全 文 ：植物生理学通讯 第41卷 第4期，2005年8月 509
DNA 未知片段 APCR 克隆的优化
苗红梅1,* 岳彩鹏2 赵永英1
1 河南省农业科学院生物技术研究所，郑州 450002；2 郑州大学生物工程系，郑州 450052
Optimization of APCR for Unknown DNA Fragment Cloning
MIAO Hong-Mei1,*, YUE Cai-Peng2, ZHAO Yong-Ying1
1Biotechnology Research Institute, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, China; 2Department
of Bioengineering, Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China
提要 用锚定 PCR (APCR)技术对未知的小麦淀粉合成关键酶基因 gbss I 和 sbe II a 启动子序列进行扩增。通过对 APCR 反
应进行优化，获得了 gbss I 启动子序列(4.1 kb)和 sbe II a 启动子序列(3.1 kb)。结果表明：减少模板加入量(由 1 mL 降低至
1/100 mL)和增大反应体积(由 50 mL 增到 100 mL)均可在一定程度上减少非特异的结果出现；升高变性温度(由 94℃提高到
98℃)和延伸温度(由 55℃提高到 72℃)并延长延伸时间则能有效地消除 APCR 中的非特异性条带。
关键词 APCR；DNA 未知片段；小麦；启动子序列
收稿 2004-12-13 修定 　 2005-03-14
资助　 河南省杰出人才创新奖金(0121000700)。
*E-mail: miaohongmei@yahoo.com.cn, Tel: 0371-65751119
在克隆 DNA 未知片段中，一般采用锚定 PCR
(anchor PCR，APCR)、反向 PCR (inverse PCR，
IPCR)、DNA 文库或基因芯片等技术[1~3]。针对小
麦为异源六倍体和基因组较大的特点，本文选用
APCR 和 IPCR 方法克隆淀粉合成中关键酶基因的
启动子，结果发现 APCR 能较可靠地克隆 DNA 未
知片段。APCR 反应中，模板的质量和浓度、反
应温度和时间、反应体积以及 Taq 酶量等因素均
对 PCR 结果有直接影响。我们通过调整反应中模
板浓度，反应体积，模板变性、退火及延伸温
度和时间，可在一定程度上减少了非特异结果的
出现，较好地扩增出gbss I和sbe II a基因的启动
子序列，现报道如下。
材料与方法
1 材料
六倍体小麦(Triticum aestivum L.)栽培品种豫
麦 18 由河南省农业科学院生物技术研究所提供。
实验用质粒载体 pMD18-T、限制性内切酶及 Taq
酶等均购自TaKaRa公司(大连)，进口生化试剂及
耗材(TaKaRa、Promega、Vitagene及Sigma)购自
郑州宝信公司、华美公司及郑州医药公司处，其
他化学试剂均为分析纯。
2 方法
2.1 小麦 gDNA 提取 取2 g小麦叶片，用CTAB
法提取出 gDNA[4]，于 4 ℃下放置。取少量样品
分别稀释成不同浓度后，以 0.8% 琼脂糖凝胶进
行电泳，并用核酸分析仪直接测定 D N A 浓度。
2.2 gDNA酶切 小麦gDNA酶切反应体系为：1~2
mg gDNA、5 mL 10× 缓冲液、5 mL 10% BSA、
限制性内切酶(如BglII、EcoRI、HindIII等)10~20
U(DNA/酶加入量约为1 mg∶1 mL)，加无菌超纯
水至50 mL，于 37℃下放置 1 h 或过夜。
2.3 DNA酶切片段与盒(Cassette)连接 连接反应
参照TaKaRa LAPCRTM in vitro 克隆试剂盒使用方
法，含5 mL(500 ng)DNA片段、2.5 mL Cassette、
15 mL 连接液Ⅰ、7.5 mL 连接液Ⅱ，总体积30
mL。于 16℃下过夜。连接物纯化后溶于 5 mL 无
菌超纯水中。
2.4 IPCR
2.4.1 IPCR引物 利用引物设计软件Primer Pre-
mier 5.0软件并根据已知的gbss I基因序列，设计
