全 文 ：第 23 卷 第 2 期
Vol
.
23 N o
.
2
植 物 研 究
B U LLET IN OB FT A ON I CA LE SE RA H R C
2 0 3 年
A P ri l
,
4 月
2 《X J3
高效液相色谱法测定豚草茎中绿原酸含量的研究
赵 听 袁晓颖 付玉杰 张 莹
(东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室 ,哈尔滨 15以” 0
摘 要 以 高效液相色语法作为绿原酸含量的检测方法 ,用超声提取法从豚草茎中提取绿原酸
以制备分析样品 ,结果表明超声提取的最佳条件为 : 以 蒸馏 水为提取溶剂 ,在 60 ℃ 下超声提取
7 0 m i n
。
关键词 豚草 ;绿原酸含量 ;超声波提取法 ;高效液相 色谱法
S T U D Y O N T H E C O N T E N T O F C H L O R O G E N I C A C I D
F R O M A M B R O SJ 叭 A R T EM IS l 万口刀叭 L . B Y H P L C
Z HA O X i n Y U AN X ia o 一 Y i n g F U Y u 一 J i e Z H A N G Y in g
( eK y 肠 bo art o口 Of F o r e s t P la n t E e o lo gy , M in i s t口 Of dE u e a t io n , P . R . Ch in a , N o rt h e as t OF er s tw U n iv e 岛i ty , H a ht in 15 (X:岭 0
A bs t
r a e t C h o l o g e n ie a e id e o n t e n t in Amb osr 记 a 以 e m is i如l ia L . s et m w as s t u d i e d b y ht e m e th o d of
h ig h p e for mr an
e e l iq u id e h or ma 脚p h y . A n a l y s i z e d s a m p l e m a d e for m Am bosr i a a晚m is i如l ia L .
s et m w a s ht or u g h u latr
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e er s u l t s h o w e d ht a t w e 即 t a go d e x atr e -
t i o n y i e ld o f e h l o or 罗 n i e a e id u n d e r ht e 叩 t i m a l e o n d i t io n of 60 ℃ te m p e ar t u er a n d 7 0 m in u te s .
K e y wo
r ds Amb osr i
a a山 m is i如 li a L . ; e h fo or g e n i e a e id e o n t e n t ; u latr s o n i e e x tr a e t io n ; h ihg p e r -
fo mr an
e e liq u id e homr
a 脚p h y
绿原酸 ( e h l o or 罗 n i e a e id ) 是由咖啡酸 ( c a l fe i
a e id )与奎尼酸 ( q u i n i e a e id )组成的缩酚酸 ,是植
物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种
苯丙素类化合物 。 医学上具有利胆 ,抗菌 , 降压 ,
增高白血球及兴奋中枢神经系统等多种药理的作
用川 。 为众多药材 (如金银花 、 杜仲 )以及中成药
(如复肝宁 、粉刺口服液等 )的主要成分 。 因此探
讨制备绿原酸分析样品的最适提取工艺条件对于
其他富含绿原酸的植物资源的利用有着重要的指
导意义 。
近年来绿原酸含量的提取方法主要有水提醇
沉 4[] 、醇提铅沉 、水提石灰乳沉淀法等川 。 水提醇
沉使得绿原酸在提取过程中有一些损失 ,醇提铅沉
给产品带来重金属铅的污染 ,水提石灰乳沉淀法存
在着得率较低 、易分解的缺点。 以上提取方法作为
绿原酸分析样品的提取方法存在结果偏低的问题 ,
故本文以高效液相色谱法 t ’ ,5 一 ’ 〕作为测定豚草茎中
绿原酸含量的方法 , 以水为溶剂超声提取和 95 %
乙醇为夹带剂超临界萃取豚草茎中绿原酸制备了
分析样品 ,测定了豚草茎中绿原酸含量 。
仪器和材料
DK 一 9 8 一 I 电子恒温水浴锅 , JA SCO 高效液
相色谱仪 , 975 型紫外检测器 , BI O FU C E2 R 高速
冷冻离心机 , AB1 04 型电子天平 , PH A R MA IR A 恒
温水浴 , DS 一 3 0 0 A 超声波清洗机 , H A比 L 一 50 -
, 第一作者简介 : 赵听 ( 1 97 一 ) ,女 ,硕士研究生 ,主要从事植物学研究 。
收稿 日期 : 2X() 2 一 10 一 13
3 2卷
0 1超临界 COZ萃取仪 。
乙睛 、 甲醇为色谱纯 ,其余试剂均为分析纯 。
绿原酸标准样品 由中国药品生物制品检定所提
供 。 豚草于 20 1年 8 月采于牡丹江地区 ,取其茎
于 80 ℃烘干至恒重 ,粉碎至 40 目 。
2 实验方法
2
.
