全 文 ：第 24 卷　第 3 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2004 年　7 月
Vol.24　No.3　　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH July 　2004
基金项目:国家自然科学基金项目(30271064)资助
第一作者简介:甘小洪(1974—),男 ,南京林业大学植物学专业在读博士生 ,主要从事植物学研究工作。
＊通讯作者　Author for correspondence
收稿日期:2003-10-20
毛竹茎秆纤维细胞发育过程中 ATP酶的超微细胞化学定位研究
甘小洪1　丁雨龙1＊　尹增芳2
(1.南京林业大学竹类研究所 , 南京　210037)
(2.南京林业大学森林资源与环境学院 , 南京　210037)
摘　要　采用磷酸铅沉淀技术 ,对毛竹茎秆纤维细胞发育过程中的 ATP 酶进行了超微细胞化学定
位研究。在初生壁形成时期 ,大量的 ATP 酶的活性产物沉积在质膜 、质膜内陷 、运输小泡 、胞间连丝
等膜体系以及细胞核和各种细胞器上;在次生壁形成的初期 , ATP 酶在多泡小体和裂解的液泡膜上
出现 ,凝聚并边缘化的染色质上仍然具有ATP 酶活性;随着次生壁的逐渐加厚 ,在前四年中持续存
在具有ATP 酶活性的质膜内陷结构 ,以后消失;而在六年生纤维细胞的质膜 、运输小泡 、纹孔 、胞间
连丝和凝聚化的染色质上仍然发现有明显的ATP 酶分布 ,并发现在染色质上ATP 酶活性会随着凝
聚程度的加深而增强。结果表明 ,ATP 酶在毛竹茎秆纤维细胞壁的整个形成过程中发挥重要作用 ,
而纤维细胞的次生壁形成过程是一个由核基因控制的主动的 PCD过程;并证实毛竹茎秆纤维细胞
的发育有别于其它木本植物纤维细胞的发育过程 ,这种纤维细胞是一种典型的长寿细胞 。
关键词　毛竹;纤维;发育;长寿细胞;ATP 酶
Ultracytochemical localization of ATPase during the fiber development in
Phyllostachys edulis culm
GAN Xiao-Hong1　DING Yu-Long1＊　YIN Zeng-Fang 2
(1.Bamboo Research Institute , Nanjing Forestry Univ ersity , Nanjing　210037)
(2.College of Forest Resources and Environment , Nanjing Fo restry University , Nanjing　210037)
Abstract　The ult racytochemical localization during the fiber development in the culm of Phyllostachys edulis
(Carr.)H.De Lehaie w as studied using a lead phosphate precipitation technique.During the primary wall
formation , ATPase deposits were distributed in the membrane systems such as plasmalemma , plasmalemma
invagination , transfer vesicles , plasmodesmata , and nucleus and all kinds of organelles.In the early stage of
secondary wall formation , the distributions of ATPase appeared in the multivesicular bodies and collapsed
tonoplast , but remained in agglutinated chromatin.During the thickening of secondary wall , the plasmalem-
ma invagination with ATPase would persist in the fiber of four-year-old culm , but not in that of six-year-old
culm.In one to six-year-old culm , ATPase would visualized in plasmalemma , transfer vesicles , pits , and
plasmodesmata and agglutinated chromatin of fiber , but would increased in chromatin w ith the increase of ag-
glutinated degree.These findings indicated that ATPase played a key role on the cell wall formation of fiber in
Phyllostachys edulis culm , and the formation of secondary wall was a typical programmed cell death(PCD),
which was an energy dependent active process and w as controlled by nuclear genes.In addition , the charac-
teristic distribution of ATPase showed that the culm fiber of Phyllostachys edulis , different from the fibers of
other woody plants , was a special long-lived cell.
