全 文 ：第 20 卷　第 3 期　　　　　　　木　　本　　植　　物　　研　　究 2000 年　7 月
Vol.20　No.3　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH July , 　2000
诱导物及前体物对香荚兰细胞
悬浮培养产生香兰素的影响
曹孟德1　李家儒2　王君健3
(1.河南医科大学博士后流动站 , 郑 州　450052)
(2.中国科学院武汉水生生物研究所 , 武汉　430072)
(3.华中理工大学生物工程系 , 武汉　430074)
摘　要　未经高温处理的黑曲霉诱导物对香荚兰细胞培养产生香兰素有促进作用;
苯丙氨酸有利于香荚兰细胞生长 ,但对香兰素的合成无影响;阿魏酸则减缓细胞生
长 ,明显促进香兰素的合成 ,但其浓度不宜高于 5mmol/L 。
关键词　香荚兰;香兰素;悬浮培养;诱导物;前体物
EFFECTSOF ELICITOR AND PRECURSOR ON THE
VANILLIN FORMATION IN BATCH SUSPENSION
CELL CULTUREOF VANILLA PLANIFOLIA
CAO Meng-de1　LI Jia-ru2　WANG Jun-jian3
(1.Department of Basic Science ,Henan Medical University , Zheng zhou 450052)
(2.Institute of Hydrobiolog y , the Chinese Academy of Science ,Wuhan 430072)
(3.Bioengineering Depar tment ,Huazhong University of Science & Technology ,Wuhan 430074)
Abstract　The non -autoclaved Aspergil lus niger v.Tiegh elicitor could promo te
vanillin biosynthesis in suspension cell culture of Vanil la planifolia;Phenylalanine
was profitable to cell g row th of Vanil la planifolia , but did no t affect vanillin forma-
tion;ferulic acid could slow down cell grow th and increase vanillin accumulat ion ,but its
concentrat ion should not be higher than 5m mol/ L.
Key Words　Vani lla plani folia;Vanillin;Suspension culture;Elicitor;Ferulic acid;
Phenylalanine
香荚兰是世界上用得最广的香料之一 ,其主香成分香兰素又名香草醛(3-甲氧基-4-
羟基-苯甲醛)含量较低 ,仅占香荚兰豆干重的 2%～ 3%。由于香荚兰生长发育及其后期
收稿日期:1999-7-29
生香处理的特殊性与复杂性 ,加之其香兰素含量不高 ,因此 ,仅靠从天然香荚兰制备浸提物
或天然香兰素是难以满足市场需求的 ,而且价格昂贵 ,为一般消费者难以接受 。为此 ,借助
植物组织培养技术来生产天然香兰素或许可以解决上述问题。国外已在此方面作了一些尝
试[ 1 ～ 4] ,国内则未见报道。本文在前述工作的基础上进一步探讨了香荚兰细胞悬浮培养产
生香兰素的条件[ 5 ,6] 。
1　材料与方法
1.1　香荚兰细胞的悬浮培养 、香兰素的提取及检测均参照文献[ 5 , 6]进行 。
1.2　黑曲霉培养
所用菌种为黑曲霉(Aspergi llus niger v.Tiegh),培养基为 MS 基本培养基 ,不添加植物
生长调节剂 ,pH5.4 ,菌球在旋转式摇床上悬浮培养 ,转速 100rpm ,培养 6d后收获菌球 。
1.3　黑曲霉诱导物的制备
用中华滤纸过滤得菌球 ,将菌球与 10倍体积的重蒸馏水混合并用细胞匀浆器于室温下
匀浆 。所得匀浆液分两部分 ,一部分用高压蒸气灭菌 20min后用 0.22μ无菌微孔滤膜抽滤 ,
滤液作为诱导物 Ⅰ ,另一部分不经高压蒸气灭菌 、直接用 0.22μ无菌微孔滤膜抽滤 ,滤液作
为诱导物 Ⅱ。香荚兰细胞悬浮培养 3d后加入诱导物Ⅰ或Ⅱ ,检测其对细胞生长及香兰素合
成的影响 。
2　结　果
2.1　黑曲霉诱导物对香荚兰细胞生长及香兰素含量的影响
黑曲霉诱导物对香荚兰细胞的生长及香兰素合成的影响结果见表 1。
表 1 黑曲霉诱导物对香荚兰细胞悬浮培养的影响