1 绿原酸含量的高效液相色谱分析
2
.
1
.
1 色谱条件 色谱柱 KY A TE CH ( 日本 )
O D S 柱 ( 4 . 6un x 2 5 e m
,
5林m ) ;流动相 : 乙睛 :水 :
冰乙酸 (体积比 ) = 10 : 90 : 5 ;流速 : l m u m in ;检测
波长 : 3 2 5mn ;进样量 10林 L 。
2
.
1
.
2 标准溶液的配制
精密称取绿原酸标准样品 10 m g 于 l o m L 容
量瓶中 , 以甲醇为溶剂超声助溶 ,待冷却至室温定
容 ,备用 。
2
.
1
.
3 标准曲线的绘制
分别精密吸取绿原酸标准溶液 0 . 12 5 、 o , 25 、
0
.
5
、
l
、
2
、
4
、
6
、
s m L 于 10 m L 容量瓶中 , 用甲醇稀
释至刻度摇匀 。 按照上述色谱条件分别取稀释后
样品及原标准溶液进样分析 。 每个样重复三次 ,
取峰面积平均值 , 得峰面积 ( )Y 与绿原酸浓度
( X ) )的线性回归方程为 : Y = 2 x 10 , x 一 3 1 9 6 2 ,
相关系数双 = 0 . 99 。 在该条件下 , 绿原酸浓度的
线性范围为 0 . 0 1 2 5 一 0 . 0 1 m g/ m L 。
2
.
1
.
4 绿原酸提取率的测定
将超声法提取并定容后的样品在上述色谱条
件下分析后 ,按下面公式计算绿原酸的提取率 :
绿原酸提取率%。 二 绿原酸浓度 x 提取液体
积 /豚草茎粉质量 x l (X刃
2
.
2 分析样品的制备
2
.
2
.
1 超声提取法
精密称取豚草茎粉 10 克于 l o m L 锥形瓶
中 ,加 60 m L 蒸馏水 , 提取温度 、 提取时间按 2 因
素 1 水平 u l , ’ ( 1 2 )的均匀实验设计进行 ,每个
样作三次重复 , 将提取液移人 25 m L 定容瓶中冷
却至室温 , 再用蒸馏水定容至刻度 , 巧 (众 ) r/ m in
离心 20 im n ,静置取上清液 ,在上述 H P cL 条件下
检测 ,每个样重复测三次 ,计算绿原酸提取率 。
2
.
2
.
2 超临界萃取法
用 95 % 乙醇溶液 Zo m L 浸润豚草茎粉 2 0 0
克 , 24 小时后在 30 M aP 压力 、 60 ℃下萃取 90 m in ,
巧 (X刃 r/ m in 离心 20 im n , 静置取上清液 , 在上述
H p L C 条件下检测 ,每个样重复测三次 , 计算绿原
酸提取率 。
2
.
