全 文 ：植物生理学通讯 第41卷 第6期，2005年12月728
秋水仙碱对长春花突变细胞生长速率和长春质碱积累的影响
张荣涛1 张秀省2 聂莉莉1 朱晔荣1,* 王宁宁1 王勇1
1 南开大学生命科学学院，天津 300071；2 聊城大学农学院，山东聊城 252000
提要 用 0.5% 秋水仙碱处理长春花愈伤组织，获得了多倍体突变细胞。初步的染色体检查显示，大多数突变的细胞为 4
倍体。突变细胞与普通细胞在生长速率、吲哚生物碱和长春质碱积累方面的差异比较表明，吲哚生物碱的积累并无大的
差异，但是突变细胞的生长速率和长春质碱的积累量可分别达到普通细胞的 2.9 倍和 5.2 倍。
关键词 秋水仙碱；长春花；吲哚生物碱；长春质碱
Effect of Colchicine on Growth Rate and Accumulation of Catharanthine in
Mutant Cells of Catharanthus roseus L.
ZHANG Rong-Tao1, ZHANG Xiu-Sheng2, NIE Li-Li1, ZHU Ye-Rong1,*, WANG Ning-Ning1, WANG Yong1
1College of Life Science, Nankai University, Tianjin 300071, China; 2College of Agriculture, Liaocheng University, Liaocheng,
Shandong 252000, China
Abstract Mutated polyploid Catharanthus roseus L. cells were obtained by treatment of calli with 0.5% colchicine.
Primary chromosome analysis showed that most of the mutated cells were tetraploids. The comparison of
growth rate, accumulation of indole alkaliods and catharanthine demonstrated that there was no significant
difference in the accumulation of indole alkaloids, but the growth rate and the accumulation of catharanthine in
colchicine mutated cells reached 2.9- and 5.2-fold, respectively, of the normal cells.
Key words colchicine; Catharanthus roseus L.; indole alkaloids; catharanthine
收稿 2005-05-11 修定 2005-11-29
资助 南开大学科技创新基金和山东省科技攻关计划项目
(2005GG4402011)。
*通讯作者(E-mail: zhuyr@nankai.edu.cn, Tel: 022-
23504382)。
长春花的次生代谢产物中含有药用成分长春
新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、长春质碱
(catharanthine)等。目前，这些药物均从长春花植
物体中获得，它们在植物体内含量很低，仅为十
万分之一到百万分之一[1]。采用细胞培养方法代
替从长春花植物体中提取药用成分的研究，是多
年来备受人们关注的课题之一，并已取得了一定
的进展[2~4]。但由于细胞系不稳定，生物产量低，
药用成分含量低，生物产量与药用成分的积累之
间存在矛盾等，至今未能实现工业化生产。本文
用化学诱变方法获得长春花突变细胞，并对其生
长速率、吲哚生物碱及长春质碱进行了检测，以
期能为工业化生产提供一种生物碱高产而生长快的
细胞工程品系。
材料与方法
长春花(Catharanthus roseus L.)愈伤组织由本
院诱导获得(长春花取自本院温室)。秋水仙碱购
自 Sigma 公司。
长春花愈伤组织固体培养基为：M S + 1.0
mg·L-1 KT+2.0 mg·L-1 NAA，pH 6.4，光强为18~27
µmol·m-2·s-1，光照时间12 h·d-1；悬浮培养物液体
培养基为：MS+1.0 mg·L-1 KT+2.0 mg·L-1 NAA，
pH 6.2，暗培养，液体培养摇床转速为80 r·min-1，
培养温度为 25~26℃。
用0.9%生理盐水配制0.5%的秋水仙碱溶液，
用0.45 µm微滤膜将生理盐水和秋水仙碱溶液分别
过滤于无菌瓶中，将固体培养的长春花愈伤组织
转接入无菌瓶中悬浮培养4 h，再转接到固体培养
基中培养，待愈伤组织生长旺盛后进行液体培养。
细胞染色体数目的检查按文献 5 方法。吲哚
生物碱的提取及含量测定参照文献 6 进行。长春
质碱测定采用反相高压液相色谱法(RP-HPLC)。
色谱条件：C18 硅胶柱(250 mm×4.6 mm，7 mm);
测定波长280 nm; 流动相是甲醇∶0.005 mol·L-1
NH4H2PO4=7∶3 (V/V, pH 7.0); 柱温28℃, 流速
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1.0 mL·min-1。长春质碱峰面积与其浓度呈线性关
