全 文 ：第 22 卷　第 2 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2002年　4 月
Vol.22　No.2　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH Apr., 　2002
磷酸戊糖途径的调节对红豆杉细胞生长及紫杉醇合成的影响
兰文智　余龙江＊＊　吴元喜
(华中科技大学生命科学与技术学院 ,武汉　430074)
摘　要　在正常的红豆杉细胞悬浮培养过程 ,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)活性的变化趋势
与生物量的基本相似 。而在 chitosan处理的细胞中 G6PDH 活性升高而生物量下降 。100 mg.
L-1 chitosan和 500mg .L-1 chitosan均对细胞G6PDH 具有诱导作用 ,且后者的诱导强度较前者的
高。乙二醇双 2-氨基乙基醚四乙酸(EGTA)的加入降低 chitosan 对细胞 G6PDH 的诱导程度 ,显
示 chitosan对G6PDH 的诱导需要Ca2+的参与。谷胱甘肽(GHS)的处理可反馈抑制 chitosan对细
胞G6PDH 的诱导。通过分析调节后 G6PDH 的各种活性与细胞中紫杉醇产量的关系 ,认为采用
合适的处理方法调节磷酸戊糖途径 ,有利于红豆杉细胞合成紫杉醇。
关键词　红豆杉细胞;磷酸戊糖途径;细胞生长;紫杉醇;葡萄糖-6-磷酸脱氢酶
EFFECT OF REGULATION OF PHOSPHATE PENTOSE PATHWAY ON CELL
GROWTH AND TAXOL BIOSYNTHESIS IN TAXUS CHINENSIS CELLS
LAN Wen-zhi　YU Long -jiang ＊＊　WU Yuan-x i
(School of Life Science and Technology , Huazhong University of Science and Technology , Wuhan 430074)
Abstract　During the process of suspension culture;the change of glucose-6-phosphate dehydroge-
nase (G6PDH)activity in Taxus cells without t reatment w as fundamentally similar to that of the
biomass.However , G6PDH activity increased in chi tosan-t reated cells w hile biomass decreased.100
mg.L-1 chi tosan and 500mg.L-1 chi tosan bo th enhancedG6PDH activity , and the improved deg ree
of the latter w as greater than the former.The addition of ethylene g ly colbis-aminaethy ether-te-
tracetic acid(EGTA)declined G6PDH activity induced by chitosan , indicating that Ca2+ played an
imperative role in chi tosan-induced G6PDH .Glutathione (GSH)treatment inhibi ted by feedback
the chitosan-induced G6PDH.After analy zing the relationship between various G6PDH activities
and Taxol production , we concluded that regulation of phosphate pentose pathw ay by the appropriate
methods could be beneficial to Taxol product ion in Taxus cells
Key words　Taxus chinensis cells;phosphate pentose pathw ay;cell grow th;taxol;glucose-6-
phosphate dehydrogenase
　　紫杉醇为红豆杉(Taxus spp)中的一种二萜类
生物碱 , 对耐药性卵巢癌等癌症具有显著的疗
效[ 1] 。红豆杉细胞培养被认为是一种解决紫杉醇
药源短缺的潜在有效方法之一[ 2] ,受到各国的普遍
第一作者简介:兰文智(1973-),男 ,博士研究生 ,主要从事植物次生代谢途径分子生物学研究。
教育部高校骨干青年教师基金
＊＊通信联系人
收稿日期:2001-12-21
重视 。围绕提高细胞培养物中紫杉醇的含量开展了
许多工作[ 2 ,3] ,紫杉醇的生物合成途径的调节为有
效方法之一[ 4] 。红豆杉细胞除了萜类化合物的合
成途径外 ,一般认为还存在芳香族化合物 、含氮的生
物碱化合物等次生代谢途径。二萜类的合成途径不
仅与某些次生代谢途径有关 ,而且与初生代谢途径
密切相关[ 5] 。磷酸戊糖途径 (Phosphate Pentose
Pathw ay ,PPP )是细胞中重要的初生代谢途径 ,是
碳源从糖酵解途径流向合成植保素 、木质素等次生
代谢途径的必经中间途径[ 6 , 7] ,而且具有重要的生
理功能 , 例如生成一些次生代谢物所必需的
NAPDH[ 8] 。本文首次探讨了 PPP 中的速限酶葡萄
糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose -6-phosphate dehy-
drogenase , G6PDH)活性的变化 ,以分析 PPP 与红
豆杉悬浮细胞生长及紫杉醇合成的可能关系 。
1材料与方法
1.1　细胞株及培养条件
取本实验室继代培养 ,分散性良好 ,同一来源的
红豆杉(Taxus chinensis)悬浮培养细胞 ,培养基为
本实验室研制的改良培养基[ 3] ,其中含水解乳蛋白
0.2g.L-1 ,蔗糖 30g.L-1 , 2 , 4-二氯苯氧乙酸 0.