IPCR 特异引物为：正向引物 1, 5 C GC CG -
CCCCAAAGCAAAGCAGGAAA 3 (78.5℃)， 正向
引物2, 5 GCAGGAAACCGCACCGTGGGAACCG 3
(79.0℃); 反向引物 1, 5 CCGGGGCCTCAG-
GCCCTGAAAACCT 3 (78.0℃), 反向引物2, 5 TG-
GCGAGCTGGGACGTGACCAGAGC 3 (76.9℃)。
2.4.2 IPCR扩增体系 标准反应体系为：模板1~2
mL (50~100 ng)、5 mL 10×PCR缓冲液(含 Mg2+)、
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4 mL 2.5 mol·L-1 dNTPs、1 mL引物1 (10 mmol·L-1)、
1 mL引物2 (10 mmol·L-1)、Taq酶2.5 U，加水至
总体积为 50 mL。标准反应条件为：94℃预变性
5 min后加入 Taq酶；94℃变性 1 min；94℃变性
1 min，55℃退火 1 min，72℃延伸 1 min, 30个
循环；72℃延伸 10 min。4℃保存。
2.4.3 巢式IPCR(nested IPCR) 取上述APCR反应
液 1 mL 作为第 2 次 PCR 模板，加入引物 2，在
以上相同反应体系和条件下进行第 2 次 IPCR。
2.5 APCR
2.5.1 APCR引物 利用引物设计软件Primer Pre-
mier 5.0并根据已知的gbss I和sbe II a基因序列，
设计APCR 特异引物。克隆gbss I 启动子序列所
用引物为：反向引物 1，同 I P C R 反向引物 1；
反向引物2，同 IPCR反向引物2。克隆sbe II a
启动子序列所用引物为：反向引物 1 ，5
G A G A A G C G A T G A G A A G G G G G A G C A A C 3
(71.5℃); 反向引物 2，5 GCCTCGGAACCC-
GAGTGATGGAGA 3(74.0℃); C1，5 GTAC-
ATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCA 3
(74.4℃); C2，5 GTACATATTGTCGTTAG-
AACGCGTAATACGACTCA 3 (75.8℃)。
2.5.2 APCR扩增体系 标准反应体系为：模板1~
2 mL (50~100 ng)、5 mL 10×PCR缓冲液 (含Mg2+ )、
4 mL 2.5 mol·L-1 dNTPs、1 mL 引物1 (10 mmol·L-1)、
1 mL引物 2 (10 mmol·L-1)、LA Taq酶 2.5 U，加
水至总体积为50 mL。标准反应条件同IPCR标准
反应条件。在 APCR 过程中变性温度及时间、退
火温度及时间、Taq 酶种类、反应体积、各试剂
浓度及模板浓度等条件均有变化，详见文章内
容 。
2.5.3 巢式APCR(nested APCR) 取上述APCR反
应液 1 mL 作为第 2次 PCR 模板，加入引物2，在
以上相同反应体系和条件下进行第 2 次 APCR。
2.6 扩增片段凝胶回收 参照PCR片段回收试剂盒
( 大连宝生物) 和 D N A 凝胶回收试剂盒( 上海
Vitagene)的操作步骤进行。
2.7 DNA测序 使用ABI PRISM Model 377 DNA测
序仪进行 DNA 测序，本文中所有测序工作均由大
连宝生物公司完成。
实验结果
1 gbss I启动子的APCR克隆
在对gbss I启动子序列进行克隆时，首先选
用巢式 IPCR 方法并对 IPCR 的模板浓度和纯度、
引物浓度、反应温度和时间等因素进行调整，结
果除有大量弥散外并无特异 PCR 条带出现。在此
情况下，选用APCR 方法继续对gbss I 启动子序
列进行扩增。
依据APCR试剂盒(大连宝生物)使用方法，对
小麦总DNA 进行BglII、EcoRI、HindIII、PstI、
SalI和XbaI 6种酶切处理，并分别与相应的盒连
接。以 6 种连接产物作 APCR 模板，以试剂盒提
供的引物 C1、C2 及合成的反向引物 1、反向引