系，回归方程为：Y=8560X–113.78 (Y为峰面积，
X 为浓度，R=0.9991，RSD=1.65%)。所有数据
均为 3 次平行重复的平均值。
结果与讨论
1 染色体的变化
在植物细胞有丝分裂过程中，秋水仙碱可阻
断纺锤体的形成，因而复制后的染色体不能分向
两极和分配到子细胞中，从而导致染色体加倍。
用0.5%秋水仙碱处理的材料经继代培养后，以光
学显微镜观察时，其染色体数目发生变化，获得
了多倍体细胞，其中四倍体的数目最多，有少许
八倍体。二倍体和四倍体染色体数目如图1所示。
图1 二倍体和四倍体细胞的染色体
Fig.1 Chromosomes of diploid and tetraploid cells
a: 未突变细胞的染色体(8对); b: 突变细胞的染色体(16对)。
图2 秋水仙碱诱变的长春花突变细胞与
普通细胞固体培养的生长动力学曲线
Fig.2 The growth kinetics of mutant cells induced by colchi-
cine and normal cells of C. roseus on solid medium
n和c分别表示二倍体普通细胞和秋水仙碱诱变的长春花突
变细胞，6 、7 分别表示生长继代次数。图 3 ~ 7 同此。
图3 秋水仙碱诱变的长春花突变细胞与普通
细胞悬浮培养的生长动力学曲线
Fig.3 The growth kinetics of mutant cells induced by colchi-
cine and normal cells of C. roseus in suspension culture
32.0 g，为普通细胞的2.9 倍。液体培养为暗培
养，突变细胞的颜色虽然没有像固体培养那样呈
现绿色，但比普通细胞新鲜，不出现褐色。
2.2 吲哚生物碱积累量变化 选用培养第6、7代突
变细胞，固体培养和液体培养分别每隔5 d和2 d
秤重, 测定吲哚生物碱的含量。结果(图4和5)表
明：(1)固体培养时，突变细胞的吲哚生物碱动态
变化与普通细胞的差异不明显，二者变化趋势相
近，30 d时含量达最高；(2)液体培养的突变细胞
和固体培养及普通细胞吲哚生物碱的含量类似。
但值得注意的是，突变细胞在生长后期(24 d)，积
累超过了普通细胞。
2 突变细胞的生理性状
2.1 生长动力学分析 将秋水仙碱处理的细胞转接
到固体和液体生长培养基中继代培养。选取第
6、7代固体培养的愈伤组织与液体培养的细胞(固
体初始接种量约0.45 g·瓶-1，液体培养约为1.2 g·
瓶-1)测定生长曲线。固体培养间隔5 d秤重1次，
液体培养间隔2 d秤重1次，结果(图2和3)表明：
(1)固体培养时，普通细胞的鲜重随培养时间的增
加而增加，25 d达到最高值，随后生长逐渐下降。
突变细胞的生长快于普通细胞，25 d后，突变细
胞的生长还在缓慢上升，30 d达到最高值。其表
观特征也发生变化：生长后期，普通细胞由原始
淡黄色变成粘稠褐色，逐渐衰老死亡；而突变细
胞由原始发白变成浅绿色，细胞团粒松散，衰老
较缓慢。(2)与固体培养相比，液体培养更有利于
突变细胞的生长，其鲜重增长明显加快。培养16
d 后，其生长速度迅速上升。20 d 时生长量高达
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图6 秋水仙碱诱变的长春花突变细胞与普通
细胞固体培养中长春质碱含量的积累
Fig.6 Accumulation of catharanthine content in mutant cells
induced by colchicine and normal cells
of C. roseus on solid medium
图7 秋水仙碱诱变的长春花突变细胞和普通
细胞液体培养中长春质碱含量的积累
Fig.7 Accumulation of catharanthine content in mutant
cells induced by colchicine and normal cells
of C. roseus in suspension culture
2.3 长春质碱含量的动态变化 如图 6 和 7 所示，
秋水仙碱诱变的细胞中长春质碱的含量远远超出普
通细胞：固体培养时，前者是后者的4.1倍(最高
点在30 d); 液体培养时，前者是后者的5.2倍(最
高点在22 d)。这说明突变细胞合成长春质碱的次
生代谢活性比普通细胞高得多。
总之，经秋水仙碱处理的长春花细胞由二倍
体变成了多倍体，其生长速率快于二倍体，长春
质碱含量显著地提高。
参考文献
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图5 秋水仙碱诱变的长春花突变细胞与普通细胞
悬浮培养中吲哚生物碱含量的动态变化
Fig.5 The kinetics of indole alkaliod content in mutant cells
induced by colchicine and normal cells
of C. roseus in suspension culture
图4 秋水仙碱诱变的长春花突变细胞与普通细胞
固体培养中吲哚生物碱含量的动态变化
Fig.4 The kinetics of indole alkaliod content in mutant cells
induced by colchicine and normal cells
of C. roseus on solid medium