全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 3期，2007年 6月438
红树林植物木榄水通道基因的克隆和表达
祝艺懿 1，韩渊怀 1，李正国 1，陈国平 1，Donald Grierson2，殷幼平 1,*
1重庆大学生物工程学院基因工程研究中心，重庆市高校功能基因及调控技术重点实验室，重庆 400044；2Plant Sciences
Division, University of Nottingham, Britain
提要：根据植物水通道基因保守区设计简并引物，采用RT-PCR方法，从木榄树叶中分离出水通道基因的 cDNA片段；
3 RACE获得 3端 cDNA序列；再经 5 RACE获得 5端部分 cDNA序列，命名为 PIP2，GenBank登录号为 EF126757。该
基因全长 843个碱基，编码 281个氨基酸，具有典型的植物水通道基因结构。该基因编码的蛋白质与含羞草(PIP2;5)、欧
洲葡萄(PIP)、拟南芥(PIP3)等水通道蛋白的同源性分别为 90%、91%、88%。Northern杂交分析表明，该基因在木榄树不
同器官中的表达差异明显：根部有较高的表达水平，茎部较弱，而在叶中只能检测到微弱的信号。
关键词：木榄；水通道基因；NPA盒；基因表达
Cloning and Expression of a New Aquaporin Gene from Bruguiera gymnorhiza
(L.) Lam
ZHU Yi-Yi1, HAN Yuan-Huai1, LI Zheng-Guo1, CHEN Guo-Ping1, Donald Grierson2, YIN You-Ping1,*
1Key Laboratory of Functional Gene and Regulation Technologies, Chongqing Municipal Education Commission, Genetic Engi-
neering Research Center, College of Bio-Engineering, Chongqing University, Chongqing 400044, China; 2Plant Sciences Division,
University of Nottingham, Britain
Abstract: The aquaporin (AQP) gene of Bruguiera gymnorhiza, named PIP2 (plasma membrane intrinsic
protein 2), was cloned from leaf by the methods of RT-PCR, 3 rapid amplification of cDNA ends (RACE) and
5 RACE using degenerate primers designed according to the conserved region of aquaporin protein family.
GenBank accession number was EF126757. This gene contained an open reading frame (ORF) of 843 bp
coding a polypeptide 281 amino acids. The predicted amino acid sequence of PIP2 show 90% sequence identity
to AQP PIP2;5 (Mimosa pudica), 91% to PIP (Vitis vinifera), 88% to PIP3 (Arabidopsis thaliana), respectively.
Northern-hybridization showed that the expression of PIP2 was significantly different in different organs. The
transcription level of PIP2 in root was significantly higher than that in stem and leaf, respectively.
Key words: Bruguiera gymnorhiza; aquaporin gene; NPA-box; gene expression
收稿 2007-01-04 修定 　2007-05-08
* 通讯作者(E-ma il：yinyou ping@cqu.edu .cn；T el：
02 3-65 12 04 89 )。
植物水通道蛋白(aquaporin，AQP)在植物体
内形成水选择性通道，在植物种子萌发、细胞生
长、气孔运动、受精等过程中调节水分的快速跨
膜运输，有些水通道蛋白还在植物逆境应答中起
作用(于秋菊等 2002)。根据水通道蛋白的亚细胞
定位，结合序列同源性，所有植物的水通道蛋白
均分为质膜上质膜内蛋白(plasma membrane intrin-
s ic proteins，PIPs)、液泡膜上液泡膜内蛋白
(tonoplast intrinsic proteins，TIPs)及类结瘤蛋白
(nodulin- like MIPs，NLMs)三大类(张军锋等
2002)。此外，Chaumont等(2001)研究玉米膜内
蛋白(membrane intrinsic proteins，MIPs)结构与分
类时，发现一类新的MIP，即 SIP。其序列与 PIP
和MIP 相似，但在细胞中的定位和功能了解较
少。水通道蛋白家族具有保守的结构模式，含有
6个跨膜的螺旋区和 2个膜内区，其 N端和 C端
都在胞内，水通道蛋白具有其特定的特征基序
NPA (NPG)，该基序被认为与水通道蛋白的功能
密切相关(Park和 Saier 1996)。植物水通道蛋白广
