全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 5期，2007年 10月 913
富含多糖和次生代谢产物的白桦成熟叶中总RNA的提取
曾凡锁 1，南楠 1，詹亚光 2,*
东北林业大学 1生命科学学院，2林木遗传育种与生物技术教育部重点实验室，哈尔滨 150040
Extraction of Total RNA from Mature Leaves Rich in Polysaccharides and
Secondary Metabolites of Betula platyphylla Suk.
ZENG Fan-Suo1, NAN Nan1, ZHAN Ya-Guang2,*
1College of Life Science, 2Key Laboratory of Forest Tree Improvement and Biotechnology of Ministry of Education, Northeast
Forestry University, Harbin 150040, China
提要：分别采用CTAB法、SDS法、异硫氰酸胍法和缓冲液冰浴 -CTAB法从转基因白桦成熟叶中提取总RNA，并对琼
脂糖凝胶电泳和紫外光谱分析进行比较。结果表明，缓冲液冰浴 -CTAB法提取的总RNA纯度高、完整性好且得率高。应
用此法提取的总 RNA能够满足 RT-PCR和Northern杂交分析要求。
关键词：白桦；成熟叶片；RNA提取
收稿 2007-08-03 修定 　2007-09-03
资助 国家自然科学基金( 3 0 4 7 1 4 1 3 )和黑龙江省攻关课题
(GB06B303-8)。
* 通讯作者( E -m a i l：y o u p r a c t i s e @ 1 2 6 . c o m；T e l：
0 45 1-82 1 91 75 2)。
从植物组织中提取出纯度高、完整性好的
RNA是顺利进行分子生物学研究的关键所在(李宏
和王新力1999)。然而许多木本植物如白桦成熟叶
中含有大量的多糖、酚类化合物、蛋白质和某些
尚无法确定的次级代谢产物，这些物质的含量远
远高于幼嫩叶片，从而影响了总 RNA的提取(杨
传平等2002)。其中酚类物质是植物所特有的次生
代谢物，它很容易被氧化成褐色的醌类物质，醌
类物质与 RNA的不可逆结合，不仅会使 RNA的
活性丧失，而且在苯酚和氯仿抽提时还会使RNA
丢失，因此富含次生代谢产物的植物RNA提取一
直是RNA分析研究中的障碍。而相关研究报道的
植物总 RNA提取方法(Wang等 2005；Cheng等
1993；Verwoerd等 1989；Shirzadegan等 1991；
Ainsworth 1994)，都无法满足富含多糖和次生代
谢产物的白桦成熟叶中总RNA的提取。而一部分
研究(如对不同发育时期的转基因植物中外源基因
转录水平表达的研究)又必须以成熟组织为研究材
料。因此，应用适当的方法在富含多糖和次生代
谢产物的成熟组织中提取高质量的总RNA显得至
关重要。为了解决这一难题，本文以富含多糖和
次生代谢产物的转基因白桦成熟叶片为材料，针
对木本植物中总RNA提取方法进行了比较、改进
和优化。
材料与方法
1 材料
转基因白桦(Betula platyphylla Suk.)的成熟叶
片放在液氮中速冻后置于−80 ℃超低温冰箱中贮存
待用。
2 总RNA的提取方法
文中采用的 CTAB法、SDS法和异硫氰酸胍
法分别按照文献(杨传平等 2002；王玉成等 2006；
李志能等2007)中方法进行。缓冲液冰浴-CTAB法
中的 RNA提取缓冲液(1)为 100 mmol·L-1 Tris-HCl
(pH 8.0)、25 mmol·L-1 EDTA (pH 8.0)、1.4 mol·L-1
NaCl；RNA提取缓冲液(2)为 2% CTAB、100
mmol·L-1 Tris-HCl (pH 8.0)、25 mmol·L-1 EDTA (pH
8.0)、1.4 mol·L-1 NaCl。操作过程为：取 0.1~
0.5 g叶片置液氮中冷冻，研磨成粉，迅速置入
盛有 1 mL RNA提取缓冲液(1)的离心管中，颠倒
混匀，置于冰浴中 30~40 min，其间不断混匀，
防止样品结冻凝固于管底；于 4 ℃下以 12 000×g
