全 文 ：第 22卷　第 3 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2002 年　7月
Vol.22　No.3　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH July , 　2002
几丁质酶基因表达载体构建及转化烟草的研究
徐香玲1 　李集临1　马兴红2
(1.哈尔滨师范大学生物系 , 哈尔滨　150080)
(2.东北农业大学 , 哈尔滨　150030)
摘　要　构建了一个含有多个调控序列的带有几丁质酶基因的植物表达载体。通过发根农杆菌
的 Ri质粒介导转化烟草的三个品种:K326 、RG11 、VA116。在卡那霉素抗性培养基上筛选 ,获得了
7株再生植株。以 PCR检测 、DNA斑点杂交证明表达载体构建成功 ,几丁质酶基因导入烟草并整
合到烟草基因组中。
关键词　表达载体;几丁质酶基因;烟草;Ri质粒
RESEARCH ON CONSTRUCTION OF AN EXPRESSION VECTOR
OF CHITINASE GENE AND ITS TRANSFORMATION INTO TOBACCO
XU Xiang-ling1　LI Ji-lin1 　MA Xing-hong2
(1.Harbin Normal Univesity ,Harbin 150080)
(2.Northeast Agricuiture University ,Harbin 150030)
Abstract　Expression vector containing a chitinase gene and some regulatory sequences was in this reseach.
Using the Ri plasmid of Agobacterium.rhizogenes , the chitinase gene was introduced into tobacco , three culti-
vars of tobacco.Seven plants were proved of be transformed tobacco by PCR detection ,by dot blot hybridiza-
tion.The result sussgested that the construction of the expression vector is successful and the chitinase gene
had integrated into tobacco genome.
Key words　expression vector;chitinase gene;tobacco;Ri plasmid
前　言
植物基因工程是在分子水平上进行遗传重组 ,
从而改良作物的品质 ,选育抗病优质的高产作物品
种 ,自 1983年首次获得转基因的植物以来 ,发展迅
速 ,硕果累累[ 1 , 4, 5] 。
目前在植物的遗传转化研究中 ,利用分子育种
技术向植物体内导入外源基因 ,有时表达的不强 。
为使导入的外源基因能充分的表达 ,需要有一个好
的表达载体[ 7] ,基于这种目的 ,我们构建一个具有多
个调控序列的新表达载体 。
烟草是一种重要的经济作物 ,又是基因工程典
范植物 。由于烟草的真菌病如赤星病的危害 ,严重
的影响烟草品质和产量 ,用一般的常规育种又难以
解决 ,采用基因工程育种的方法[ 3] ,以期获得抗赤星
病的烟草 。
本文的目的是构建一个带有几丁质酶基因的高
效表达载体并将其导入烟草 ,获得抗赤星病的烟草
品系 。
第一作者简介:徐香玲(1939-),女,教授 ,主要从事植物生物技术的研究。
收稿日期:2002-03-14
1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　菌种和质粒
大肠杆菌 DH5α由黑龙江省水产研究所提供 。
发根农杆菌 pRiA4b(R1000)由日本筑波大学遗
传子研究中心镰田博教授惠赠 。
质粒 pBi437(带有几丁质酶基因),具卡那霉素