3 精密度
精密称取 5 份豚草茎粉 , 每份 10 克 , 按照确
定的方法制备分析样品 ,并在选定的色谱条件下
分析绿原酸的含量 , 测得平均提取率 0 . 04 0 3输 ,
相对标准偏差为 1 . 24 见表 1 。
表 1 精密度结果分析
aT bl e I T卜e a n目ys is of het 概血 of p ecr i is on ds gr e
原料
R a w m al e ir al
豚草茎粉 st em 环川 d er of A栩必心访 a巾m自 i洲她 L
1 2 3 4 5
绿原酸含量 (知 ) c扭。功罗 n i e ac id e on ten t
平均提取率 (` ) A v e班罗 e效m c t i on 橄“
相对标准偏差 ( C V% ) R e l at ive satn daxd d e v iat ion
0
.
0 3 96 0
。以 0 1 0 . 叫0 5 0 . 以肠 0 .以的
0
. 以0 3
1
.
24
2
.
4 回收率测定
精密称取 3 份豚草茎粉 ,每份 50 克 , 分别加
人绿原酸标准品 2 毫克 。 按照确定的方法制备分
析样品 ,并在选定的色谱条件下分析绿原酸的含
量 , 测得平均回收率% . 1% 见表 2 。
3 结果与讨论
3
.
1 结果
通过均匀实验的结果分析表明 ,超声提取的
最佳条件是以水作为溶剂 ,在 60 ℃下提取 70 m in 。
在最佳条件下 测得 豚草 茎 中绿 原酸 提取 率
0
.
04 0 7%
。 。
以 9 5% 乙醇为夹带剂超临界 CO : 萃取豚草
茎中绿原酸 ,测得提取率为 0 . 0 1 87 %。
4 讨论
实验是通过 u , , ’ ( 1 2 )均匀实验设计表 (见
表 3) 进行的 ,连同结果一并列于表中。
2 期 赵 听等 :高效液相色谱法测定豚草茎中绿原酸含量的研究 187
表 2 回收率测定结果分析
Tab l
e
2 h T
e a n a lys is ofth e os d t ofP e e re n t e rcv o
e y r
原料
Ra w m at e ri以
豚草茎粉 St e m 卯w d e r ofA m b rOS 必 a
~
i如 l必 L
1 2 3
干样品质量 ( g )听 ~p e l ~“
绿原酸标准品添加量 ( m g ) e h lor罗n ie a e id s ta n d耐 sam p le e rc ru itm e n t
混合后样品绿原酸含量( m g ) e h lo功g e n ie a c id con t e n t in th e b le n d ed Sa m p le
原料中绿原酸含量 ( ` ) h c lor罗n ie a c id e n ote n t in th e aw rm a t e 石a l
回收率 ( % ) R ~ey rat r
e
平均回收率 ( % ) A v e a rge e rv coe y r耐e
相对标准偏差 ( Cv % )时 at ive stan d耐 dev iat in o
3
.
96 9 3
.
1 9 9 3
.
8 91
0
.
4 7 0 0
9 6
.
7 94
.
2
9 6
.
1
7 9
.
3
表 3实验条件及豚草茎中绿原酸含t 检测结果
Tab l
e
3 u
, , `
( 1 1
2
) xE p
e
ir m
e n tal e on d i t i
o
sn an d er
s血 5 by un ifo mr de s i ,
实验号
N o
.
提取温度 (℃ )
Ext哪 tde et m ep ar 加花
提取时间 ( m i n )
E x it习 c tde t i m e
提取率 (% )
Ext r a c it on ar t e
拟合值
iF t tde v al u e
残差值
Res i d u al v al u e
l 0
巧
0
.
02 3 6
0
. 创M 6
0
.
0 18 3 3 0
.
X() 5 2 7
0
.
X() 8 7 3
一 0 . (X峙 13
0
.
0 15 9 0
.
0 14 7 5 0
.
0 0 1 15
50103
0
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0
.
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0
.的 9 4 5 一 0 . 0() 2 2 50OU1.1
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0
.
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.
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.
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0
尸」伪J内,
0
.
02 0 3 9 0
.
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0
.
0 26 9 0
.