离心 1 min，去上清液，加入 700 µL 65 ℃预热
的 RNA提取缓冲液(2)和 1/10体积巯基乙醇，震
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荡混匀，于 65 ℃下保温 10~15 min，加入 700 µL
的氯仿并震荡混匀，于 4 ℃下以 12 000×g离心 10
min；将上清液转移至一新的离心管中，重复抽
提 2~4次，直到分层交界处看不到白色絮状物为
止；将上清液转移至一新的离心管中，加入 1/2
倍体积 6 mol·L-1 LiCl和 1/2体积的无水乙醇，轻
微颠倒混匀后置于冰浴中 10 min；于 4 ℃下以
12 000×g离心 10 min沉淀为 RNA，上清液弃去，
用 70%的乙醇洗涤，置于冰上风干 2 min后加入
适量经焦碳酸二乙酯(DEPC)处理的去离子水溶解
沉淀；取少量用于琼脂糖凝胶电泳，其余置于
−80 ℃冰箱中保存备用。
3 RNA纯度及完整性检测
分别取 4 µL提取的样品 RNA 溶液，在 0.8%
非变性琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色，而后
在凝胶成像系统下观察并拍照。取 2 µL RNA溶
液稀释至 0.5 mL，用紫外 -可见分光光度计测量
A230、A260、A 280，并计算 A 260/A230、A260/A 280的
比值，确定其纯度，再计算得率。RNA得率(µg·g-1)=
(A260×40×稀释倍数 ×原液体积)/叶片鲜重(g)。
4 RT-PCR分析
用TaKaRa RNA PCR Kit (AMV) Ver.3.0试剂
盒，按其说明书在 PCR反应管中调制反应液及设
置反应条件。反应结束后，取 5~10 µL以 1.0%
琼脂糖凝胶电泳，剩余产物置于 4 ℃中保存。
5 Northern杂交分析
Northern杂交操作参照萨姆布鲁克和拉塞尔
(2002)书中方法并稍加修改。
实验结果
1 RNA样品质量检测
提取的RNA以0.8%非变性琼脂糖凝胶电泳检
测，如图 1所示，用 CTAB法、SDS 法以及异
硫氰酸胍法提取的总 RNA，其 28S和 18S条带不
明显，且点样孔中杂质较多，条带有明显的拖尾
且沉淀不易溶解，用 SDS法提取的样品还存在着
较严重的褐化，说明这几种方法不能有效去除多
糖和多酚等次生代谢产物。而用缓冲液冰浴 -
CTAB法提取的总 RNA，其 28S和 18S两条带带
型清楚，28S rRNA带的亮度明显高于 18S rRNA
带，2条带之间无弥散和拖尾，点样孔中无杂质
(图 1)，说明缓冲液冰浴 -CTAB法提取的总 RNA
比较完整，可去除多糖和多酚等次生代谢产物和
防止 RNase 的污染。
2 RNA样品纯度和得率
取 2 µL RNA样品用DEPC水稀释到 500 µL
后，用紫外分光光度法检测RNA浓度及纯度，测
得RNA的紫外光吸收值，每个波长重复测定 3次
取平均值。用缓冲液冰浴 - C T A B 法提取的总
RNA，其 A260/A280值为 2.090，说明 RNA纯度较
高，几乎无蛋白质污染；A260/A230值为 2.230，大
于 2，说明缓冲液冰浴 -CTAB法提取的总RNA几
乎没有多糖和酚类的污染。而用 CTAB法、SDS
法以及异硫氰酸胍法提取的总 RNA，其 A260/A280
分别为 1.284、0.862、1.200；A260/A230值分别为
1.325、0.356、1.046，均远小于 2.0，说明蛋
白质、多糖和酚类等代谢产物污染严重。缓冲液
冰浴-CTAB法提取的总RNA得率是每克叶片能够
分离到大约 134.0 µg的总 RNA (表 1)，是其他方
法的 1.5~1.6倍。说明采用此法提取的 RNA产量
也较高，而其他 3种方法不但杂质多、RNA纯度
低，而且得率也相对较低，效果很不理想。
3 RT-PCR分析
以缓冲液冰浴 -CTAB法提取的总 RNA为模
板，用转基因白桦外源基因 bt的上下游引物进行
RT-PCR扩增，能扩增出预期长度为 675 bp的片
段。电泳结果表明可成功地扩增出目的基因产物
(图 2)，说明用此法提取的总 RNA质量较好，可
用于 RT-PCR分析。
图 1 4种不同方法提取转基因白桦成熟叶中
总RNA电泳图谱比较
1、2：异硫氰酸胍法；3、4：缓冲液冰浴 - C T A B 法；
