全 文 ：植物生理学通讯 第41卷 第6期，2005年12月770
中国樱桃品种“对樱”再生体系的优化和转基因初探
赵玉辉1,3 郭印山1 周宇2 张开春2,* 李作轩1 王力华3
1 沈阳农业大学园艺学院，沈阳110061；2 北京市农林科学院林业果树研究所, 北京 100093；3 中国科学院沈阳应用生
态研究所，沈阳 110016
提要 优化了中国樱桃品种“对樱”不定根离体再生体系，用农杆菌介导法，将抗菌肽 B 基因导入“对樱”，通过抗性筛
选获得了 44 株抗性转化植株。PCR 检测有 9 株为阳性，初步说明抗菌肽基因已整合到“对樱”基因组中。
关键词 中国樱桃；抗菌肽；转基因
Preliminary Study on the Optimization of Regeneration and Genetic Transfor-
mation of Chinese Cherry (Prunus pseudocerasus Lindl. cv. Duiying)
ZHAO Yu-Hui1,3, GUO Yin-Shan1, ZHOU Yu2, ZHANG Kai-Chun2,*, LI Zuo-Xuan1, WANG Li-Hua3
1College of Horticulture, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110061, China; 2Institute of Forestry & Pomology, Beijing
Academy of Agriculture & Forestry Sciences, Beijing 100093, China; 3Institute of Applied Ecology, Chinese Academy of Sciences,
Shenyang 110016, China
Abstract The system of regeneration in vitro from adventitious roots in Chinese cherry (Prunus pseudocerasus
Lindl. cv. Duiying) was optimized. The antibacterial peptide B gene was transformed to cherry with Agrobacterium
tumefaciens-mediated transformation system. The 44 plants regenerated which had resistance to Gent were
deteced by PCR, and 9 plants were positive. It indicated that the antibacterial peptide gene had been integrated
into the genome of cherry.
Key words Chinese cherry (Prunus pseudocerasus Lindl. cv. Duiying); antibacterial peptide; genetic transfor-
mation
收稿 2005-04-19 修定 　 2005-10-24
资助　 北京市自然科学基金重点项目(6041002)。
*通讯作者(E-mail: zhangkaichun@baafs.net.cn，Tel：
010-82596007)。
中国樱桃品种“对樱”(Prunus pseudocerasus
Lindl. cv. Duiying)是北京地区的半野生种，综合
性状优良[1,2]，可作为甜樱桃的砧木和育种材料。
樱桃根癌病危害严重，抗菌肽基因可提高樱桃砧
木的抗菌能力[3]。我们已建立了“对樱”不定根
的离体再生体系[4]，本文对此再生系统又进行了
优化，并进行了抗菌肽 B 基因的转化，以期能获
得对根癌病有高抗的樱桃砧木抗性种质。
材料与方法
中国樱桃品种“对樱”(Prunus pseudocerasus
Lindl. cv. Duiying)试管苗以F14附加6-BA 0.5 mg·L-1、
IBA 0.2 mg·L-1、GA3 0.2 mg·L-1 的培养基培养，
每 3 周继代 1 次；取生长健壮的茎接种于 F14 附
加 IBA 0.02 mg·L-1、NAA 0.02 mg·L-1的生根培养
基上培养，以完整的根系为外植体。体细胞胚的
诱导以MS为基本培养基，附加蔗糖40 g·L-1，生
长调节物质为2.0 mg·L-1 2,4-D和0.5 mg·L-1 6-BA，
连续光照，光强36.36 mmol·m-2·s-1。
所用基因工程农杆菌菌系为 GV3101，携带
pPZP质粒，该质粒携带有北京农业科学院林业果
树研究所合成的长130 bp的抗菌肽B基因，启动
子为损伤诱导型启动子——马铃薯蛋白酶抑制剂
II的启动子，植物选择标记为Gent基因(抗庆大霉
素)。农杆菌划线培养于 YEB 固体培养基中，转
化前挑取单菌落，接种于 YEB 液体培养基上，于
27℃下振荡培养，OD 值达 0.5，浸染外植体时加
入乙酰丁香酮(AS)使其终浓度达到 100 mmol·L-1。
取已剪好的整体根，放入农杆菌菌液中浸染 5
min，用无菌滤纸吸干表面多余菌液，于愈伤诱
导培养基(MS+2,4-D 2.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1)中
共培养 3 d 后，将外植体在无菌水中清洗 3 次，