泛分布于各种组织和器官，存在于发育的各个时
期，暗示它在整个生命活动中的地位重要。
木榄属于红树科木榄属，生长于热带和亚热
带陆海交汇的海湾河口潮间带。它在维护海岸生
态平衡，防风减灾，护堤保岸，环境污染监测、
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净化与防治中均起作用。近 10年中，对红树林
植物的研究主要集中在生理和生态特点上，作为
一种生长在高盐、高渗透压下的盐生木本植物，
有关木榄水通道基因表达分析的报道几乎没有。
本文采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplifica-
tion of cDNA ends，RACE)，从木榄叶中克隆出
一个水通道基因，命名为 PIP2 (plasma membrane
intrinsic protein 2)，并用Northern杂交方法对其
在各部位表达情况作了检测，现报道如下。
材料与方法
木榄[Bruguiera gymnorhiza (L.) Lam]采自福
建龙海浮宫(24o24 )红树林自然保护区，摘取同一
母树上发育良好、无病虫害和机械损伤的叶、嫩
茎、主根和侧根，液氮处理后，于-80 ℃下冻存备
用。大肠杆菌(Escherichia coli)菌株为 JM109。质
粒载体为 pMD18-T Vector，衍生自 pUC18，用
于 PCR产物的 T/A克隆[宝生物工程(大连)有限公
司]。
总 RNA的提取采用 CTAB-LiCl法(方孝东等
1998)，稀释 50倍后，用岛津 4500分光光度计
测其 230、260和 280 nm处的OD值，并取 2 µL
用 1%琼脂糖凝胶电泳检测提取质量。
根据GenBank中登录的其他植物水通道蛋白
基因保守序列设计简并引物：引物 S，5 CTT-
GTTTACTGCACTGCYGGHAT 3；引物A，5
CCCAGAADATCCANTGDTCATCCCA 3。用M-
MLV反转录酶进行反转录。然后以反转录液为模
板，用引物 S和引物 A进行 PCR反应，反应条
件为：94 ℃ 5 min预变性后，94 ℃ 30 s、52 ℃
30 s、72 ℃ 30 s循环 30次，72 ℃ 延伸 10 min。
1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，回收 478 bp简并引
物合成片段，克隆到 pMD18-T Vector，测序(上
海英骏生物技术公司)。
获取 3端 cDNA片段时，取 1~2 µg木榄幼叶
总 R N A，用引物 Z 9 ( 5 T G G A T C C G C T G -
AAACTCTAGGT19 3，包含有 BamHI酶切位点的
PolyT引物)反转录合成 cDNA第一条链，以此链
为模板进行 P C R 扩增。5 端引物为 i - F：5
TCCGCTACCGATCCCAAG 3；3端引物为 Z10：
5 TGGATCCGCTGAAACTCTAGGT 3。PCR条
件为：94 ℃ 5 min预变性后，94 ℃ 30 s、56 ℃ 30 s、
72 ℃ 45 s循环 30次，72 ℃终延伸 10 min。1.5%
琼脂糖凝胶电泳检测，回收 546 bp 3端延伸片
段，克隆到 pMD18-T Vector，测序(上海英骏生
物技术公司)。
5端 cDNA片段获取，采用 TaKaRa公司 5-
Full RACE Core Set试剂盒，以木榄幼叶总 RNA
为模板，以 5 端磷酸化的 R T 引物 ( 5
pCAGAAGATCCATTG 3 )反转录合成 cDNA的第
一条链，然后用 RNase酶除去 RNA，用 RNA连
接酶形成首尾连接物。第一次 PCR用基因特异的
内引物 S1 (5 TGCCCTTGTTGTAGCCAG 3 )和A1
(5 TCCGCTACCGATCCCAAG 3 )扩增。取第一
次PCR反应产物，分别稀释10和100倍作为模板，
以基因特异引物 S2 (5 CAAGAATAAGCCG-
AAAGTGA 3 )和A2 (5 TCCACAACAATGACAAAAT
3)扩增，回收 394 bp 5 端延伸片段，克隆到
pMD18-T Vector，测序(上海英骏生物技术公
司)。
Northern杂交时，取-80 ℃下冻存的叶、嫩
茎、主根及侧根样品，均按 1.2的方法分别抽提
其总RNA，各取 20 µg上样，经甲醛凝胶电泳后，
用毛细管转移法转移至尼龙膜上，将简并引物合
成的DNA片段以 32P进行标记，制备探针进行分
子杂交。杂交程序按 Sambrook等(1996)书中的方
法进行。
结果与讨论
1 全序列分析
序列(图 1)分析表明，该片段全长 1 068 bp，
包含一个 843 bp完整开放阅读框(open reading
frame，ORF)，编码 281个氨基酸。5端非编码
区和 3端非编码区分别为 24和 201 bp。从起始氨
基酸甲硫氨酸(M)开始，在第 100和 221氨基酸处
发现 2个NPA盒，在 90和 95氨基酸处分别存在
对汞敏感氨基酸 Cys-90和水通道基因高度保守序
列 SGXHXNPAVT。
2 同源性分析
将推测的氨基酸序列在NCBI上进行 Blast X
搜索，发现它属于 PIP基因亚家族 II类，与含羞
草(Mimosa pudica，PIP2;5，BAD90701)、欧洲
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葡萄(Vitis vinifera，PIP，ABH09327)、拟南芥
(Arabidopsis thaliana，PIP3，NP195236)氨基酸
水平的同源性分别为 90%、91%、88%。同源
性比较结果表明，这几类物种该基因的NPA盒、
汞敏感 Cys残基、高度保守序列都处于相同或相
近位置。该基因已命名为 PIP2并提交GenBank，
