全 文 ：第 23 卷　第 3 期　　　　　　　　　　　　　植　　　物　　　研　　　究 2003年　7 月
Vol.23　No.3　　　　　　　　　　　BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH July , 　2003
东北延胡索愈伤组织培养及延胡索乙素形成的适宜条件
张东向1 李显峰2　邵淑丽1
(1.齐齐哈尔大学生命科学与工程学院 , 齐齐哈尔　161006)
(2.山东省金乡第一中学 , 金乡　272200)
摘　要　比较了东北产两种延胡索各器官的愈伤组织发生情况 ,采用单因子和正交设计试验 ,对
齿瓣延胡索(Corydal is remota)愈伤组织生长及延胡索乙素形成的适宜条件做了研究 。结果表
明 ,齿瓣延胡索各器官对培养基的响应性均显著高于东北延胡索(C.ambigua),其块茎愈伤诱导
率高达 93.3%;MS培养基对于愈伤组织诱导较White有利 ,2 mg·L-1 2 ,4-D与 1 mg·L-1 KT 的
组合愈伤诱导率最高 ,并适于继代培养。正交试验结果表明 ,愈伤组织生长和延胡索乙素形成的
适宜条件存在差异 ,在 27组处理中 ,1号培养基有利于培养物鲜重的提高 ,9号有利于干物质的积
累 ,10号则有利于的延胡索乙素形成;培养基中几种无机离子和有机成分均显著影响愈伤组织生
长和延胡索乙素形成 ,NH4+/NO3-与 Ca2+和 K+之间的交互作用对于生物量积累和延胡索乙素
含量均有显著影响。
关键词　延胡索;外植体;培养基;愈伤组织;延胡索乙素
CALLUS CULTUREANDCONDITIONSFORDL-TETRAHYDROPALMATINE
FORMATIONIN CORYDALIS YANHUSO FROMNORTHEASTOF CHINA
ZHANG Dong -Xiang1　LI Xian-Feng2　SHAO Shu-Li1
(1.Colleg e of Life Science and Technology , Qiqihaer University , Qiqihaer　161006)
(2.The First M iddle School of Jinx ian , Shandong , Jinxiang　272200)
Abstract　Formation status of callus from different organs were compared betw een the two species of
Corydalis Y anhuso from Northeast area.Sui table medium for callus grow th and fo rmation of dl-
tetrohydropalmatine(THP)of C.remota were studied employing monofactorial experiment and or-
thogonal design.The results showed that responsibility among different o rgans of C.remota to me-
dia w as stronger than that of C.ambigua , and induce rate of callus f rom stem tuber w as 93.3%
high.MS medium was sui table for callus g row th , and inductivity of callus in the combination of 2
mg/ L 2 , 4-D and 1mg/L K T was the highest among the tests , and the callus was suitable fo r subcul-
ture.The experiment of o rthogonal design indicated that there w as difference of suitable culture con-
di tion betw een grow th of callus and formation of THP .In 27 different media , No.1w as the best fo r
increasing fresh w eight of callus , and No.9 w as the best fo r accumulation of dry matter , while No.10
medium was the best for format ion of THP.Either inorganic ions or organic components were the
黑龙江省自然科学基金(D01-16)和齐齐哈尔市青年基金资助项目。　　第一作者简介:张东向(1963-),男 ,理学硕士 ,副教授 ,从事植物生理与植物细胞工程研究。　　收稿日期:2002-06-24
factors significantly af fecting g row th of callus fo rmation of THP.Biomass accumulation and THP
content w ere all af fected by the mutual ef fects of NH4
+/NO3-w ith ei ther Ca2+o r K+.
