全 文 ：植物生理学通讯 第 40 卷 第 4期，2004 年 8 月474
分析植物组织中海藻糖的气质联用及毛细管气相色谱法
胡磊1 郭蓓2 王乐1 陆海1 陈雪梅1 蒋湘宁1,*
1 北京林业大学生物科学与技术学院，国家林业局树木花卉育种生物工程重点开放实验室，北京 100083；2 北京农学
院生物技术系，北京 102206
Methods of GC-MS and Capillary Gas Chromatography for Determining Tre-
halose in Plant Tissues
HU Lei1, GUO Bei2, WANG Le1, LU Hai1, CHEN Xue-Mei1, JIANG Xiang-Ning1,*
1The Ornamental Plant and Tree Breeding and Biotechnology Laboratory of National Forestry Administrative, College of Bio-
logical Sciences and Biotechnology, Beijing Forestry University, Beijing 100083; 2Department of Biotechnology, Beijing Agri-
cultural College, Beijing 102206
提要 介绍一种用 1- 甲基咪唑为溶剂和催化剂、盐酸羟胺和乙酸酐为肟化和乙酰化试剂，对植物样品中海藻糖等糖类
物质进行乙酰化衍生化后的气相色谱分离、质谱鉴定的分析方法。以核糖醇为内标，通过校准曲线对植物组织中的海藻
糖进行定量分析。此法测定海藻糖的最低量可达 8.17×10-11 g，适于植物样品中微量海藻糖的分析测定。
关键词 海藻糖；乙酰化；气质联用(GC-MS); 毛细管气相色谱(GC)
收稿 2003-09-22 修定 　 2004-02-16
资助　 国家重大基础研究“973”项目课题(G1999016005)
和国家自然科学基金项目(30271066)。
致谢 承北京林业大学仪器中心陈华君女士和邹祥旺先生给予
热情帮助。
*通讯作者(jiangxn@bjfu.edu.cn, Tel: 010-62338063)。
海藻糖是一种还原性双糖，由 2 个葡萄糖分
子通过半缩醛基结合而成，在藻类、细菌、真
菌、昆虫、脊椎动物、高等植物中广泛存在。
其分子式为C12H22O11，相对分子量为 342.33，通
常可以几种固体形式存在，最常见的是二水化合
物，熔点为 97℃，加热至 130℃时失去结晶水而
成为无水结晶体，此时熔点为 214~216℃[1]。海
藻糖理化性质稳定，对生物大分子有特殊保护作
用[2]，广泛应用于食品加工、医药卫生等行业。
近年来，众多研究发现，微生物和植物体内的海
藻糖具有渗透调节作用[2,3]，因而能提高植物抗逆
性。利用海藻糖这一特性进行作物和林木基因工
程定向改良已成为植物基因工程研究中的热点之
一，因而如何快速而准确地检测植物体中海藻糖
含量就成了这类研究得以进行的关键问题之一。
一般海藻糖分析的方法有纸层析法、薄层层
析法、高效液相色谱法和气相色谱及气相色谱-质
谱联用(气质联用，GC-MS)分析法[4~6]。前 2种方
法属定性方法，也可以用于海藻糖的半定量分
析，但定量效果不理想，低于 mg 量级就难以检
测。在分析植物组织中海藻糖含量时，因其含量
极低，这些方法无法准确定量。高效液相色谱法
是较理想的海藻糖定量分析方法，但当样品中糖
类组分较多时，其分离效果往往不如人意。气相
色谱法分析虽然具有速度快、灵敏度高等优点，
但要有两个前提：一是要有合适的衍生化方
法，二是要有较高的理论塔板数和良好的柱
效。本文建立了以 1- 甲基咪唑为溶剂和催化
剂，以盐酸羟胺和乙酸酐为肟化和乙酰化试
剂，对植物组织中的微量糖类物质进行衍生
化，以核糖醇为内标，通过毛细管气相色谱
法，对样品中各糖类组分和海藻糖衍生化产物
进行分离定量检测和气质联用技术定性的分析方
法。此法操作简便，灵敏度高，对糖类物质分
析专一性较好，干扰较小，适用于少量植物样
品中微量海藻糖的定性、定量分析。
材料与方法
