42、S89、S151，其中引物 S42 对 2 组材料均能扩增出特异的 RAPD 指纹图谱，并将 RAPD
指纹图谱转变为相应的数字指纹。
关键词 甘蓝；品种；SRAP；RAPD；DNA 指纹图谱
收稿 2006-04-07 修定 　2006-06-01
资助 上海市科委基础性研究计划(03JC14060)和上海市农委
科技兴农重点攻关项目(2004 年第 2-5 号)。
*E-mail: tybo@saas.sh.cn, Tel: 021-52630102
目前，我国生产中推广应用的主栽甘蓝
(Brassica oleracea var. capitata)品种基本上为杂种
一代。杂种一代能综合亲本的许多优良性状，经
济效益较好。但常发生的假杂种或种子混杂现象
会使种子纯度下降，而导致生产蒙受损失。因
此，提高杂交种纯度是杂种优势利用研究领域的
重要课题。在种子纯度鉴定技术中，传统的形态
鉴定方法耗时且成本高，同工酶鉴定技术常受环
境条件和植物发育阶段的制约，而随机扩增多态
性DNA (random amplified polymorphism DNA,
RAPD)、简单重复序列(simple sequence repeats,
SSR)、扩增片段长度多态性(amplified fragment
length polymorphism, AFLP)等分子标记技术，通
过比较杂交种与其双亲的扩增谱带，就可实现品
种纯度的快速鉴定，省时、省工且可靠，现已
被广泛应用(Hashiume 和 Sato 1993；关荣霞等
2003；蔡雪飞等2004；柳李旺等2004a, b)，新
近发展起来的分子标记技术——序列相关扩增多
态性(sequence-related amplified polymorphism,
SRAP)在蔬菜种子纯度鉴定中的应用尚未见有成功
的报道。本文利用 SR A P、R A P D 技术构建了长
江中下游地区甘蓝主栽品种‘争春’、‘寒光 2
号’与其各自亲本的 D N A 指纹图谱，并取得了
一些结果，现报道如下。
材料与方法
1 材料
材料为甘蓝(Brassica oleracea var. capitata)品
种‘争春’与‘寒光2 号’及其各自亲本，由上
海市农业科学院园艺研究所提供。
2 试剂与仪器
实验所用的 PCR 试剂(MgCl2、PCR 缓冲液、
dNTPs、Taq DNA 聚合酶、引物)以及 SDS、Tris-
HCl、EDTA、琼脂糖等均购自上海生工生物工程
有限公司。
实验所用仪器为：Eppendorf 公司生产的
Mastercycler 5333 PCR仪，BIO-RAD Laborato-
ries 公司生产的PowerPac BasicTM EN61010-1电泳
仪和Gel DocTM EQ 170-8060凝胶成像仪。
植物生理学通讯 第42卷 第4期，2006年8月722
3 DNA 的提取
DNA 的提取参照王关林和方宏筠(1998)的方
法，并略加改进。
4 PCR反应条件及电泳分析
RAPD 扩增反应采用我们优化的甘蓝 RAPD 体
系和扩增程序(刘冲等 2005)。RAPD 扩增产物电
泳分析采用浓度为15 g·L-1 的琼脂糖凝胶(含0.15
ng·L-1 EB)，电泳缓冲液为1×TAE，保持 90 V 恒
压(4~5 V·cm-1)电泳 1.5~2 h，凝胶成像仪成像分
析。
SRAP扩增反应体系参照Li和Quiros (2001)的
方法，总体积为20 mL，其中含2.0 mL 25 mmol·L-1
MgCl2、2.0 mL 10×PCR缓冲液、0.4 mL 10 mmol·L-1
dNTPs、0.25 mL 5 U·mL-1 Taq DNA 聚合酶、10
ng·mL-1上游和下游引物各1.5 mL、3 mL 20 ng·mL-1
模板 DNA，其余为灭菌双蒸水。扩增程序为95℃
预变性5 min；95℃变性1 min，35℃复性1 min，
72℃延伸1.5 min，5个循环，复性温度升至48℃
再进行35个循环；72℃延伸 7 min。扩增产物电
泳分析操作同 RAPD 扩增产物电泳分析。
5 DNA 指纹图谱的构建与验证
对手工配制的甘蓝品种‘争春’、‘寒光 2
号’及其各自亲本的 DNA 进行 PC R 扩增，筛选
出能产生互补型特征谱带的引物，所获得的相应
的电泳图即为指纹图谱。以此特异引物对制种基
地生产的F1 代单株进行PCR 扩增，并与田间实际
种植的甘蓝假杂种鉴定结果进行一致性的验证。
实验结果
1 RAPD 扩增结果
1.1 RAPD引物筛选 先以‘寒光2号’品种为模
板 DNA，对 200 个 RAPD 随机引物进行筛选，选
出适用于甘蓝且扩增产物条带丰富的引物 50 个，