Key words　Phyllostachys edulis;fiber;development;long-lived cell;ATPase
在我国 ,毛竹(Phyllostachys edulis(Carr.)H.De
Lehaie)是分布面积最大 、经济价值最高 、使用最广泛
的一种竹类植物 ,经常应用于建筑 、造纸等方面 ,而
茎秆纤维的结构特征影响着竹材的材质和纸浆造纸
的特性 ,与毛竹的利用密不可分。有关毛竹茎秆纤
维的形态和解剖结构已经有了许多报道[ 1～ 3] 。近年
来 ,我们对毛竹茎秆纤维发育过程进行了系统的解
剖学和细胞生物学研究 ,结果表明纤维的次生壁形
成过程就是一个典型的细胞程序性死亡(PCD)过
程 ,纤维细胞是一种特殊的长寿细胞 ,但还缺乏生理
生化方面的证据。ATP 酶是一种蛋白质 ,它不仅是
膜束缚的功能性蛋白 ,与各种膜体系和细胞器有着
广泛的联系 ,同时它在能量代谢 、物质的吸收和运输
等生理功能上具有重要作用[ 4] 。而通过对 ATP 酶
的定位研究 ,可以明确在某一时空内哪些细胞组分
在活跃地参与细胞代谢及个体发育过程[ 5] 。目前 ,
人们对不同植物的各种器官中的 ATP 酶活性进行
了较多的研究 ,但在纤维发育过程中尚无这方面的
报道。本文试图通过对毛竹纤维发育过程中 ATP
酶的超微细胞化学定位进行研究 ,为纤维细胞的发
育生物学提供生理生化方面的证据。
1　材料与方法
毛竹材料分两批采自南京林业大学竹类植物
园 ,其中 6 m高的幼竹和 7 m高的一年生竹秆采于
2003年 5月 21日 ,而 2 ～ 6年生竹秆采于同年的 6
月4日。幼竹从上 、中 、下部节间取样 ,而 1至多年
生竹秆从中部节间取样。取材后将材料切成 1 mm3
左右的小块分别固定。其处理 、固定和包埋等操作
程序均按王雅清等[ 5]的方法进行 ,ATP 酶活性的对
照为反应液中不加底物 ATP 和加入抑制剂 NaF。
包埋块在 LKB—V型超薄切片机上经金刚刀超薄切
片 ,ATP 酶活性反应的切片不经染色 ,而对照切片经
醋酸双氧铀染色后 ,都在 H —600 透射电镜下观察 、
拍照。
2　观察结果
毛竹茎秆纤维细胞的发育主要经历了初生壁形
成和次生壁形成两个阶段 。
2.1　纤维细胞初生壁形成阶段
在纤维细胞初生壁形成期 ,纤维细胞逐渐液泡
化 ,在纤维细胞与周围细胞之间的胞间连丝附近出
现质膜内陷。此时在质膜 、质膜内陷 、核膜 、运输小
泡和胞间连丝等膜体系以及细胞核分散的染色质和
核仁 、线粒体等细胞器上存在较强的 ATP 酶活性 ,
而液泡膜上的ATP 酶活性较弱(图版Ⅰ:1 ,2)。
2.2　纤维细胞次生壁形成阶段
在纤维细胞次生壁形成初期 ,纤维细胞具有中
央大液泡 ,细胞核染色质开始凝聚 ,但仍然存在完整
的核膜和清晰的核仁结构。此时 ,在纹孔部位(图版
Ⅰ:5)和环状片层(图版Ⅰ:3)上开始出现 ATP 酶活性
反应的沉积物 ,而液泡膜 、质膜和胞间连丝上 ATP
酶活性增强(图版Ⅰ:5),在凝聚的核染色质 、核仁 、运
输小泡和线粒体上仍然存在 ATP 酶活性(图版Ⅰ:
4)。
随着纤维细胞次生壁的逐渐加厚 ,线粒体逐渐
解体 ,在当年生茎秆纤维细胞裂解的液泡膜(图版Ⅰ:
6)和多泡小体(图版Ⅱ:7)上出现ATP 酶活性产物沉
积。以后随着纤维细胞发育年龄的增加 ,ATP 酶沉
积出现与年龄相关的变化:在一年生的茎秆纤维细
胞的纹孔道中出现具有 ATP 酶活性的运输小泡(图
版Ⅱ:8),这些运输小泡在六年生的茎秆纤维细胞中
将持续存在(图版Ⅱ:9);具有 ATP 酶活性的质膜内
陷结构仍然存在于四年生的茎秆纤维细胞中(图版
Ⅱ:10),而在六年生茎秆纤维细胞不再存在;在 1 ～ 6
年生的纤维细胞多泡小体 、质膜 、凝聚并边缘化的染
色质 、细胞质中的运输小泡 、纹孔部位和胞间连丝上
仍然存在ATP 酶活性(图版Ⅱ:11),但 ATP 酶活性
在核染色质上会随着凝聚程度的加深而逐渐增强
(图版Ⅱ:12)。
在酶反应液中不加底物 ATP 和加入酶抑制剂
NaF 的两个对照组中 ,均基本上没有观察到ATP 酶