1 材料和仪器
试剂：1-甲基咪唑(Sigma公司)、盐酸羟胺、
乙酸酐、无水硫酸钠(R.A); 糖和糖醇标准物：核
技术与方法Techniques and Methods
植物生理学通讯 第 40 卷 第 4期，2004 年 8 月 475
糖醇(Rib)、甘露醇(Man)、D-山梨醇(Sor)、D-葡
萄糖(Glu)、蔗糖(Suc)、海藻糖(Tre)。以上标准
物均为分析纯。
标准溶液：Rib 40 mg·mL-1、Man 40 mg·mL-1、
Sor 40 mg·mL-1、Glu 40 mg·mL-1、Suc 8 mg·mL-1、Tre
25 mg·mL-1、盐酸羟胺 100 mg·mL-1，均以 1- 甲
基咪唑为溶剂。
仪器：Varian CP-3800型气相色谱仪、VOY-
A G E R 气相色谱 - 质谱仪、真空浓缩仪等。
2 方法
2.1 毛细管气相色谱和GC-MS分析与检测条件 美
国 Varian公司 CP-3800型气相色谱仪，FID检测
器，检测器温度为300℃，进样器温度250℃，BP-
15柱( 30 m×0.25 mm×0.25 mm)，N2、H2、空气。
柱箱温度条件：初始温度50℃，15℃·min-1升温到
220℃，保留3 min；25℃·min-1升温到280℃，
保留10 min。
VOYAGER GC/MS 仪，TRACE GC 仪，检
测器温度为300℃，进样器温度为250℃，BP-15
柱(30 m×0.25 mm×0.25 mm)，载气He 0.8 mL·min-1。
柱箱温度条件：初始温度50℃，20℃·min-1 升温
到200℃，10℃·min-1升温到280℃，保留10 min。
2.2 海藻糖等糖类物质的乙酰化及校准曲线制作 分
别取2.5 mL甘露醇、2.5 mL山梨醇、4 mL葡萄
糖、20 mL蔗糖、8 mL海藻糖母液放入同一反应
管中后，加入 50 mL 盐酸羟胺母液，充分混匀，
置于80℃水浴中反应5 min，取出后加入40 mL乙
酸酐，混匀，于室温反应 5 min 后加入 1 mL 氯
仿萃取衍生化产物，以 2 mL 水洗 3~4 遍，除去
水相后用无水硫酸钠吸收残余水分。同法对2 mL
核糖醇母液进行衍生化。将糖与糖醇混合衍生物
用氯仿逐级稀释成 5 个梯度浓度，分别封装于毛
细管中，加入核糖醇乙酰化衍生物作为内标，内
标终浓度为0.01 mg·mL-1。将制备好的标准样品用
于毛细管气相色谱分析，为对各组分进行准确定
性，将其中一个样品用于气质联用分析。最后借
助Agilent公司提供的分析软件，处理毛细管气相
色谱分析结果，得到海藻糖的校准曲线，用作样
品中海藻糖的定量分析。
2.3 植物组织中海藻糖的提取与分析 取0.02~0.5 g
毛白杨、刺槐等组培苗鲜样(分根、茎、叶)，加
入20 mg(5 mL 4 mg·mL-1 Rib水溶液)内标，液氮下
研磨成细碎粉末或加少许石英砂，研磨至匀浆，
加入1~4 mL 碳水化合物抽提液(甲醇∶氯仿∶水=
12∶5∶3) [7,8]，随后加入等体积水，混匀，静
置片刻，将上清液过滤转入浓缩瓶中，于70~80℃
下抽真空浓缩至干。待其冷却后加少许1-甲基咪
唑溶解浓缩物，加入 0.1 mL 盐酸羟胺溶液，混
匀后置于80℃水浴中反应5 min；取出加入0.15
mL 乙酸酐，混匀后于室温下反应5 min，再加入
1 mL氯仿萃取衍生化产物，然后用2倍体积水洗
3~4 遍，以无水硫酸钠吸去残余水分后，转移封
存于毛细管中，准备用于毛细管气相色谱分离检
测和 GC-M S 结构鉴定分析。结合内标、校准曲
线和植物样品的毛细管气相色谱结果，对样品中
海藻糖进行定量分析。
实验结果
1 质谱鉴定和毛细管气相色谱分离
用于气质联用的气相色谱条件与毛细管气相
色谱分析条件相近，但是二者升温程序稍有出
入，故其保留时间有一定偏差。图 1 是糖和糖醇
标准物总离子流图。从各标准物的保留时间和对
应的质谱图及其结构鉴定结果可知，图 1 中各峰
依保留时间分别为核糖醇、葡萄糖、甘露醇、山
梨醇、蔗糖和海藻糖的乙酰化产物。海藻糖 GC-
MS 保留时间为19.40 min。图 2为海藻糖乙酯质
谱鉴定图谱。依据各糖和糖醇乙酰基衍生物在
