全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第2期，2006年4月288
刺五加幼叶原生质体的分离法
邢朝斌1 沈海龙2,* 赵星宇1 刘岩1 黄剑2 范少辉3
1华北煤炭医学院生物科学系，河北唐山 063000；2 东北林业大学林学院，哈尔滨 150040；3 中国林业科学研究院林
业研究所，北京 100091
Method for Isolation of Protoplast from Young Leaves of Eleutherococcus
senticosus (Rupr. Et Maxim) Harms
XING Zhao-Bin1, SHEN Hai-Long2,*, ZHAO Xing-Yu1, LIU Yan1, HUANG Jian2, FAN Shao-Hui3
1Department of Biology, North China Coal Medical College, Tangshan, Hebei 063000, China; 2College of Forestry, Northeast
Forestry University, Harbin 150040, China; 3Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China
提要 将室内盆栽的刺五加幼苗叶片以含 1% 纤维素酶和0.5% 果胶酶的酶解液酶解 6 h 后，其游离原生质体的产量和活性
分别为 2.22×105 个 ·g-1 (FW)和 92.8%，酶解液中加入的渗透压稳定剂 —— 甘露醇浓度以 0.5 mol·L-1 为最适宜。
关键词 刺五加；幼叶；原生质体；分离
收稿 2005-09-01 修定　 2006-02-14
资助 国家“十五”科技攻关计划子课题(2001BA510B0801)。
*通讯作者(E-mail: shenhl-cf@nefu.edu.cn, Tel: 0451-
82191044)。
刺五加[Eleutherococcus senticosus (Rupr. Et
Maxim) Harms]是我国医药珍品，根、茎、叶均
可入药(黑龙江省祖国医药研究所1981)。历代本
草医药记载，其有益气健脾、补肾安神之功效，
已载入《中华人民共和国药典》 (1977年版)。自
上个世纪70年代末以来，以刺五加为原料生产的
各种制剂和饮料等产品远销国外，以致刺五加的
资源消耗与日俱增( 黑龙江省祖国医药研究所
1981；祝宁等 1998)。在自然状态下，刺五加的
有性生殖能力弱(祝宁等1998；Dulin 2002)、无
性繁殖困难(赵淑兰和沈育杰2003)，1992年出版
的《中国植物红皮书》已把刺五加列为濒危物
种。目前，对刺五加的研究主要集中在化学成
分、药理、药性等方面(杨春花等 2004)，虽有
少数涉及体细胞胚胎发生的报道(Choi 等 1999，
2002)，但再生体胚多因无休眠特性而过早萌发，
因而不能应用于生产。原生质体是开展大规模悬
浮培养生产药用植物次生代谢产物的理想材料，
也是遗传转化的理想受体。本文探讨刺五加幼叶
的原生质体制备条件，为今后刺五加原生质体的
大规模悬浮培养和遗传转化建立技术基础。
材料与方法
刺五加[Eleutherococcus senticosus (Rupr. Et
Maxim) Harms]幼苗取自东北林业大学帽儿山实验
林场。经 2 个月室内盆栽驯化长出幼叶后，取作
为实验材料。
将2-N- 吗啉乙烷磺酸(MES)溶解在含有一定
浓度甘露醇的细胞-原生质体清洗液(cell-protoplast
washing, CPW)中，再将纤维素酶(cellulase,
Onozuka R-10)、果胶酶(pectinase, Fluka)溶解在
其中，并用 CPW+ 甘露醇液定容，制成混合酶液
(各成分浓度见表1)。酶完全溶解后，调节pH值
为5.7，然后以直径为0.45 mm的微孔滤膜过滤灭
菌后备用。
刺五加幼叶用洗洁精清洗 1 次后于流水中冲
洗10 min，而后用70% 酒精消毒30 s，再以10%
H2O2 浸泡 10 min，最后用无菌水冲洗3次。在无
菌操作台上，用滤纸吸干叶片上的水滴，称取1 g，
将其用解剖刀切成 0.5~1 mm 宽的小条，置于盛