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再置于选择培养基MS+2,4-D 2.0 mg·L-1+6-BA 0.5
mg·L-1+庆大霉素(Gent) 60 mg·L-1+头孢霉素(Cef)
200 mg·L-1 上进行培养。
分别取转化植株和非转化植株叶片，采用
CTAB 法[5]提取总 DNA。根据抗菌肽 B 基因的序列
设计引物，PCR 检测扩增引物BFP58：5 ATGAA-
ATGGAAAGTCTTCAAGAAAATTG 3 及 BFP59:
5 TTATTATCCTAGCGCTTTGGCTTC 3。PCR 反
应条件为：95℃ 4 min；95℃ 45 s，58℃ 1 min，
72℃ 45 s, 39个循环；72℃延伸5 min。阳性对
照为 pPZP 质粒，阴性对照为未转基因的植株。
结果与讨论
1 体细胞胚再生体系的优化及发生过程
以“对樱”无菌生根苗的整体根作为外植
体，基本培养基为 MS，附加蔗糖 40 g ·L-1，生
长调节物质为2.0 mg·L-12,4-D、0.5 mg·L-1 6-BA，
连续光照(表1)，光强36.36 mmol·m-2·s-1，培养10 d
左右，根上诱导出成串的红色愈伤组织(图1-a)　；
20 d左右，愈伤组织分化出根、芽两极的体细胞
胚(图 1-b、c)。体胚形成过程为先发出根，随
后芽萌发。将再生苗从母体上小心分离，转到继
代培养基上，诱导的体细胞胚再生植株生长正常
(图 1-d)。
2 “对樱”不定根再生抗性芽的筛选及转化植株
的获得
用根癌农杆菌侵染不定根，然后放在选择培
养基上进行愈伤组织的诱导和体胚的分化，10 d
左右，根上诱导出成串的红色愈伤组织，20 d左
右，愈伤组织开始分化出体细胞胚, 从6个整体根
系上共得到 132 株再生植株，小心分离体细胞胚
于含60 mg·L-1的庆大霉素的继代筛选培养基中继
续培养。继代筛选 2 ~ 3 次。
3 PCR检测结果
挑选44株抗性状态好的转化植株，分别进行
PCR 检测。结果显示，其中 9 株转化植株有与阳
性对照相同的约130 bp的特异扩增带，与抗菌肽
基因的外源片段大小相符，而非转基因对照植株
中未见相应扩增带(图2)，初步说明抗菌肽基因已
经整合到“对樱”基因组中。
根据以上结果可以得到如下几点印象：
(1) 本实验对蔗糖浓度(附加高糖40 g·L-1)及培
养条件(连续光照)进行了调整。适当高浓度的蔗
糖可以提高体细胞胚的诱导率[6]，高浓度蔗糖可
表1 不同培养条件下“对樱”整体根的再生
Table 1 Regeneration of intact root system of Chinese cherry ‘Duiying’ in different conditions of tissue culture
培养条件
胚性愈伤组织的形成 体细胞胚的诱导
蔗糖浓度/g·L-1 光照
20 16 h光周期 可产生大量浅红色的胚性愈伤组织，继续 体细胞胚(54.5%)，不定芽(45.5%)
培养，愈伤组织转为浅绿色
40 连续光照 可诱导大量红色或深红色的胚性愈伤组织， 体细胞胚(100%), 没有不定芽的发生
直到分化出体细胞胚，红色也不消失
图 1“对樱”整体根再生体细胞胚
Fig.1 Somatic embryos regeneration from in vitro intact root systems of Chinese cherry ‘Duiying’
a: 诱导出的愈伤组织; b: 愈伤组织分化的体细胞胚; c: 体细胞胚; d: 具有根芽两极的体细胞胚转基因植株。
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提高培养基的渗透压，减少细胞内的水分，细胞
内含物增加，有利于体胚的发育。体胚发生对光/
暗周期的要求因植物种类而异[7]。本文发现连续
光照可促进“对樱”体胚的发生，无不良影响。
高浓度糖和光照可促进花色素的合成[8]。
(2) 体细胞胚是由卵细胞特性的胚性细胞发育
而来。这些胚性细胞具有很强的接受外源 DNA 的
能力，是理想的基因转化感受态细胞；而且胚性
细胞繁殖量大，同步性好，转化后的胚性细胞即
可发育成转基因的胚状体及完整的植株。许多研
究表明，胚状体的发生多数是单细胞起源，转化
获得的转基因植株嵌合体少，可以克服诱导形成
的愈伤组织再分化不定芽途径所产生的弊端。
图2 PCR检测结果
Fig.2 The results of detection by PCR
对照 1 ：质粒 D N A ；对照 2 ：未转基因苗；1 ~ 9 ：转基因苗。
参考文献
1 陈君帜, 李青, 孙钊. 中国樱桃半野生种对樱桃的茎尖培养.
园艺学报, 2003, 30(3): 317~318
2 曲泽洲主编. 北京果树志. 北京: 北京出版社, 1990. 450
3 方宏筠, 王关林, 王火旭等. 抗菌肽基因转化樱桃矮化砧木
获得抗根瘤病的转基因植株. 植物学报, 1999, 41(11):
1192~1198
4 阎国华, 张开春, 周宇等. 中国樱桃“对樱桃”不定根离
体再生植株研究. 园艺学报, 2003, 30(5): 583~585
5 王关林, 方宏筠主编. 植物基因工程. 北京: 科学出版社,
2002. 744
6 袁澍, 贾勇炯, 林宏辉. 诱导植物体细胞胚发生的几个生理
因素. 植物生理学通讯, 2003, 39(5): 508~512
7 王进茂, 杨敏生, 杨文利等. 我国木本植物体细胞胚胎发生
研究进展. 河北林果研究, 2004, 19(3): 295~301
8 张学英, 张上隆, 骆军等. 果实花色素苷合成研究进展. 果树
学报, 2004, 21(5): 456~460