GC-MS 总离子流中的出峰顺序和毛细管气相色谱
的分离色谱图，可以确定各糖和糖醇乙酰衍生化
产物在毛细管气相色谱分离结果中各物质的保留时
间(图 3)。其中海藻糖乙酯保留时间为 23.093
min。GC- MS 及毛细管气相色谱分析结果表明，
在所用分析条件下，海藻糖等糖类物质的乙酰化
产物能很好地得到分离。甘露醇与山梨醇互为同
分异构体，尽管结构上只有细微的差别，但二者
仍能完全分离。据此认为，应用此法对海藻糖等
糖类物质进行定性分析是准确可靠的。
2 海藻糖的校准曲线
将5 个梯度浓度标准样品混合物用于毛细管
气相色谱分析，调出 5 个气相色谱图，输入相应
的海藻糖浓度和内标量，借助相应的分析软件，
即可自动生成所要的校准曲线(图4)。所得海藻糖
校准曲线相关系数为0.994，可依据该曲线对样品
植物生理学通讯 第 40 卷 第 4期，2004 年 8 月476
图2 19.40 min处检出物的质谱图与海藻糖乙酯的标准质谱(A)及其结构图(B)
图1 糖与糖醇标准物乙酰化产物总离子流
中的海藻糖进行定量分析。
3 植物样品中海藻糖的定量分析
植物体内海藻糖的积累与海藻糖合成酶和海
藻糖酶有密切关系，海藻糖合成酶负责海藻糖的
合成，海藻糖酶降解植物体内的海藻糖。有证据
表明，大多数植物体内存在这两类酶的相应基
因[9,10]，但往往由于海藻糖酶的存在，以致植物
体内最终没有海藻糖的积累或者只有微量的海藻糖
积累，而且同一种植物可能还会因生长环境不同
和季节不同或是组织部位不同，海藻糖含量有一
定差异[10,11]。在我们所测定的毛白杨和刺槐样品
中，只含有少量海藻糖。图 5 是毛白杨组培苗根
中碳水化合物乙酰化衍生物毛细管气相色谱图，
其中海藻糖含量为0.0083 mg·g-1 (FW)。实验所用
的气相色谱仪噪音峰高为14 mV，系统确认3倍峰
高为各物质最小检测量。根据最佳衍生化条件下
海藻糖所出峰高和样品浓度、进样量和分流比计
算出海藻糖的最低检测量为8.17×10-11 g。此法可
对植物样品中的微量海藻糖准确定量。
植物生理学通讯 第 40 卷 第 4期，2004 年 8 月 477
图4 海藻糖的校准曲线
图5 毛白杨组培苗根中糖与糖醇毛细管气相色谱分析
图3 糖与糖醇标准物乙酰化产物毛细管气相色谱分析
讨　　论
以1-甲基咪唑为溶剂和催化剂对糖醇类物质
进行乙酰化具有速度快、衍生化产物单一等优
点，气质联用技术能对其快速定性。在合适的分
析条件下，用毛细管气相色谱能得到糖与糖醇乙
酰化衍生物理想的分离和定量结果。
已有许多试验证实植物体内积累的海藻糖有
利于植物抵御诸如干旱、高盐、寒冷等恶劣环
境[3,12]。但目前对其作用机制的研究仍处于探索阶
段。植物体内海藻糖与植物抗逆性的关系是一个
值得研究的问题，除了少数几种更苏植物组织中
海藻糖含量相对较高以外，大多数植物体内含量
均非常低微[13]，要得到准确的海藻糖含量必须慎
重对待从海藻糖的抽提到最后的进样分析整个过程
中的每一步操作。加入内标后，研磨时应尽量避
免样品损失。虽然内标法可以降低由于损失引起
的误差，但研磨时样品和内标损失的比例往往不
同，这样就无法保证其定量的准确性。糖醇类物
植物生理学通讯 第 40 卷 第 4期，2004 年 8 月478
质抽提完毕后，我们采取过滤方法获得糖醇类物
质的混合溶液(也可在1 000×g离心5 min后取上清
液)，直接浓缩、衍生化，最后上机分析。对于
柱效好的色谱分析来说，这样做可以得到理想的
分离结果。如果用一般的填充柱或理论塔板数低
的色谱柱，有些物质可能会无法完全分离。有人
采用增加纯化操作的方法来解决这一问题[7]，虽
然繁琐一些，但也是可取的。
本法应用气相色谱专用分析软件得到海藻糖
校准曲线，也可通过这一分析系统直接得到海藻
糖的定量结果。如果这些条件不具备，根据内
标、内标峰面积、海藻糖的梯度浓度和不同浓度
海藻糖对应的峰面积，通过常用的分析软件也一
样可以得到理想的校准曲线和定量结果。
总之，本法操作简单，衍生化反应迅速，最
低检测量达到了ng量级，适于植物组织中微量海
藻糖的分析，也适于食品营养、医药卫生等行业
中海藻糖的定性、定量分析。
参考文献
1 张树珍.海藻糖的研究进展及其应用前景.华南热带农业大学