Key words　Corydalis Y anhuso;explant;medium ;callus;dl-tet rohydropalmatine
　　植物组织和细胞培养产生次生代谢产物的研
究始于五十年代。1982年 ,日本率先把用细胞培
养法生产紫草宁及其衍生物投入实际应用 ,随后人
参 、西洋参 、长春花和黄连等植物细胞培养也相继
获得成功[ 1 , 2] 。目前 ,用植物组织培养技术生产次
生代谢产物(尤其是药物)已发展成为植物组织培
养在生产应用中的两大主流之一。
　　有关利用延胡索组织和细胞培养提取延胡索
乙素的研究 ,在国外尚未见报道;在国内仅有中国
医学科学院[ 3]和浙江省医学科学院[ 4]开展过浙江
正品延胡索的组织培养研究 ,并利用蜜环菌诱导技
术把培养物中原鸦片碱(PTP)含量由痕量提高到
0.114%DW;延胡索乙素(THP)含量由0.030%
DW 提高到 0.061%DW[ 3] 。齿瓣延胡索(Cory-
dalis remota Fischet.Maxim.)和东北延胡索(C.
ambigua Cham.et Schltd.var.amurensis Max-
im.)是黑龙江省特有的两个种 ,有关其愈伤组织形
成的品种差异的研究尚未见报道;培养基包含各类
无机离子和有机组分 ,有关它们对东北延胡索愈伤
组织诱导和延胡索乙素形成的影响 ,尤其各组分之
间交互作用的研究 ,亦未见报道 。在此 ,我们对两
种东北产两种延胡索种各器官的愈伤组织发生情
况做了比较 ,研究了两种培养基对齿瓣延胡索愈伤
组织形成的影响 ,采用正交试验设计对培养基中几
种无机离子和有机成分对细胞生长和延胡索乙素
含量的影响进行了分析。
1　材料与方法
1.1　材料
　　实验材料为齿瓣延胡索(Corydal is remota
Fischet Maxim.)和东北 延胡索 (C.ambigua
Cham.et Schltd.var.amurensis Maxim.),均由沈
阳药科大学药用植物园提供 。
1.2　愈伤组织的诱导
1.2.1 外植体的选择 、灭菌和培养 分别以齿瓣
延胡索 、东北延胡索不同器官为外植体 ,按前文的
方法进行[ 5] 。
1.2.2 培养基的选择 分别以 MS 和White 为
基本培养基 ,以 2 ,4-D和 NAA 及其与两种细胞分
裂素形成若干浓度组合 ,并添加 3%的蔗糖和 450
mg·L-1水解酪蛋白(CH), pH 5.8 ,比较两种培养
基及不同激素组合对愈伤组织的诱导效果 ,统计愈
伤组织诱导率 ,并记录继代培养中的生长状况。选
择松散 、易碎的鲜黄色愈伤组织 ,继代培养在 MS
培养基+2 ,4-D 2 mg·L-1 ,蔗糖 、CH 用量及 pH 值
同前 。
1.3 正交试验设计
　　采用正交试验设计 ,研究了培养基各主要无机
和有机成分对继代培养中愈伤组织生长及延胡索
乙素含量的影响。以 MS 为基本培养基 ,附加 2
mg·L-1 2 ,4-D。采用 L27(313)正交表[ 6] ,设计 8因
素(表 1)3 水平(表 2)的正交试验 ,参试因子为
NH4
+/NO3-、Ca2+、K+ 、维生素 B1 、肌醇 、甘氨酸
和 pH 值 ,同时 NH4+/NO3-与 Ca2+之间的交互作
用安排在第 3 、4 列 , NH4+/NO3-与 K+的交互作
用安排在第 8 列。共设 27种处理 ,每处理重复 3
次。以上无机盐分别以 NH4Cl、KNO3 、KH2PO4 、
CaCl2 、KCl等形式提供 ,以上药品均为分析纯(A.