活性反应(图版Ⅱ:13 ,14),表明实验结果是可靠的。
3　讨论
3.1　质膜内陷的性质和作用
在毛竹茎秆纤维初生壁形成的初期 ,有质膜内
陷结构存在于纤维细胞与周围细胞之间的胞间连丝
附近 ,并在质膜内陷结构上分布有大量的 ATP 酶;
这种具有 ATP 酶活性的质膜内陷结构将持续存在
于四年生的纤维细胞中 ,以后将不再存在。在植物
细胞的超微结构研究中可经常见到质膜以囊状或袋
状形式向细胞内陷入 ,形成质膜内陷的现象[ 6 ,7] 。这
种质膜内陷是一种动态结构 ,大多由靠近胞间连丝 、
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线粒体和高尔基体等细胞器的质膜陷入形成[ 8] ,与
细胞的内吞作用或胞吐作用[ 9]有关。在毛竹茎秆纤
维细胞初生壁形成阶段 ,此时在胞间连丝附近出现
的质膜内陷 ,其上分布有 ATP 酶 ,表明质膜内陷正
活跃地参与纤维细胞的伸长和初生壁的形成。它可
以通过胞吐作用向外分泌壁物质 ,以满足纤维细胞
旺盛代谢活动的需求。而纤维细胞在一至四年生茎
秆中正好处于次生壁形成积累的主要阶段 ,需要将
大量细胞质降解的产物运输并沉积到细胞壁上 ,此
时持续存在的具有 ATP 酶活性的质膜内陷结构同
样具有胞吐作用 ,可以将这些物质主动地从细胞膜
内向外运输并沉积到次生壁上 ,以满足次生壁快速
增厚的需要。随着茎秆纤维细胞年龄的增长 ,次生
壁的增厚程度逐渐减缓 ,不再需要将大量合成次生
壁的物质运输并沉积到次生壁上 ,此时具有胞吐作
用的质膜内陷结构也就不再存在。
3.2　ATP 酶在纤维细胞的细胞壁形成中的作用
在毛竹茎秆纤维细胞壁形成的整个过程中 ,一
直有ATP 酶的活性产物沉积在质膜 、运输小泡(包
括分布于细胞质和纹孔道里的运输小泡)和胞间连
丝上;另外 ,在初生壁形成时期 ATP 酶在细胞器上
有分布 ,但到了次生壁形成时期细胞器逐渐消失 ,
ATP 酶出现在多泡小体和纹孔道里。一般认为 ,在
质膜 、胞间连丝 、运输小泡等膜体系上的 ATP 酶主
要是参与物质的分泌和共质体运输过程 ,而在线粒
体和叶绿体片层内的 ATP 酶则主要参与物质的分
解和合成[ 10] 。我们以前的研究已经探明:毛竹茎秆
纤维细胞在初生壁形成时期可以借助胞间连丝将蔗
糖等合成细胞壁的原料从维管束运输到高尔基体及
内质网上 ,再经过这些细胞器合成构成细胞壁的物
质并以运输小泡的形式向外沉积到细胞壁上;而在
次生壁形成时期 ,随着细胞器的解体 ,构成次生壁的
物质一部分通过纹孔道 、运输小泡和胞间连丝从相
邻细胞主动获得 ,另一部分则通过多泡小体对细胞
质的主动分解而获得。以上合成细胞壁物质的主动
运输 、合成与分解过程 ,都需要消耗大量的能量 ,而
通过分布其上的ATP 酶对 ATP 的水解正好可以保
证整个细胞壁形成过程对能量的大量需求 。因此 ,
ATP 酶在毛竹茎秆纤维细胞细胞壁的整个形成过
程发挥了重要作用。
3.3　毛竹茎秆纤维细胞的次生壁形成过程是由核
基因控制的 PCD过程
一般而言 ,毛竹茎秆纤维细胞的次生壁形成过
程就是 PCD ,并在以前的研究[ 3]中观察到在次生壁
形成过程中出现了染色质的凝聚并边缘化和多泡小
体等典型的PCD现象。在本研究中观察到 ,染色质
上出现 ATP 酶的分布 ,并随着染色质的凝聚程度加
深逐渐增多;而且在次生壁形成过程中出现大量的
ATP 酶定位在多泡小体和裂解的液泡膜上 。以前
的研究曾认为 ,细胞核中的ATP 酶对染色质组装时
核小体之间的生理空间的形成和稳定起重要作用;
一般代谢活跃的细胞 ,核都有较强的 ATP 酶活性 ,
ATP 酶还可能同染色质的浓缩 、断裂等有关[ 11] 。在
毛竹茎秆纤维 PCD过程中出现 ATP 酶在染色质上
的分布 ,并随着染色质凝聚程度加深而增多的现象 ,
表明纤维细胞在次生壁形成过程中核染色质处于十
分活跃的代谢状态 ,并通过自身核染色质 ATP 酶的
水解作用提供能量促使染色质浓缩和断裂 ,最终导
致 DNA的降解 。同样地 ,纤维细胞可以通过定位在