有10 mL 酶解混合液的培养皿(直径 7.5 cm)中，
放在(26±1)℃的暗中轻轻摇动(50 r·min-1)酶解。在
表1 混合酶液中各成分的浓度
成分 浓度
纤维素酶 1 % 、2 % 、3 %
果胶酶 0.5%、0.8%
甘露醇 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mol·L-1
M E S 5 mmol·L-1
CaCl2·2H2O 1 320 mg·L-1
K H 2P O 4 ·H 2O 100 mg·L-1
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原生质体酶解过程中，每隔 2 h，取样以倒置显
微镜观察 1 次，以观察到原生质体平均密度较前
2 h不再增加为最适酶解时间。以最适酶解时间所
观察的酶解液与游离原生质体混合液中原生质体占
原生质体、细胞团和单细胞总含量的百分比来判
别酶解条件的优劣。酶解充分后，用50 mm (300
目)孔径的尼龙网过滤酶解分离的原生质体，滤液
放在10 mL的尖底离心管中，以500 r·min-1 离心
5 min，弃去上清液，再用 CPW-9M (含 9% 甘
露醇)溶液洗涤2次，将留下的原生质体悬浮于2
mL CPW-9M 溶液中，然后另取 1 只 10 mL 的尖
底刻度离心管，加入 8 mL CPW-21S (含 21% 蔗
糖)，在此液面上缓缓加入上述的 2 mL 原生质体
悬浮液，再以500 r·min-1 离心 5 min。这时，在
2 个液面间出现一条绿色原生质体带，用吸管小
心地吸出漂浮于溶液界面间的原生质体。最后用
原生质体培养液清洗 1 次，即可获得纯化的刺五
加幼叶原生质体。
取少量上述原生质体悬浮液滴加在0.1 mm血
球计数板上，当原生质体充满计数室后，在显微
镜下计数，计算 4 个角上和中央中格内的原生质
体数，产量单位为：个(原生质体)·g-1 (幼叶)。原
生质体活性用 0.1% Evans 蓝染色测定(唐克轩
2005)，存活率计算公式为：存活率 =(未蓝染细
胞数/细胞总数)×100%；有活力原生质体产量计
算公式为：有活力原生质体产量=原生质体产量 ×
存活率；原生质体完整率计算公式为：原生质
体完整率= (完整原生质体数量/ 原生质体总量) ×
1 0 0 % 。
实验结果
1 不同酶的浓度组合对原生质体解离的影响
表2 表明，随着酶浓度的提高，原生质体的
产量和活力均有不同程度的下降。纤维素酶浓度
以 1% 为宜，较高浓度(2%、3%)的纤维素酶对游
离原生质体产量均有不良影响。果胶酶浓度则以
表2 不同酶的组合对刺五加幼叶原生质体分离的影响
纤维素酶浓度/% 果胶酶浓度/% 原生质体产量/ 原生质体存活率/% 有活力原生质体产量/ 细胞碎片 ×105个·g-1 (FW) ×105个·g-1 (FW)
1 0.5 2.22 92.8 2.06 很少
2 0.5 0.82 89.5 0.73 少
3 0.5 0.53 82.8 0.44 多
1 0.8 1.06 93.6 0.99 很少
2 0.8 1.14 81.1 0.92 较多
3 0.8 0.79 47.4 0.37 很多
　　表中数据为(26±1)℃、黑暗条件下酶解 6 h 后观察的结果。
0.5%较为合适。酶解液中酶的总浓度过高时，原
生质体碎片急剧增多，完整原生质体的比率显著
下 降 。
2 不同浓度甘露醇对原生质体解离的影响
在不同浓度渗透压稳定剂 ——甘露醇下，1%
纤维素酶和0.5%果胶酶酶解刺五加幼叶的游离原
生质体产量明显不同(图1)。在0.3~0.5 mol·L-1的
甘露醇范围内，原生质体的产量和活性明显上
升，0.5 mol·L-1 时产量达到最大[2.22×105个 ·g-1
(FW)]，活性为 92.8%，在 0.5 和 0.6 mol·L-1
(90.7%)间活性差异不大。随着甘露醇浓度的进一
步升高，其产量和活性急剧下降，产量最终维持
在0.6×105个 ·g-1 (FW)左右，活性则下降到77.4%。
因此认为，以用0.5 mol·L-1的甘露醇作为渗透压
稳定剂较为适宜。
3 不同酶解时间对原生质体解离的影响
用1% 纤维素酶和0.5% 果胶酶组合对刺五加
幼叶进行不同时间酶解的结果显示，酶解2 h时，