Table 1　Effect of el icitor from A.niger v.Tiegh on cell growth and vanillin accumula-
tion in batch suspension cell culture of V.planifonia
组　　别
Groups
培养物干重/ g/ L
Dry weight of cell
增重/ %
Rate of cell dry
w eight increased
香兰素含量/mg/ L
Vanillin content
含量增加/ %
Rate of vanillin
content increased
对　　照
Control
10.88 7.34
诱导物Ⅰ(高温处理)
Elicitor I(autoclaved) 10.96 0.7 7.52 2.4
诱导物Ⅱ(未经高温处理)
Elicito r II(nonautoclaved) 12.57 15.5 9.35 27.3
2.2　苯丙氨酸及阿魏酸对香荚兰细胞悬浮培养的影响
香荚兰细胞悬浮培养 3d后 ,加入不同浓度的苯丙氨酸和阿魏酸 ,其对细胞生长及香兰
素含量变化的影响见表 2。
3　讨　论
3.1　黑曲霉诱导物对香荚兰细胞生长及香兰素含量的影响
2673 期　　　　　曹孟德等:诱导物及前体物对香荚兰细胞悬浮培养产生香兰系的影响
由表 1可知 ,经不同的处理之后 ,黑曲霉诱导物对香荚兰细胞悬浮培养的影响明显不
同 ,经过高温处理的诱导物的效果不明显而未经高温处理的诱导物则能明显促进细胞生长
及香兰素合成 ,这或许是由于高温破坏了诱导物中起作用的活性成份 。真菌诱导物按其组
成目前可分为多糖类 、糖蛋白类 、多肽类及不饱和脂肪酸类[ 7 , 8] 。它们对植物次生代谢途径
的活化和特定代谢产物的选择性有诱导作用 ,调节连接初生代谢和次生代谢 、次生代谢分支
途径的关键酶及其同工酶的活性和酶量 ,进而使某特定代谢途径活化及增加某些次生产物
的积累。例如:米曲霉诱导物能抑制滇紫草(Onosma paniculatum Bur.et Franch)细胞生长
而促进紫草色素的合成[ 9 , 10] ;桔青霉诱导子促进红豆杉细胞培养合成紫杉醇[ 11] 。我们试验
所需的目的产物香兰素是苯丙素类代谢途径中的一个产物 ,黑曲霉诱导物可能是诱导活化
了香兰素合成的分支途径 ,进而促进了香兰素的合成。
表 2 苯丙氨酸和阿魏酸对香荚兰细胞悬浮培养的影响
Table 2　Effect of Phe and ferulic acid on cell growth and vanill in formation in batch
suspension cell culture of V.planifolia
前体物浓度/ mmol/ L
P recursor s concentration
细胞干重/mg/ L
Dry w eight of cell
培养液中香兰素含量/mg/ L
Vanillin content of suspension
0 10.89 7.37
1 10.96 7.48
Phe 3 11.78 7.39
5 13.23 7.41
FA 1 10.87 8.91
3 10.34 16.44
5 9.18 23.65
3.2　苯丙氨酸及阿魏酸对香荚兰细胞悬浮培养的影响
从表 2结果可以看出 ,苯丙氨酸能促进香荚兰细胞的生长 ,但对香兰素产量的影响并不
明显 ,阿魏酸减缓细胞的生长 ,但对香兰素的增产有明显的促进作用 。有资料表明 ,当苯丙
氨酸用作前体物 ,可以使对-香豆酸(p-coumaric acid)大量积累 ,苯丙氨酸的代谢是该途径
的限速步骤 ,阿魏酸虽然对细胞有毒害作用 ,但是它的加入能使香兰素含量明显增加 ,说明
阿魏酸是进一步代谢形成香兰素的很好前体物。Westco tt等人[ 3]用香荚兰气生根培养转化
阿魏酸 ,试验结果表明 ,在附加活性炭的情况下 ,香兰素的浓度达 7g·kg-1根组织 ,比原来气
生根中的含量高约 35倍 ,约为成熟果荚中的 40%,供给气生根以阿魏酸 ,其香兰素的产生
比通常果荚或气生根中合成快 5至 10倍 。所得风味化合物的组成与果荚中十分接近。我
们的实验结果也表明 ,香荚兰细胞转化阿魏酸增加香兰素的合成 。
利用植物细胞与组织培养中植物对某些物质进行转化的生化潜能是生物工程学中的一
个重要研究领域 。一般认为在植物组织培养中 ,细胞具有次生代谢途径的潜在能力 ,但与正
常植株相比 ,组织培养的细胞降低了这种能力。当这种能力的降低是由于缺乏前体物而引
起时 ,培养基中外源供给生物合成的前体 ,能增加最终产物的产量。
268 木　本　植　物　研　究　　　　　　　　　　　　　　　20 卷
参　　考　　文　　献
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2693 期　　　　　曹孟德等:诱导物及前体物对香荚兰细胞悬浮培养产生香兰系的影响