5、6：S D S 法；7、8：C T A B 法。
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4 Northern杂交分析
应用Northern杂交分析外源基因的转录表达
对总 R N A 的质量要求相对较高。因此，通过
Northern杂交也可进一步检验缓冲液冰浴 -CTAB
法能否提取出高质量的总 RNA。提取 6个转基因
白桦无性系的成熟叶中的总 RNA，以 gus报告基
因为探针进行杂交的结果(图 3)显示，杂交条带清
晰完整，进一步说明缓冲液冰浴 -CTAB法提取的
总 RNA质量较高，可以满足进一步研究的需要。
量降低，而且还会因为植物细胞内部结构的破坏
而产生内源性降解；时间过长则已释放的RNA酶
还有可能会产生活性而降解 RNA。因此这是能否
获得高质量 R N A 的最为关键性的一步(王玉成
2002)。
其次则应考虑如何去除多糖。近年来，有关
去除植物组织多糖和酚类物质的相关报道已很多，
但不同植物或同一植物的不同品种，往往由于种
属的差异，植物组织内的多糖或多酚的组分和含
量有很大不同(刘海等 2006)。所以需要采用不同
的RNA提取方法。Cheng等(1993)最早用CTAB提
取富含多酚等物质的松柏类植物中的 RNA。但
CTAB法通常要结合其他操作才能有效去除多糖，
常见的方法有低浓度乙醇沉淀法(Lewinsohn等
1994；Fang等 1992)、醋酸钾沉淀法(Bahloul和
Murkard 1993)、氯化锂沉淀法、提高缓冲液的氯
化钠浓度(Cheng等 1993)等。其中用氯化锂沉淀
RNA是RNA提取中的常用方法，此法制备的RNA
具有纯度高和无多糖等生物大分子共沉淀等优点
(Salzman等 1999)。但由于白桦成熟叶片中多糖等
次生代谢产物含量远远高于一般植物，采用上述
方法均不能获得理想的效果，主要是RNA沉淀中
仍有大量的多糖等次生代谢物无法去除，过多的
多糖所形成的粘稠胶状物会使后续操作无法进行。
因此，必须先去除细胞质中大部分多糖等次生代
谢物杂质，而后再提取总 RNA。本文将研磨好的
材料加入到不含 CTAB的提取缓冲液中冰浴 0.5 h
后的结果表明，用此法去除多糖等次生代谢产物
的效果较好。从缓冲液冰浴 -CTAB法提取的RNA
的纯度、RT-PCR检测和Northern杂交的结果中
不难看出，此法可有效去除多糖等次生代谢产物
杂质的干扰。另外，酚类物质极易导致褐化，因
此，抑制褐化现象的发生也是提取植物中RNA的
图 3 Northern杂交图谱
1 ~ 6：6 个不同的转基因白桦无性系。
表 1 RNA样品的纯度和得率
吸光度比值 RNA得率 /
提取方法 A230 A260 A280
A260/A280 A260/A230 µg.g
-1
CTAB法 0.026 0.042 0.026 1.284 1.325 84.8
SDS法 0.088 0.045 0.036 0.862 0.356 89.6
异硫氰酸胍法 0.031 0.040 0.027 1.200 1.046 81.6
缓冲液冰浴 -CTAB法 0.030 0.067 0.032 2.090 2.230 134.0
讨 论
要获得完整性好的RNA，植物细胞破胞必须
完全、迅速。细胞破碎不完全，不仅使 RNA产
图 2 RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图
0：空白对照；M：D N A M a r k e r；1：阳性对照；2：
以缓冲液冰浴 -CTAB法提取的总 RNA为模板的 RT-PCR产物。
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重要一环。一般用 SDS方法提取时，常出现极为
严重的褐化现象，而采用缓冲液冰浴 -CTAB法则
没有发生此种现象，可见，此法也可以有效地抑
制褐化效应。
缓冲液冰浴-CTAB法不但可以去除大部分多
糖等次生代谢产物杂质，而且其他杂质也可减
少，因此保证了 RNA的纯度。总之，本文方法
操作简单，耗时少，一般在 2 h左右就可完成全
部操作，这相对于常用的 RNA提取方法需 1~2 d
的时间来说，缩短了很多。
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