1mg.L-1 ,6-苄氨基嘌呤 0.5mg.L-1 ,α-萘乙酸
0.5mg .L-1 , pH 为 5.8;培养过程中 ,摇床转速为
120 ～ 130 rpm ,培养温度为 24±1℃,暗培养 。
1.2　Chitosan的制备与细胞处理实验
按照文献[ 9]的方法将 chitosan(聚氨基葡糖)制
成浓度为 5g.L-1的母液 。在细胞悬浮培养的第 8
天 ,分别加入 100 和 500 mg.L-1 chitosan , 500 mg.
L-1 chitosan和 100 mg.L-1谷胱甘肽(GHS)组合 ,
500 mg.L-1 chitosan和 100 mg.L-1乙二醇双 2-氨
基醚四乙酸(EGTA)组合进行处理。加入后定时取
样 ,测定 G6PDH 的活性和生物量。加入诱导子继
续培养后的第 5天 ,收获细胞培养物并测定紫杉醇
产量。所有样品均为两组重复样平行测定 ,取平均
值。
1.3　G6PDH 活性的测定
G6PDH 活性的测定主要参考文献[ 10] ,略有修
改。将预冷的 5g 鲜重的细胞在 10 ml的研磨介质
磨成匀浆(冰浴中进行),匀浆用四层纱布过滤 ,并在
3000rpm离心 10分钟 ,上清夜为酶粗提液 ,用于酶
活测定。把酶粗提液和反应液混合放在 30℃的水
浴中保温 ,吸 2ml反应混合液加 0.1ml酶液 , 并加
0.1ml Tris缓冲液而不加对照 ,立即在 OD340处进行
比色 , 5 分钟后测 OD值的变化 。取每个样品测定
期间的每分钟内的 OD值的最大变化的 100倍为酶
活(ΔOD×102min-1)。
1.4　培养细胞中紫杉醇含量的测定 紫杉醇提取与
测定方法按文献[ 3] 。
2.结果
2.1　细胞生长过程中G6PDH 活性的变化
图 1　红豆杉细胞悬浮培养过程中 G6PDH 活性的变化
Fig.1 The change of G6PDH activity in cell suspension cul-
tures of Taxus chinensis
红豆杉细胞在悬浮培养过程中 G6PDH 活性变
化如图 1 所示 。细胞在接种培养后的第 3 天 ,
G6PDH 活性便迅速上生 ,在 21天时达到最大值 ,但
在第 22天后 ,G6PDH 酶活开始急剧下降 。
2.2　Chitosan 对 G6PDH 活性的影响
图 2　不同浓度的 chito san处理对红豆杉悬浮
细胞中 G6PDH 活性的影响
Fig.2 The effect of chitosan on G6PDH activity in cell sus-
pension cultures of Taxus chinensis
红豆杉悬浮培养细胞在培养的第 8d 加入 100
mg.L-1和 500mg.L-1 chitosan ,对照组加入同体积
的培养液 , 处理后 G6PDH 活性变化如图 2 所示 。
Chitosan 对细胞中的 G6PDH 具有诱导作用 , 且
500mg .L-1 chitosan 诱导强度较 100 mg.L-1 chi-
tosan 的高 。100 mg .L-1 chitosan 和 500mg .L-1
chitosan对 G6PDH诱导的峰形相似 ,而且峰值都在
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处理后的 16 h.
2.3　GSH 和 EGTA 对 chitosan 处理 G6PDH 活性
的影响
图 3　GSH 和 EGTA 对 500mg.L -1 chitosan 处理的
G6PDH 活性的影响.
Fig.3 The effect of GSH and EGTA on G6PDH activity in-
duced by 500 mg.L -1 chito san on in cell suspension cultures
of Taxus chinensis.