抗性标记 ,由中科院遗传所提供。
载体质粒 pMHL7133-GUS为高效的表达载体 ,
具卡那霉素的抗性标记 ,由日本农林水产省农业生
物资源研究所大桥首席研究官惠赠 。
1.1.2　植物材料
烟草品种:K326 、RG11 、VA116由黑龙江省牡丹
江烟草研究所提供
1.1.3试剂与酶
限制性内切酶和其它酶购于大连宝公司 、
Promege公司和Gibcobrl公司 ,DNA 回收试剂盒和杂
交试剂盒购于北京原平皓生物技术公司 , PCR引物
由大连生物宝公司合成。
1.1.4　主要仪器
离心机:Beckman ALLegra 21R型
紫外检测仪:STS-20WM
恒温水浴锅:Neslab RTE-111
PCR仪:PTC-100等
1.2　方法
1.2.1　表达载体的构建
表达载体构建图如下:
1.2.2　方法:
　　1)质粒的提取[ 2] :
　　2)质粒 pBi437(酶切回收几丁质酶基因)和质粒
pMHL7133-GUS(酶切去掉 GUS 基因)分别用限制
性内切酶 Sac Ⅰ和 BamH Ⅰ进行双酶切
反应体系:
Buffer K(10×)　　1μl
质粒 DNA1μg
Sac Ⅰ 0.5μl
BamH Ⅰ 0.5μl
总体积 20μl
37℃温育 1.5 ～ 4h
酶切片段去磷酸化 ,用玻璃乳法回收酶切片段 。
载体 pMHL7133(去掉 GUS)与 1.1Kb的几丁质
酶基因连接。
3)将重组质粒 pMHL7133 -chi(几丁质酶基因)
克隆到大肠杆菌DH5α中 ,对重组子 DNA进行检测 。
4)植物的遗传转化
a)用冻融法将重组子 DNA 转化发根农杆菌感
受态细胞中 ,提取质粒 DNA进行检测 。
b)获得烟草的无菌苗 ,用具有几丁质酶基因的
发根农杆菌溶液采用叶盘法转化烟草。与农杆菌共
培养的叶片接于诱导选择培养基上(MS +NAA+6
-BA+Km),加羧苄青霉素(cb)进行除菌 ,直到移苗
为止 。在诱导培养基上培养 3-5周出现绿色的小
芽 ,将其转于生根培养基上(1 2MS +NAA+Km +
cb),待植株长至适宜大小后移入蛭石 ,二周后移入
土中 。(图版Ⅱ:1.2.3.4.5.6)
1.2.3　转基因植株的检测
植物 DNA的提取采用 CTAB法 ,以二种引物进
行PCR扩增检测外源几丁质酶基因。
几丁质酶基因引物:
Primer1:GCAGTGTGGAGGGCAAGCAG
Primer2:CTGAGAGGTGACAAGGTCAG
CaMV35S 启动子和Nos终止子序列的引物:
Primer1:CTGACGTAAGGGATGACGC
Primer2:CATCGCAAGACCGGCAAC
反应条件:
3193期　　　　　　　　　　　　徐香玲等:几丁质酶基因表达载体构建及转化烟草的研究
94℃　　　　　5min
95℃ 15s
53 ～ 63 30s
72℃ 30s
72℃ 5min
DNA斑点杂交:采用随机引物法标记探针(地
高辛标记试剂盒)。电泳 ,预杂交 ,杂交 ,显色 ,照相 。
2　结果
2.1　表达载体的构建
2.1.1　质粒 pBin437 , pMHL7133-GUS 载体质粒和
重组子用几丁质酶基因(chi gene)的引物扩增结果:
提取 pBin437 质粒 , pMHL7133-GUS 和重组质
粒的 DNA ,分别用几丁质酶基因(chi gene)的引物扩
增 ,扩增结果见图版 Ⅰ:3。其中 pBin437质粒和重
组子 DNA均扩增出 0.9Kb的一条带(引物序列位于
1.1Kb几丁质酶基因的内部), pMHL 7133-GUS 和
水均未扩增出几丁质酶基因特异的 0.9Kb带。
2.1.2　pBin437质粒 , pMHL7133-GUS 载体质粒和
重组子酶切的结果:
提取 pBin437 质粒 , pMHL7133-GUS 和重组子
的DNA ,以限制性内切酶 Sac Ⅰ和 BamH Ⅰ进行双酶
切 ,酶切产物电泳(如图版 Ⅰ:4)。结果 pMHL7133
-GUS 切下约 1.8Kb 的 GUS 基因的片段 , pBin437
质粒切下 1.1kb的几丁质酶基因片段 ,重组子同样