裂解的液泡膜和多泡小体上的 ATP 酶的水解释放
大量的能量而主动地执行细胞质的原位自溶 ,为次
生壁的形成提供大量的物质来源。由此表明 ,毛竹
茎秆纤维细胞的次生壁形成过程是纤维细胞为了完
成终端分化而主动行使的细胞死亡过程 ,是与杜仲
(Eucommia ulmoides)次生木质部的分化过程[ 5]相似
的 ,由核基因控制的 PCD过程。
3.4　毛竹茎秆纤维细胞是一种典型的长寿细胞
一般认为 ,纤维细胞在成熟后将失去原生质体
成为只具细胞壁的死细胞;随着研究的深入 ,已经在
许多植物茎秆中发现纤维细胞在成熟后还可以存活
很长一段时间 ,甚至长达 20年之久[ 12] 。同样地 ,已
经证明毛竹茎秆纤维细胞在次生壁形成时期可以长
时间保存细胞核和胞间连丝。但以前的研究只是限
于形态学的描述 ,尚缺乏生理生化方面的证据 。而
几乎所有的生命体系都是以 ATP 作为能量载体 ,它
参与生命物质的代谢 、运输和信息传递等有关的能
量转换过程 。ATP 需要经水解后才能释放能量 ,因
此水解 ATP 就成为了每个有生命活力的细胞的基
本功能[ 13] 。通过检测 ATP 酶在细胞中的存在与
否 ,就可以作为证实细胞是否具有生命活力的一个
标准。在我们的研究中发现 ,在毛竹茎秆纤维细胞
次生壁形成的整个过程中都有ATP 酶分布在质膜 、
胞间连丝和运输小泡等膜体系上 ,表明纤维细胞在
次生壁形成的长时间里都保持旺盛的主动运输功
能;并且 ,长时间存在于凝聚化的核染色质上的 ATP
酶表明染色质在次生壁形成过程中都能长时间保持
旺盛的生命力。由此可以证实 ,尽管毛竹茎秆纤维
细胞在次生壁形成 早期就发生 PCD ,但这种纤维细
3593 期　　　　　　　　　甘小洪等:毛竹茎秆纤维细胞发育过程中 ATP 酶的超微细胞化学定位研究
胞可以在 PCD发生后长时间地保持旺盛的生命力 ,
并没有似导管[ 5]等细胞一样随着 PCD的进行而快
速结束生命 ,是一种典型的长寿细胞 。而正是其长
寿细胞的特性才保证了毛竹茎秆纤维细胞的次生壁
能在发生 PCD后随年龄的增加而逐渐加厚 ,进而保
证毛竹材质的优良特性。
参　考　文　献
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图　版　说　明
Explanation of plates
缩写:AL:环状片层;Ch:染色质;Mi:线粒体;Mv:多泡小体;
Nu:核仁;P:质膜;Pi:纹孔;PI:质膜内陷;Pd:胞间连丝;SW:
次生壁;T:液泡膜;TV:运输小泡。
图版Ⅰ　1.示初生壁形成时期 ATP 酶分布在质膜 、质膜内
陷、胞间连丝 、染色质 、线粒体和运输小泡上 , ×8 000;2.示
初生壁形成期 ATP 酶分布在分散的染色质和核仁上 ,
×8 000;3.示次生壁形成初期 ATP 酶在环状片层和凝聚的
染色质上的分布 , ×12 000;4.示次生壁形成初期 ATP 酶定
位在质膜 、线粒体 、凝聚的染色质和核仁上 , ×12 000;5.次
生壁形成初期 ATP 酶在质膜和纹孔 、胞间连丝上的分布 ,
×6 000;6.示次生壁形成时期 ATP 酶在裂解的液泡膜上的
分布 , ×6 000
图版 Ⅱ　7.示次生壁形成阶段 ATP 酶在多泡小体上的分
布 , ×5 000;8.示 1年生茎秆纤维细胞中 ATP 酶在胞间连
丝 、纹孔及其运输小泡上的分布 , ×12 000;9.示 6 年生茎秆
纤维细胞中 ATP 酶在胞间连丝 、纹孔及其运输小泡上的分
布 , ×12 000;10.示 4 年生茎秆纤维细胞中 ATP 酶在质膜
和质膜内陷上的分布×12 000;11.示 4年生茎秆纤维细胞
中ATP 酶在胞间连丝 、纹孔及其运输小泡上的分布 , ×35
000;12.6年生茎秆纤维细胞中 ATP 酶在凝聚的染色质 、质
膜和纹孔上的分布 , ×15 000;13.示不加底物 ATP 后不见
ATP 酶的活性反应发生, ×20 000;14.示加入酶抑制剂NaF
后没有ATP 酶的活性反应发生 , ×20 000