物 2 作引物进行巢式 APCR，结果(图 1-a)显示：
在标准APCR反应体系下，BglII处理样在500 bp
处有弱带但伴有大量弥散(泳带1); 其他2~6泳带有
大量弥散出现，但无明显条带。
为减少非特异性带的干扰，在反应条件不变
的情况下，将巢式 APCR 中第 2 次 PCR 的模板量
由1 mL分别降低到1/25、2/25和1/ 100 mL(图1-
b)。在此 3 个处理中，原有的弥散基本消失，有
2 条清晰电泳条带出现，且 2 条带主次分明，其
中1/100 mL模板处理(泳带1)中弥散非常少。说明
减少模板的加入量能在很大程度上减少弥散和非特
异性带的干扰。
为消除非特异性带并验证以上结果的可靠
性，重新制作模板并重复以上试验，同时将第 2
次 APCR 的反应体积由 50 mL 增大到 100 mL，结
果如图1-c。在相同反应体系下，新制作模板(泳
带3)与1/25、2/25 mL模板样品(泳带1、2)的APCR
结果中都有部分弥散和 2 条清晰 DNA 条带，且 2
条带浓度相似；而在泳带4(增大反应体积)中，弥
散极少，主次带亮度差异明显。由此可以看出，
在引物、模板等反应成分保持不变的情况下，增
大 P C R 反应体积可有效地减少非特异性带的数
量。从图 1-c 可知 APCR 结果重复性较好。
为进一步优化 APCR 反应体系，在增大第 2
次 PC R 反应体积的同时，升高 DNA 变性温度到
98℃(15 s)，同时提高退火温度到72℃(2.5 min)。
结果(图 1-d)发现，处理中非特异性带消失，仅
有500 bp 条带出现。
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对 500 bp 泳带 DNA 回收、测序，结果见图
2。在我们测序期间，Kluth等[3]也同时报道了gbss I
4 kb启动子序列(GenBank登记号: AY 050175)和启
动子功能缺失分析的结果。随之，用 NCBI 数据
库对上述测序结果和 Klu t h 序列作序列同源性
BLAST 分析。结果表明我们与他们之间的序列相
似率为 9 9 % ，因此，可以认定以上所测序列为
gbss I启动子的部分片段。
2 gbss I 启动子全长序列克隆
为得到 gbss I 全长启动子序列，本文根据
Kluth等[3]的gbss I 4 kb启动子序列设计正向引物
1: 5 GTCCTTTGCAACGACACACTCGATCATGC 3
(74.3℃), 正向引物2: 5 CGCACACACACACTA-
CACCGACACACAGCC 3 (77.5℃), 并与反向引物
1和反向引物2进行普通巢式PCR。在退火温度为
68℃的PCR反应条件下，得到4.1 kb左右片段(图
图1 APCR克隆gbss I启动子500 bp反应体系的优化
　　a: APCR克隆gbss I启动子500 bp片段。1: gbss I 500 bp启动子片段克隆(BglII 处理样品); 2~6: APCR结果(EcoRI、 HindIII、
PstI、 SalI、 XbaI处理样品); M: DL, 2000。b: 降低 APCR中第 2次 PCR的模板浓度。1: 模板为1/100 mL的 APCR；2: 模板为
1/25 mL 的APCR；3: 模板为 2/25 mL 的APCR；M: DL, 2000。c: gbss I APCR 重复实验并增大第2次 PCR 反应体积。1: 模板为
2/25 mL 的APCR；2: 模板为 1/25 mL 的APCR；3: 新制模板的 APCR; 4: 反应体积为 100 mL 的APCR； M: DL, 2000。d: 提高
DNA 变性和退火的温度、延长退火时间。1: 对照(gDNA 作模板); 2: 优化后的 APCR；M: DL, 2000。
图2 gbss I 启动子序列(500 bp)测序
植物生理学通讯 第41卷 第4期，2005年8月512
3)。将此片段测序，序列见GenBank AY278458。
3 sbe II a启动子克隆
在进行APCR 扩增 gbss I 启动子的同时，我
们还采用APCR方法对sbe II a启动子进行了克隆。
同样，经过 APCR 扩增优化处理，最佳反应条件