学报,2000,6(3):22~29
2 Crowe JH, Crowe LM, Chapman D. Preservation of membranes
in anhydrobiotic organism: the role of trehalose. Science, 1984，
223:701~703
3 Bhandal IS. Trehalose as cryoprotectant for freeze preservation
of carrot and tobacco cell. Plant Physiol,1985,78:430~432
4 毛忠贵,朱利丹,邓绍荣.用薄层层析法分析海藻糖.无锡轻工业
大学学报,1997,16(4):42~44
5 Masao S, Shoichi K. Analyses of a-linded disaccharides of D-
glucose by high performance liquid chromatography. Carbohyd
Res,1991,215:203~209
6 Fiehn O, Kopka J, Trethewey RN et al. Identification of uncom-
mon plant metabolites based on calculation of elemental com-
positions using gas chromatography and quadrupole mass
spectrometry. Anal Chem,2000, 72:3573~3580
7 Tarczynski MC,Jensen RG,Bohnert HJ. Expression of a bacte-
rial mtlD gene in transgenic tobacco leads to production and
accumulation of mannitol.Proc Natl Acad Sci USA,1992,89:
2600~2604
8 王慧中,黄大年,鲁瑞芳等.转mtlD/gutD双价基因水稻的耐盐
性.科学通报,2000,45(7):724~729
9 Vogel G, Aeschbacher RA, Müller J et al.Trehalose-6-phosphate
phosphatases from Arabidopsis thaliana: identification by func-
tional complementation of the yeast tps2 mutant. Plant J,1998,
13(5):673~683
10 Goddijn OJM , Verwoerd TC , Voogd E et al. Inhibition of tre-
halase activity enhances trehalose accumulation in transgenic
plants. Plant Physiol,1997,113:181~190
11 Vogel G, Feihn O, Louis Jean-Richard-dit-Bressel et al. Treha-
lose metabolism in Arabidopsis: occurrence of trehalose and
molecular cloning and characterization of trehalose-6-phosphate
synthase homologues. J Exp Bot,2001,52(362):1817~1826
12 Garcia AB, Engler JdA , Iyer S et al. Effects of osmoprotectants
upon NaCl stress in rice. Plant Physiol,1997,115:159~169
13 Goddijn O,Smeekens S.Sensing trehalose biosynthesis in plants.
Plant J,1998,14(2):143~146