R.)。每瓶接种用无菌电子天平 ,于超净台上准确
称取愈伤组织 1.0 g ,每瓶接种 3块 ,培养 3周后终
止 ,测定鲜重 、干重和延胡索乙素含量 。实验结束
后 ,对测定结果进行方差分析 。
表 1 L27(313)正交试验表头设计
Table 1 A rrangement of factors in L27(313)or thogonal design
因素
Factors
NH4
+/NO 3- Ca2+ 交互作用
Mutual effect
VB1
肌醇
Inositol
H2PO 4
- 交互作用
Mutualef fect
K +
误差项
Error
甘氨酸
Glycine
pH
列号 1 2 3　4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
3033 期　　　　　　　　　张东向等:东北延胡索愈伤组织培养及延胡索乙素形成的适宜条件
表 2 L27(313)正交试验各因素的水平设计
Table 2 De termination of levels from each factor in L27(313)orthogonal design
水平数
Levels
NH4
+/NO 3-
(mmol·L-1)
Ca2+
(mmol·L -1)
VB1
(mg·L -1)
肌醇
Inositol
(mg·L-1)
H2PO 4
-
(mm ol·L -1)
K +
(mmol·L -1)
甘氨酸
Glycine
(mg·L -1)
pH
1 10/ 40 1 0.4 0.1 1.25 5 0.3 5.2
2 20/ 40 3 0.8 0.2 2.50 10 0.9 5.5
3 30/ 40 5 1.2 0.3 3.75 20 1.8 5.8
1.4　生理生化指标的测定
1.4.1 细胞鲜重 、干重的测定 按前文的方法进
行[ 5] 。
1.4.2 延胡索乙素的薄层层析 —紫外分光度法
检测
样品的制备和延胡索乙素含量的测定均按前文的
方法进行[ 5] 。
2 实验结果及分析
2.1　延胡索愈伤组织诱导的种类和器官差异
　　以齿瓣延胡索和东北延胡索几种器官为外植
体 ,比较其愈伤组织诱导的效果(表 3)。从表 3中
可以看出 ,齿瓣延胡索各器官对培养基的响应性均
明显高于东北延胡索 ,而且以其块茎的愈伤组织诱
导率最高 ,达 93.3%,为东北延胡索块茎的 4.0
倍。这表明齿瓣延胡索块茎是愈伤组织诱导和培
养的理想材料 。
2.2 齿瓣延胡索愈伤组织诱导的培养基和激素
组合比较
　　比较了培养基和激素组合对齿瓣延胡索愈伤
组织诱导的作用效果。表 4显示 ,采用 MS培养基
对于诱导愈伤组织较为有利 ,其中 2 mg·L-12 , 4-D
+1 mg·L-1KT 的组合不仅愈伤组织诱导率高 ,而
且培养物的生长状况也最好 ,愈伤组织呈鲜黄色 ,
松脆 、易碎 ,增殖速度快 ,适于长期继代培养 。而
White培养基虽采用 2 , 4-D与细胞分裂素组合有
一定比例愈伤组织形成 ,但在继代培养中生长缓
慢 ,有褐变现象发生 。
表 3　延胡索愈伤组织诱导的品种和器官差异
Table 3 Effects of variety and source organ on induction of callusin Corydalis Yanhuso
齿瓣延胡索
C.remota Fischet Maxim.
东北延胡索
C.ambigua Cham.et S chltd.var.am urensis Maxim.