也切下 1.1Kb的几丁质酶基因片段 ,与预期结果一
致。
2.1.3　pBin437质粒 , pMHL7133-GUS 载体质粒和
重组子的分子杂交结果:
杂交结果表明(图版 Ⅰ:6),pBin437质粒和重组
子的分子杂交均呈阳性 ,pMHL7133-GUS 载体质粒
呈阴性。
综上所述证明几丁质酶基因的高效表达载体已
构建成功 。
2.2　转化烟草的结果:
2.2.1　用于转化的三个烟草品种 ,经培养3 ～ 5周 ,
产生幼芽并形成再生植株 ,经卡那霉素的抗性筛选 ,
不同品种产生的抗性芽数和再生植株数有差异 ,见
下表:
2.2.2　转化的再生植株检测:
1)PCR的检测
提取再生植株总 DNA为模板 ,以几丁质酶基因
两端序列合成的引物进行 PCR扩增 , 7株再生植株
均扩增出 0.9Kb的带 ,而未转化的植株未扩增出带
(见图版Ⅰ :1 ,2)。初步证明几丁质酶基因已导入受
体的植株中。
表 1　三个烟草品种转化的频率
Table 1 Transformation efficiency of three cultivars of tobacco
品种
Cultivars
感染叶片数
No. of leaf
blade
产生的抗性芽
No.of resis-
tance bud
每个叶片产生的芽
No.of adventi-
tious bud of
leaf
成活植株
No.of su-
rvived re-
generate
K326 23 50 2.17 3
VA116 21 68 3.24 3
RG11 11 90 8.18 1
总计 55 208 7
　　2)DNA的斑点杂交
对 7 株 PCR 呈阳性的再生植株的 DNA 以
CaMV35S 启动子和 Nos终止子序列合成的引物扩
增 ,电泳。同时 ,以限制性内切酶 Sac Ⅰ和 BamH Ⅰ
双酶切 pMHL7133-chi载体质粒并以 Chi引物进行
PCR扩增 ,产物电泳 ,回收 1.1Kb的几丁质酶基因片
段 ,采用随机引物法以地高辛标记探针 ,同上述扩增
产物杂交结果(如图版Ⅰ :5 ,6)证明几丁质酶基因已
导入烟草并整合到烟草基因组中。
3　讨论
3.1　构建表达载体中影响限制性内切酶酶切效果
的因素
表达载体构建的成功与否 ,关键是限制性内切
酶酶切的效果 ,成功的进行酶切的重要因素是:
1)DNA底物:DNA 样品制备的好与坏 ,直接影
响酶切的效果 。DNA浓度是酶切成功的关键 ,由于
大量质粒 DNA 存在于小体积的溶液中 ,形成粘性
DNA溶液会抑制酶的扩散和降低酶的活性 。经多
次实验我们认为 ,酶切时酶的浓度为 0.1 ～ 0.4μg μl
较为适宜 。序列内的核苷酸甲基化也影响酶切效
果 ,如果某些限制酶对甲基化的抑制敏感 ,通常相应
的限制酶不受影响 ,识别位点邻近的 DNA 末端也会
影响酶切的效果 ,对于 PCR产物的酶切 ,这一点更
应当引起注意 。
2)反应条件:双酶切时反应条件十分重要 ,尤
其是反应缓冲液的条件 ,当两种酶要求的缓冲液有
差异时 ,应采取以下的方法:先用低离子强度 、缓冲
液活性高的酶切割 DNA ,然后加入适量的NaCl和第
二种酶 ,再继续温育;另一种方法是使用通用的酶 。
本实验就是使用 0.5×buffer ,在盐的浓度上是二种
缓冲液的折中 ,收到良好的效果。
3)反应体积:酶切时由于在高于37℃条件下保
温时间较长 ,常会导致水分的蒸发 ,使酶切溶液浓度
发生改变 ,应在反应液上加适量的矿物油防止水分
320 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　22 卷
蒸发和浓度改变 。
4)星型反应:限制内切酶的星型反应指识别序
列特异性的丧失 ,导致样品DNA切割条带增多。出
现星型反应的原因是盐的浓度降低 ,非适宜的 PH
值 ,有机溶剂和高浓度甘油的存在 。在我们的实验
中 ,由于先使用国产的 BamH Ⅰ酶切质粒载体 pM-
HL7133-GUS ,然后又用大连宝公司的 Sac Ⅰ酶切 ,
结果出现了星型反应 ,影响了实验的效果。在双酶