再对杂交品种与其亲本 DNA 按母本、杂交种、父
本的顺序组成的 2 组材料分别进行 PCR 扩增。50
个引物中，对 2 组材料扩增表现有弱带、特异
型、偏父型、偏母型、互补型等谱带类型，各
类引物数统计见表 1 。能对‘争春’、‘寒光 2
号’2 组材料扩增出互补型谱带的引物分别为
S42、S103、S193 和 S42、S89、S151。其中，
引物 S42 对 2 个品种纯度鉴定均有效，其对‘争
春’模板组扩增产生的互补特征片段大小约为
表1 不同带型引物数

带型
引物数
‘争春’ ‘寒光2号’
弱带 1 0
特异型 6 5
双亲型 29 26
父本型 6 9
母本型 5 7
互补型 3 3
图 1 引物S42构建的RAPD指纹图谱
　　M：DGL 2000 DNA 标准；1：‘争春’母本；2：‘争春’；
3 ：‘争春’父本；4 ：‘寒光 2 号’母本；5 ：‘寒光 2 号’；
6 ：‘寒光 2 号’父本。箭头标出的为互补型特征片段。
550 与 1 050 bp，对‘寒光 2 号’模板组扩增产
生的互补特征片段大小约为 300、600 与 875 bp
(图 1)。
1.2 数字指纹的建立 根据上述RAPD指纹图谱，
以1和0分别代表某个等位基因位点扩增出的DNA
条带的有和无，按照从上到下即由小片段向大片
段的读带方向，将 RAPD 指纹图谱转换为由 1 和
0 组成的字符串，即构成数字指纹。为方便建立
相应的数字指纹，可先依照 RAPD 指纹图谱绘制
直观的线段示意图(图2)，再根据示意图建立数字
指纹(表 2)。从表 2 可知，材料之间的差异可以
通过字符串的排列顺序而得到清楚的表达。
2 RAPD 引物 S42 的应用效果验证
为了验证S42 特异引物在鉴定‘争春’、‘寒
光 2 号’杂交种纯度上的效果，从制种基地生产
的‘争春’和‘寒光 2 号’杂交种中各随机抽
取35个单株，同时进行S42标记的分析和真假杂
种的调查。结果利用 S 4 2 标记分析查出的‘争
植物生理学通讯 第42卷 第4期，2006年8月 723
春’真杂种株为 2 9 株，假杂种株为 6 株；‘寒
光 2 号’的真杂种株为 27 株，假杂种株为 8 株。
这些数据与田间鉴定的结果相符，说明采用 S42
标记进行‘争春’、‘寒光2 号’杂交种纯度的鉴
定是可行的。
3 SRAP扩增
实验中共用 SRAP 引物 11 个，其中，正向
引物 5 个(M1~M5)，反向引物 6 个(E1~E6)，正反
向引物各取一个随机组合得 30 对引物。用 30 对
引物对‘争春’、‘寒光 2 号’2 组模板材料进行
PCR 扩增，结果表明：引物 M5 和 E3 对 2 组模板
扩增结果呈弱带；引物 M2 和 E3 对‘争春’模板
组扩增条带呈母本型(图3-a)，特征片段大小约为
850 bp (图3中箭头所示，下同); 引物M4和E3对
‘争春’模板组扩增条带呈特异型(图 3-b)，特
征片段大小约为 1 500 bp；引物 M1 和 E2 对‘寒
光2号’模板组扩增条带呈父本型(图3-c)，特征
片段大小约为 800 bp；引物 M3 和 E1 对‘寒光 2
号’模板组扩增条带呈母本型(图 3-d)，特征片
段大小约为400 bp；其余引物扩增条带均呈双亲
型，显示品种和亲本之间的带型一致。因此，未
筛选出能对2个品种及其亲本扩增产生互补型特征
谱带的引物组合。
图2 RAPD指纹图谱线段示意
　　1 ：‘争春’母本；2 ：‘争春’；3 ：‘争春’父本；4 ：
‘寒光 2 号’母本；5 ：‘寒光 2 号’；6 ：‘寒光 2 号’父本。
表2 RAPD指纹图谱的数字指纹
材料 数字指纹
‘争春’母本 111111111011110
‘ 争 春 ’ 111111111111111
‘争春’父本 111101111111111
‘寒光 2 号’母本 1100111111111111110
‘寒光 2 号’ 1111111111111101111
‘寒光 2 号’父本 0111111110111101111
图 3 SR A P 引物对‘争春’和‘寒光 2 号’模板组的扩增
　　M：D G L 2 0 0 0 D N A 标准；1：‘争春’母本；2：‘争春’；3：‘争春’父本；4：‘寒光2 号’母本；5：‘寒光2 号’；6：‘寒光2 号’
父 本 。
讨　　论
杂种优势的利用在蔬菜育种中具有重要地
位，而杂种优势的充分表现取决于种子的纯度，
因此，研究简单、快捷的种子纯度鉴定的方法是
必要的。采用分子标记技术构建 DNA 指纹图谱进
行品种纯度的鉴定，已有较多的应用。由于品种
的 D N A 图谱有多种类型，如双亲型、偏父型、
偏母型、互补型、特异型和缺失型等，其中，
互补型谱带是鉴定纯度最直观和可靠的。因此在