块茎
Stem tuber
叶片
Leaf
叶柄
Petiole
块茎
Stem tuber
叶片
Leaf
幼根
Root
接种块数
Number of explants
30 30 30 30 30 30
形成愈伤数量
Number of callus
28 3 2 7 1 0
愈伤诱导率(%)
Induce rate of callus
93.3 10.0 6.7 23.3 3.3 0
继代培养生长状况
Propagat ion of callus
in subcultu re
++++ ++ + ++ - -
表 4 齿瓣延胡索愈伤组织诱导的培养基和激素组合比较
Table 4 Effects of media and phy toho rmones on induction of callusin C.remota
培养基
Media
植物激素组合
Combination of phytohormones
(mg·L -1)
愈伤组织诱导率
Inducerate of callus(%)
继代培养生长状况
Propagation of callus
in subculture
MS 2 , 4-D 1.0+BA 0.2 77.5±5.1 +++
2 , 4-D 2.0+KT 1.0 90.2±7.0 ++++
NAA 1.0+KT 0.2 51.3±6.6 +
NAA 2.0+BA 1.0 72.0±6.5 +++
White 2 , 4-D 1.0+BA 0.2 56.7±6.5 ++
2 , 4-D 2.0+KT 1.0 61.3±7.2 ++
NAA 1.0+KT 0.2 16.1±2.3 +
NAA 2.0+BA 1.0 22.8±3.8 +
304 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　23 卷
2.3 培养基主要成分对愈伤组织生长和 THP 含
量的影响
　　表 5 显示在 27 种处理中 ,1 号培养基的鲜重
最高 ,达 13.8±1.0 g ,9号培养基最有利于干物质
积累 ,干重为 0.61±0.13 g;延胡索乙素含量则以
10号培养基最高 ,为 0.118 mg·g-1 DW ,该含量与
报道的生药样品中 THP 含量接近 。从对 L27(313)
正交试验结果(表 5)的分析来看 , NH4+/NO3- 、
pH和 Ca2+的作用效果最为显著。NH4+/NO-3 在
低比值时 ,有利于愈伤组织生长及干重的增加 ,加
速培养物生物量的积累 ,但20 mmol·L-1/40 mmol
·L-1可显著促进 THP 含量的提高 。培养基 pH 对
于培养物鲜重 、干重和 THP 有显著影响 ,其中 pH
5.2对于三者的作用效果最适宜 , pH 值提高作用
效果下降;高 Ca2+浓度可提高培养物的鲜重和干
重 , 而 THP 的积 累却需要低 水平的 Ca2+。
H2PO4
-对于鲜重 、干重的作用达极显著水平 ,并显
著影响 THP 含量 ,低水平时对于生物量积累有利 ,
而当浓度提高到 3.75 mmol·L -1则适宜 THP 的合
成。K+对于培养物干重和 THP 含量的影响达极
显著水平 ,干物质积累以 10 mmol·L-1为宜 , 当
K+浓度提高到 20 mmol·L-1则促进 THP 合成;
K+对于鲜重的影响未达到显著水平。此外 ,
NH4
+/NO3-与 Ca2+的交互作用对于生物量积累
和 THP 含量的影响达极显著水平 , NH4+/NO3-
与 K+的交互作用也显著影响干物质积累和 THP
合成 。在三种有机组分中 ,低水平的维生素 B1 有
利于培养物鲜重和 THP 含量的提高 ,而肌醇则在
高水平时最适宜。甘氨酸浓度适中(0.9 mg·L-1)
最有利于培养物 THP 含量提高 ,但它对生物量积
累的影响未达到显著水平。
表 5 固体培养 L 27(313)正交试验结果
Table 5　Experimental results from L 27(313)orthogonal design
处理号 Rank 1 2 3 4 5 6 7 8 9
鲜重(g/瓶重)
Fresh t.(g/ Flash) 13.8 10.9 9.4 9.5 9.9 9.1 11.9 8.7 13.1
干重(g/瓶)
Dry t.(g/ Flash) 0.44 0.47 0.42 0.48 0.51 0.41 0.61 0.42 0.66
THP含量(mg·g -1DW)
THP cont.(mg·g -1DW) 0.058 0.050 0.048 0.027 0.022 0.015 0.017 0.022 0.022