02 0 3 5 0
.
(X巧 5 5
0
.
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.
0 3 1 7 2 一 0 . 0的 7 2
0
.
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0
.
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0
.
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.
X() 3 17
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.
04 6 19
一 0 . X() 5 4 9
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0
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ǎ演à咽如0 . 0 3 42ǎ演à酬如
〔) . 00 4 5
0
.
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.
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0
.
0 1:37
0
.
0 13 3
0
.
( ) 12 9
0
.
0 12 5
10
.
0 2 2
.
5 3 5
.
0 4 7
.
5
温度 ( ℃ )
6 0
.
0
10 : 15 6 ( ) 85 1 1( )
时间 (m )
F ig
图 1 温度变化的影响
仆 e e玉e t Of t h e e han ge Of t em ep art u er
图 2 时间变化的影响
F ig
.
2 hT
e e
fe
e t Of th e e h a n ge of t im
e
植 物 研 究 2 3卷
对结果进行逐步回归分析 ( 引入变量 F 一 检
验值 F , = 0 . 050 , 剔 除变量 F 一 检验值 凡 二
0
.
0 5 0 )
得如下回归方程 :
Y = 0
. 以 4 2 16 1 一 0 . 0() l 7 8 4 OX I -
0
. 〕沉) 3 18 0X 2 + 0 . (兀旧 0 27 4X I X : + 0 . (兀心 阅 7
I X , Xz + 0
. 侧刃 O以) 6瓜凡
其中 : X :一提取温度 瓜一提取时间
回归方程的 F = 5 . 研2 3 > aF ( 0 . 05 0 0) 二
5
.
0 5 0 0 显著 , 回归方程有 意义 。 复相关系数
R 二 0
.
921 7
, 残差标准差 S = 0 . 《X巧 7 ,残差平方和
SE 二 0
. 仪旧 2 ,通过回归方程的计算可 以得出在
60 ℃时提取率最大 , 即最优解 X , = 60 ,凡 = 1 10 。
对影响绿原酸提取率的各因素进行逐步回归
模型分析 ,得到各因素对绿原酸提取率影响的变
化曲线图 ( 图 1 、 图 2 ) 。 从图中可以看出 , 提取温
度对提取率的影响较大 ,并且呈现从 10 ℃至 25 ℃
提取率逐渐降低 , 在 25 ℃时提取率达到最低 ,超
过 25 ℃随温度的不断升高提取率逐渐升高 ,但温
度过高对植物的次生代谢产物会有影响 , 因此 ,温
度不宜选取过高以 60 ℃为宜 。 提取时间对绿原
酸提取率的影响不大 。
以 9 5% 乙醇为夹带剂超临界 CO Z萃取豚草
茎中绿原酸 ,测得提取率为 0 . 0 1 87 输 ,可见超
声提取法的得率明显高于超临界 C 0 2萃取法的得
率 , 而且具有操作简单 ,提取原料成本低 , 提取时
间短的优点 。
参 考 文 献
1
, 戚向阳 ,张声华 , 杜仲叶绿原酸的提取 、分离和鉴定 ,植
物资源与环境 , 19 8 , 7 ( 1 ) : 61 一 62
2
. 高锦明 ,张鞍灵 ,张康健 ,等 . 绿原酸的分布 、 提取与生
物活性研究综述 ,西北林学院学报 , 19 9 , 14 ( 2 ) : 73 -
82
3
. 郑荣庆 ,李光秀 . 高效液相色谱法在中药材资源开发等
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4
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5
. 何心 ,石春伟 ,芦松萍 ,等 . 高效液相色谱法测定双黄连
粉针中绿原酸和咖啡酸含最 . 药物分析杂志 , 19卯 , 17
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相定量分析 . 药物分析杂志 , 20以) ,20 ( 5 ) , 29 3 一 29
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量方法的研究 . 植物研究 , 2X() l , 2 1 ( l ) 1 13 一 1 15