为: 94℃ 5 min；94℃ 1 min；98℃ 20 s，68℃
3.5 min，30 个循环；72℃ 10 min。4℃保存。
以反向引物 1、反向引物 2 及 C 1、C 2 为引物，
最终在PstI处理样品中获得sbe II a启动子序列
(3.1 kb，GenBank登记号 AY357072)(图 4)。
讨　　论
本文选用APCR 和 IPCR 方法克隆淀粉合成关
键酶基因启动子，结果表明，APCR 能较可靠地
克隆未知片段。IPCR方法是根据部分已知片段设
计引物并通过酶切及环化处理获得 PCR 模板，从
而进行片段扩增。在 IPCR 克隆过程中，选择合
适的酶切位点比较困难；另一方面，IPCR 是以
环化的酶切片段为模板进行扩增的，带有目的序
列的酶切片段的长短直接影响到环化的效果和模板
质量。这些因素都可能是造成IPCR未能成功克隆
gbss I和sbe II a启动子的原因。与IPCR方法相
比，APC R 没有模板环化步骤，只是 gDN A 在用
内切酶酶切处理后连接一段DNA片段(Cassette)，
便可直接进行 PCR 扩增目的片段，模板处理简单
且引物特异性较强，因而获得特异产物的可能性
较 大 。
在用 APCR 扩增未知 DNA 序列过程中，反应
体系的优化很重要[5,6]。反应中模板的质量和浓
度、M g 2+ 浓度、T a q 酶质量和浓度、反应温度
和时间及反应体积等因素均会影响 APCR 克隆结
果。我们在gbss I启动子克隆过程中，设计使用
了 T m 值较高的引物，并调整了反应中的模板浓
度，反应体积，模板变性、退火及延伸温度和
时间等因子。减少模板加入量或增大反应体积均
是相对减少底物浓度，提高反应温度也在一定程
度上减少了非特异结果的出现。另外，在进行
APCR 过程中，共使用了一般 Taq、Ex Taq、LA
Taq，结果有差异，因此，较高质量的试剂和酶
也是 AP C R 实验成功的关键。
参考文献
1 Digeon JF, Guiderdoni E, Alary R et al. Cloning of a wheat
puroindoline gene promoter by IPCR and analysis of pro-
moter regions required for tissue-specific expression in
transgenic rice seeds. Plant Mol Biol, 1999, 39: 1101~1112
2 Miao H, Fleming JE, Lu D et al. Evaluation and character-
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Chin Sci Bull, 2004, 49(6): 579~585
3 Kluth A, Sprunck S, Becker D et al. 5 deletion of a gbssⅠ
promoter region from wheat leads to changes in tissue and
developmental specificities. Plant Mol Biol, 2002, 49:
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4 王关林, 方宏筠主编. 植物基因工程原理及技术. 北京: 科学
出版社, 1998. 600~602
5 王关林, 方宏筠主编. 植物基因工程原理及技术. 北京: 科
学出版社, 1998. 418~424
6 Sambrook J, Russell DW. Molecular Cloning. 3rd ed. New
York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001. 8.18~8.113
图3 gbss I启动子全长序列克隆
　　1: 对照1(加入单引物); 2: gbss I启动子克隆(4.1 kb); 3: 对
照 2(gDNA 作模板); M: DL, 2000。
图4 sbe II a启动子全长序列的半巢式PCR
　　1: sbe II a启动子全长序列(以PstI处理样品为模板); M: l-
EcoT14 Ⅰ digest。