登录号为 EF126757。结果见图 2。
3 木榄不同器官中PIP2基因的表达
提取木榄叶、嫩茎、主根及侧根样品的总
RNA，以 32P标记简并引物合成的DNA片段为探
图 1 木榄 PIP2基因 cDNA核苷酸序列及其推测的氨基酸序列
Fig.1 The nucleotide sequence of B. gymnorhiza-PIP2 cDNA and deduced amino acid sequence
下划线表示引物位置，阴影部分表示汞敏感氨基酸 C ys 和 N PA -b ox，虚线下划线表示水通道基因高度保守区。
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针，进行 Nor thern分析，结果如图 3 所示。
在总RNA量基本一致的条件下，木榄侧根和
主根中 PIP2基因的Northern检测信号差异不大，
但明显强于嫩茎和叶。
图 2 木榄 PIP2基因与其他物种 PIP基因氨基酸序列比较
Fig.2 Amino acid sequence alignment of B. gymnorhiza-PIP2 and PIP from other plants
黑色背景表示序列一致的氨基酸残基，灰色背景表示序列保守的氨基酸残基。
图 3 木榄 PIP2基因在不同器官中的表达
Fig.3 The expression of B. gymnorhiza-PIP2 in different organs
a：N o r t h e r n 杂交；b：总 R N A 电泳。1：主根；2：侧根；3：嫩茎；4：叶。
讨　　论
在植物中，水通道蛋白直接参与根部水分吸
收及整个植物的水平衡。由于水通道蛋白的存
在，细胞才可以快速调节自身体积和内部渗透
压。由此可见，水通道蛋白对于生命活动至关重要。
本文从红树植物木榄叶中克隆出一个全长水
通道基因，通过同源性比对，该基因属于 PIP亚
家族 II类。大多数水通道蛋白均有一个对汞敏感
的残基 Cys，位于氨基酸序列的 189位，其临近
的NPA盒结合汞后水孔受阻塞(Maurel 1997)。在
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本文推导的氨基酸序列中，对汞敏感残基位置为
Cys-90。据Daniels等(1996)报道，拟南芥 ∆-72P
及 γ-TIP的对汞敏感残基分别变为 Cys-116、Cys-
118，这些残基位于跨膜区对汞敏感的位点上。
这说明，尽管水通道蛋白的N端次要氨基酸残基
有变化，但并不影响其功能与特性。
高等植物的根是进行水分运输的主要器官。
在几乎所有的根细胞中都发现了水通道蛋白，因
此水通道蛋白在根吸收水分的功能中可能起作用。
本文中，PIP2基因在根中的Northern检测信号明
显强于嫩茎和叶中。Quigley等(2001)在研究模式
植物拟南芥水通道蛋白基因家族的基础上，认为
水通道基因家族的各个成员都有其各自的表达模
式，大部分基因在 2个以上组织中表达，但也有
少数基因表现为组织特异性或组织优势表达，其
中含有根中优势表达基因(PIP2;2、PIP2;4 和
TIP1;2、TIP2;2等)。针对植物水通道蛋白基因
在根中特异表达的研究，我们认为水通道蛋白参
与水分吸收和转运过程的分子机制，乃至揭示植
物根的发生、分化和发育机制应是今后值得探讨
的课题。
参考文献
方孝东, 吴多贵, 林栖, 李冠一(1998). 一种适用于盐生植物的
RNA提取方法. 海南大学学报自然科学版, 16 (4): 311~313
于秋菊, 吴锜, 林忠平, 李景富(2002). 植物水孔蛋白研究进展.
北京大学学报, 38 (6): 855~866
张军锋, 邓西平, 慕小倩(2002). 植物的水通道蛋白. 植物生理学
通讯, 38 (1): 88~91
Chaumont F, Barrieu F, Wojcik E, Chrispeels MJ, Jung R (2001).
Aquaporins constitute a large and highly divergent protein
family in maize. Plant Physiol, 125: 1206~1215
Daniels MJ, Chaumont F, Mirkov TE, Chrispeels MJ (1996).
Characterization of a new vacuolar membrane aquaporin
sensitive to mercury at a unique site. Plant Cell, 8: 587~599
Maurel C (1997). Aquaporin and water permeability of plant
membranes. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol, 48:
399~429
Park JH, Saier MH Jr (1996). Phylogenetic characterization of
the MIP family of transmembrane channel proteins. J Membr
Biol, 153: 171~180
Quigley F, Rosenberg JM, Shachar-Hill Y, Bohnert HJ (2001).
From genome to function: the Arabidopsis aquaporins. Ge-
nome Biol, 3: 1~17
Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis J (1996). Molecular Cloning: A
Laboratory Manual. 2nd. New York: Cold Spring Laboratory,
150~310