在 500 mg.L-1 chi tosan 处理红豆杉悬浮培养
细胞的同时 ,加入 EGTA 或 GSH ,对 G6PDH 活性
的影响如图 3 所示 。EGTA 的加入完全抑制 chi-
tosan对细胞G6PDH 的诱导 。尽管 chitosan与GSH
的组合处理后细胞的 G6PDH 活性变化趋势与 chi-
tosan单独处理的相似 ,但前者的值远低于后者的
值。
2.4　各种处理对细胞生长的影响
图 4　各种处理的细胞在培养过程的生长曲线
Fig.4 The grow th curves of cells induced by various treat-
ments during culture
500 mg.L-1 chitosan 、500 mg.L-1 chi tosan +
EGTA 和 500 mg .L-1 chitosan+GSH 处理对细胞
生长的影响如图 4所示。与无任何处理的对照组相
比 ,这三种处理均在一定程度抑制细胞的生长 。
Chitosan+GSH 处理的细胞在培养中期以后 , 与
chitosan单独处理相比 ,细胞的生物量较高 。而 chi-
tosan+GSH 处理的细胞在培养后期以后 ,与 chi-
tosan单独处理相比 ,细胞的生物量略低。
2.5　各种处理对紫杉醇合成的影响
红豆杉细胞在诱导处理后的 5 d左右紫杉醇产
量最高[ 2] ,在该时各种处理的细胞中紫杉醇产量如
图 5所示 。500mg .L -1 chitosan的细胞中紫杉醇产
量较 100 mg.L-1 chi tosan 处理的高 。EGTA 的加
入显著地抑制 500mg.L-1chitosan对细胞紫杉醇合
成的诱导 , 而 GSH 的加入略降低 500mg.L-1 chi-
tosan对细胞紫杉醇合成的诱导。
3　讨论
PPP 为细胞中重要的初生代谢途径 ,与细胞的
生长有着密切的关系[ 11] 。本文的结果表明 ,在正常
的红豆杉悬浮培养过程早中期前 ,G6PDH 的活性的
变化基本与生物量的增长成正比 ,而在培养后期 ,生
物量的增加缓慢 ,而 G6PDH 酶活急剧下降(图 1 ,图
4)。Tian等人[ 11]认为 G6PDH 对细胞生长的贡献
在于提供 NADPH 。但是 ,植物细胞在外界环境的
胁迫下 ,PPP 的初生代谢功能降低 ,而主要功能是调
节碳源流向次生代谢途径[ 6] ,而且由于在诱导作用
下 ,红豆杉细胞会发生不同程度损伤[ 12] 。因此 ,尽
管 chi tosan的处理可提高 G6PDH 的活性 ,但细胞的
生长反而受到抑制。
Fahrendorf 等[ 6] 发现悬浮培养的紫花苜蓿细
胞 ,在酵母诱导子作用后 , G6PDH 活性及其转录水
平提高 ,在盐胁迫下的小麦中也有类似的现象[ 7] 。
Chitosan是来源于真菌细胞壁的一类多糖 ,我们发
现其可诱导红豆杉细胞紫杉醇的合成[ 9] 。在不同
浓度的 chitosan处理后 ,细胞中 G6PDH 活性上升 ,
而且高浓度的诱导 G6PDH 的强度较低浓度诱导的
强度高(图 2)。但在 Ca2+螯合剂 EGTA 存在的情
况下 , chi tosan对 G6PDH 并不具有诱导作用(图 3),
显示 chi tosan 对 G6PDH 的诱导需要 Ca2+的参与 。
GSH 可调节 NADP +/NADPH 的比例 , 过量的
GSH 提高 NADPH 的量 ,从而反馈抑制 G6PDH 的
活性(图 4)。羟基化反应是紫杉醇生物合成的关键
步骤 , 该反应在细胞色素 P450 的作用下 , 将
NADPH传给紫杉二烯形成 5a-羟基-4(20), 11
(12)-紫杉烯[ 13] 。细胞中的 NADPH 主要由 PPP
产生 ,G6PDH 活性的提高有利于 NADPH 生成[ 8] 。
高浓度 chitosan提高 G6PDH活性较低浓度 chitosan
的高 ,而且紫杉醇合成量也较高。EG TA 完全抑制
chitosan对 G6PDH 的诱导 ,也大大降低紫杉醇含
量。GSH 降低 chitosan对 G6PDH 的诱导程度 ,但
细胞中紫杉醇含量仍然较高(图 2 、图 3 、图 5)。这
2032 期　　　　　　　　　兰文智等:磷酸戊糖途径的调节对红豆杉细胞生长及紫杉醇合成的影响
图 5　各种处理 5 天后对红豆杉细胞合成紫杉醇的影响
Fig.5 The influence of various treatments on taxol
production in Taxus cells on the 5 d
可能 GSH 作为抗氧化剂 ,缓解 chitosan 对细胞的伤
害 ,从而提高细胞中紫杉醇的合成 。因此 ,采用合适
的处理方法对 PPP 进行调节 ,可能有利于细胞合成
紫杉醇。
参　考　文　献
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