切或多酶切时 ,应选用性能一致的酶 ,防止星型反应
的出现。
3.2　转化植株的检测
1)卡那霉素(Km)筛选的浓度
抗生素的筛选浓度对不同的植物是不同的 ,就
一种作物的不同品种而言 ,应找到抗生素的某一适
当浓度筛选转化植株 。抗生素的抗性不仅与植物是
否具有抗性基因有关 ,也与植物的基因型 、植物的代
谢 、生理状态等多种因素有关。本实验开始用
150mg L抗生素筛选 ,然后再分级降低抗生素的浓
度筛选 ,结果得到 7株转化的植株。所以 ,用抗生素
筛选时 ,使用的浓度对于准确的筛选转化植株是至
关重要的 。
2)抗性芽诱导生根的培养基的选择
MS ,1 2MS , 1 2MS +0.2mg L NAA 均可利于生
根 ,我们认为对于烟草芽的生根以 1 2MS+0.2mg L
NAA为宜 。抗性芽不易生根原因是长期处于芽诱
导的激素中 ,转入生根培养基加入少量NAA有利于
抗性芽从一种状态转变为另一种状态 ,能很好的生
根。对于转基因植株的生根培养基的选择是应引起
重视的。
参　考　文　献
1.任如意.发根农杆菌 Ri质粒介导的 PVY , TMV 和 CMV 外
壳蛋白基因转化烟草和黄瓜的研究:[ 硕士学位论文] .哈
尔滨:哈尔滨师范大学 , 1994
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493
图　版　说　明
图版Ⅰ
图 1 , 2:转基因植株经 PCR扩增出 1.1Kb 几丁质酶基因的片
段
从左至右:阴性对照 , 阳性对照 , K326 品种获得的 3 株转基
因植株 , VA116 获得的 3株转基因植株 , RG11 的 1 株转基因
植株 ,Marker
图 3 , 4:重组子的检测
3 从左至右:pMHL7133-GUS , pBin437 , 重组子 ,水
4 从左至右:Marker ,重组子 , pMHL7133-GUS , pBin437
图 5 , 6:DNA 的分子杂交
5 从左至右:上:阴性对照 , 阳性对照 , K326 的 3 株转基因植
株;下:RG11 的转基因植株 , VA116的 3 株转基因植株
6 从左至右:重组子 , pBin437 , pMHL7133-GUS
图版Ⅱ
图 1 , 2:烟草叶片的转化
图 3:烟草叶片的边缘产生愈伤组织
图 4 , 5:愈伤组织再生小植株
图 6:再生的小植株移入土中
Explanation of plate
plateⅠ
1 , 2:Chitinase gene of 1.1kb fragment from PCR amplification
Left to right:negative positive , three transgenic plants of K326 ,
transgenic plant of RG11 ,Marker
3 , 4:Detection of recon:
3:Left to right:pMHL7133-GUS , pBin437 , recon , water
4:Left to right:Marker , recon , pMHL7133-GUS , pBin437
5 , 6:DNA dot blot hybridization:
5:Left to right:
Top:negative , positive , three transgenic plants of K326
Following:transgenic plant of RG11 , three transgenic plants of
VA116 6:Left to right:recon , pBin437 , pMHL7133-GUS
plate Ⅱ
1 , 2:Transformation of leaf blade of tobacco
3:Callus of leaf margin of tobacco
4 , 5:Survived regenerate of callus
6:Survived regenerate into soil
3213期　　　　　　　　　　　　徐香玲等:几丁质酶基因表达载体构建及转化烟草的研究