只有极少量的原生质体释放；随着酶解时间的延
长，原生质体产量逐渐增高，酶解6 h 时，其产
量达到最高；酶解 8 h 时的原生质体产量又逐渐
下降，酶解液中的碎片开始增多，活性下降(图
2)。由此可见，酶解时间以 6 h 为最佳，此时应
及时收集与纯化原生质体。
4 原生质体的显微镜观察
从图3-a 可见，新分离的刺五加原生质体呈
球形，淡绿色，细胞质稠密，并含有颗粒内含
物，叶绿体清晰可见。酶解液浓度越低，原生
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图1 甘露醇浓度对刺五加幼叶原生质体解离的影响
数据为(26±1)℃、黑暗条件下酶解 6 h 后统计。
图2 酶解时间对刺五加幼叶原生质体游离的影响
　　0.5 mol·L-1甘露醇为渗透压时，(26±1)℃下处理不同时间的
统计结果。
质体越分散，但酶解液浓度过高会使原生质体变
形或破裂(图 3-b)。
讨 论
影响原生质体产量和活性的因素有多种，如
植物材料的生理状态、解离原生质体的酶组合及
其浓度配比、酶解时间和酶解液的渗透压等(唐克
轩2005)。其中影响较大的因素是酶的组合及浓度
和酶解时间。若酶液浓度大，酶解时间就应缩
短，但原生质体破裂数也随之增多；反之，酶
解时间长也会导致较早游离出来的原生质体破裂。
本文仅选用室内盆栽驯化刺五加幼苗的幼叶解离原
生质体的结果表明，刺五加的幼叶以用 1% 纤维
素酶和0.5%果胶酶的酶解液进行酶解6 h的游离
原生质体的产量和活性较高。渗透压稳定剂的作
用主要是维持原生质体内外环境的渗透压相对稳
定，从而保持质膜的稳定。在已建立的各种植物
原生质体分离系统中，适宜的酶液渗透压的使用
范围为0.23~0.90 mol·L-1 (Evans和Bravo 1986)，
本文中分离刺五加幼叶原生质体时所采用的甘露醇
浓度以0.5 mol·L-1较为适宜。
参考文献
黑龙江省祖国医药研究所著(1981). 中国刺五加研究. 哈尔滨: 黑
龙江科学技术出版社, 5~12
唐克轩(2005). 中草药生物技术. 上海: 复旦大学出版社, 62~67
杨春花, 刘刚, 张崇禧, 郑友兰(2004). 刺五加的研究进展. 人参
研究, 16 (1): 17~21
赵淑兰, 沈育杰(2003). 刺五加绿枝扦插繁殖研究. 特产研究, 3:
1~2
祝宁, 卓丽环, 臧润国(1998). 刺五加会成为濒危种吗? 生物多样
性, 6 (4): 253~259
Choi YE, Lee KS, Kim EY, Kim YS, Han JY, Kim HS, Jeong JH,
Ko SK (2002). Mass production of Siberian ginseng plantlets
through large-scale tank culture of somatic embryos. Plant
Cell Rep, 21: 24~28
Choi YE, Yang DC, Yoon ES (1999). Rapid propagation of
Eleutherococcus senticosus via direct somatic embryogenesis
from explants of seedlings. Plant Cell Tiss Org Cult, 58:
93~97
Dulin AF (2002). Change in the horm onal status of ovaries and
depth of dormancy of Siberian ginseng (Eleutherococcus
senticosus) seeds under the effect of epin. Russ Agr Sci (Се
льскохозяйственная Наука), 10:
9~12
Evans BA, Bravo JE (1986). Protoplast isolation and culture. In:
Evand DA, Sharp WR (eds). Handbook of Plant Cell and
Tissue Culture. New York: Macmillan
图3 解离的刺五加原生质体
a ：新分离的原生质体，箭头所示部分为叶绿体；b ：破碎的原生质体。