构建指纹图谱时，应寻找能扩增产生互补型特征
谱带的引物。但在有些作物中很难寻找“互补
型”引物，针对这一问题，有人提出用双引物，
即2个引物混合后扩增或2个引物的扩增产物混
合后检测。前者的扩增过程远比单个引物复杂，
很难获得预期结果，至今尚未有用此方法成功的
报道；后者则比较容易获得预期结果，但结果的
可靠性还需探讨。
植物生理学通讯 第42卷 第4期，2006年8月724
近年来，多种分子标记技术被用于种子纯度
鉴定。其中，R A P D 技术需要的 D N A 量极少、
操作简便，有关 RAPD 技术的稳定性和重复性问
题，许多研究证明只要严格控制反应条件，重复
结果是可以得到的。此项技术已被成功用于大白
菜(宋顺华和郑晓鹰2000)、水稻(陈忠明等2003；
黄亚红等2002)、油菜(蔡雪飞等2004)等多种作物
的种子纯度鉴定，本文也证明 RAPD 技术用于甘
蓝种子纯度的鉴定是可行的。SRAP 系统是在芸
薹属作物开发出来的一种新型分子标记技术，已
经开发出多个正反向引物，此项技术已被成功用
于白菜(Li和Quiros 2001)、小麦(Hu和Vick 2003)
等作物，棉花中也有构建SRAP 遗传连锁图(Li 等
2003)成功的报道。SRAP 技术采用复性变温法：
前5个循环复性温度为35℃，其主要原因是较低
的复性温度能确保引物与靶 DNA 部分配对，随后
的30~35个循环中可将复性温度提升至45~50℃，
从而可保证前5个循环的扩增产物呈指数式增加。
由于 SRAP 扩增多产生强带，很少出现条带重叠
现象，引物又较长，故对目标片段的测序可通过
相应引物直接进行，无需克隆，比 RAPD 和 AFLP
方便易行。本文中有时出现条带间模糊的现象，
可能是 DNA 模板和引物用量的配比等因素未达最
优化造成，是否如此，尚待探究。
参考文献
蔡雪飞, 赵云, 李江(2004). 甘蓝型杂交油菜“蜀杂9号”种子
纯度的RAPD鉴定. 四川大学学报, 42 (4): 874~876
陈忠明, 王秀娥, 赵彦, 杨开晴(2003). 两优培九种子纯度的RAPD
快速鉴定. 杂交水稻, 18 (4): 55~56
关荣霞, 刘燕, 刘章雄(2003). 利用SSR方法鉴定大豆品种纯度.
分子植物育种, 1 (3): 357~360
黄亚红, 方显出, 梁婉琪, 方平夷, 陈建秀, 张大兵(2002). 体细胞
培养获得的水稻农艺性状突变种及其 DNA RAPD 分析. 植
物生理学通讯, 38 (1): 30~32
刘冲, 薄天岳, 葛才林, 任云英, 陈锦秀(2005). 结球甘蓝RAPD
反应条件的优化. 上海农业学报, 21 (3): 114~117
柳李旺, 龚义勤, 黄浩(2004a). 新型分子标记——SRAP与TRAP
及其应用. 遗传, 26 (5): 777~781
柳李旺, 侯喜林, 龚义勤(2004b). 分子标记技术在蔬菜作物品种
鉴定与纯度检测中的应用. 分子植物育种, 2 (4): 563~
5 6 8
宋顺华, 郑晓鹰(2000). 利用RAPD标记纯度鉴定大白菜杂交种
纯度的研究. 华北农学报, 15 (4): 35~39
王关林, 方宏筠(1998). 植物基因工程原理和技术. 北京: 科学出
版社, 370~375
Hashiume T, Sato T (1993). Determination of genetic purity of
hybrid seeds in watermelon and tomato using RAPD. Jpn J
Breeding, 43: 367~375
Hu J, Vick BA (2003). Target region amplification polymorphism:
a novel marker technique for plant genotyping. Plant Mol
Biol Rep, 21: 289~294
Li G, Quiros CF (2001). Sequence-related amplified polymor-
phism (SRAP), a new marker system based on a simple PCR
reaction: its application to mapping and gene tagging in
Brassica. Thero Appl Genet, 103: 455~461
Li Z, Zhang X, Nie Y, He D, Wu M (2003). Construction of a
genetic linkage map for cotton based on SRAP. Chin Sci
Bull, 48 (19): 2063~2067