Abbreviations:AL:annulate lamella;Ch:chromatin;Mi:mito-
chondrion;Mv:multivesicle bodies;Nu:nucleolus;P:plasmalem-
ma;Pi:pit;PI:plasmalemma invagination;Pd:plasmodesmata;
SW:secondary wall;T:tonoplast;TV:transfer vesicle.
PlateⅠ　1.Showing ATPase visualized in plasmalemma, plas-
malemma invagionation , plasmodesmata, diffuse chromation , mi-
tochondrion and transfer vesicles , ×8 000;2.Showing ATPase
distributed in diffuse chromation and nucleolus , ×8 000;3.
Showing ATPase deposited in annulate lamella and agglutinated
chromatin, ×12 000;4.Showing ATPase localized in plas-
malemma, mitochondrion , agglutinated chromatin and nucleolus ,
×12 000.5.Showing the localization of ATPase in plasmalemma
and plasmodesmata, ×6 000;6.Showing collapsed tonoplast with
ATPase at the stage of secondary wall formation in culm fiber , ×
6 000
PlateⅡ　7.Showing the distribution of ATPase in multivesicles
during the formation of secondary wall in culm fiber , ×5 000;8.
Showing ATPase distributed in plasmodesmata , pits and transfer
vesicles of fiber in one year old culm , ×12 000;9.Showing AT-
Pase deposit in plasmodesmata , pits and transfer vesicles of fiber in
six-year-old culm , ×12 000;10.Showing ATPase localized in
plasmalemma and plasmalemma invagination of fiber in four-year-
old culm , ×12 000;11.Showing the localization of ATPase in
plasmodesmata, pits and transfer vesicles of fiber in four-year-old
culm , ×35 000;12.Showing the persistence of ATPase in ag-
glutinated chromatin , plasmalemma and pits , ×15 000;13.
Showing absence of ATPase deposit in the samples without sub-
strate ATP , ×20 000;14.Showing absence of ATPase deposit
in the samples with substrate in the presence of NaF , ×20 000
360 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　24 卷