处理号 Rank 10 11 12 13 14 15 16 17 18
鲜重(g/瓶)
Fresh w t.(g/ Flash) 4.3 5.1 4.5 4.0 4.8 4.9 7.7 5.7 4.2
干重(g/瓶)
Dry w t.(g/Flash) 0.30 0.32 0.30 0.28 0.28 0.34 0.53 0.55 0.35
THP含量(mg·g -1DW)
THP cont.(mg·g -1DW) 0.118 0.057 0.050 0.041 0.028 0.022 0.011 0.015 0.031
处理号 Rank 19 20 21 22 23 24 25 26 27
鲜重(g/瓶)
Fresh w t.(g/ Flash) 3.6 3.2 3.8 4.7 5.1 4.2 3.9 3.9 3.8
干重(g/瓶)
Dry w t.(g/Flash) 0.23 0.22 0.20 0.24 0.30 0.36 0.24 0.28 0.26
THP含量(mg·g -1DW)
THP cont.(mg·g -1DW) 0.057 0.042 0.060 0.022 0.010 0.012 0.029 0.065 0.016
3053 期　　　　　　　　　张东向等:东北延胡索愈伤组织培养及延胡索乙素形成的适宜条件
表 6　固体培养 L27(313)正交试验结果分析
Table 6 Vaniance analysis on the results from L27(313)orthogonal design
参试因素
Factors
NH4
+/NO3
(mmol·L-1)
Ca2+
(mmol·L-1)
维生素B1
Vetamin B1
(mg·L-1)
肌醇
Inositol
(g·L-1)
H2PO4
-
(mmol·L -1)
K +
(mmol·L -1)
甘氨酸
Glycine
(mg·L -1)
pH
鲜
重
(g)
FW
Ⅰ 96.32 58.56 65.84 59.84 64.00 62.43 63.23 57.40 60.43 57.76 58.59 62.80 67.20
Ⅱ 45.27 54.87 54.12 56.64 57.60 55.40 54.20 59.45 61.20 62.23 62.01 56.63 58.40
Ⅲ 36.24 64.40 57.87 61.56 56.23 60.00 60.40 60.98 56.20 57.84 57.23 58.40 52.23
F值 167.18＊＊ 3.68＊＊ 3.73＊＊ 2.74＊ 2.04(＊) 3.40＊＊ 0.52 1.16 1.61 9.02＊＊
干
重
(g)
DW
Ⅰ 4.42 2.98 3.16 3.02 3.44 3.36 3.47 3.17 3.14 3.20 3.33 3.48 3.59
Ⅱ 3.26 3.21 3.32 3.52 3.40 3.24 3.04 3.33 3.68 3.45 3.38 3.22 3.46
Ⅲ 2.36 3.89 3.56 3.50 3.20 3.44 3.53 3.54 3.22 3.39 3.33 3.34 2.99
F值 44.44＊＊ 15.33＊＊ 3.05＊＊ 1.29 1.04 3.57＊＊ 2.04(＊) 4.13＊＊ 1.33 4.72＊＊
THP
(mg/ g
DW)
Ⅰ 0.281 0.540 0.255 0.357 0.381 0.323 0.290 0.384 0.260 0.321 0.360 0.291 0.399
Ⅱ 0.373 0.197 0.399 0.280 0.309 0.352 0.305 0.308 0.351 0.322 0.260 0.406 0.213
Ⅲ 0.311 0.228 0.311 0.328 0.275 0.290 0.370 0.273 0.354 0.322 0.345 0.268 0.353
F值 3.24＊＊ 28.12＊＊ 4.12＊＊ 3.78＊＊ 2.33＊ 2.95＊ 3.99＊＊ 3.72＊＊ 5.68＊＊ 8.53＊＊
　　F6 ,78 ,0.1=1.85; F6 , 78 , 0.05=2.21; F6 ,78 ,0.01=3.04。
(＊)p<0.1;＊<0.05;＊＊p<0.01。
3　讨 论
在中药延胡索的地方品种中 ,齿瓣延胡索和东
北延胡索在东北地区具有一定代表性.齿瓣延胡索
药材断面呈深黄色 ,含延胡索乙素 ,可考虑与正品
通用;东北延胡索药材断面呈淡黄色或白色 ,未发
现含延胡索乙素[ 7] 。我们在本文中 ,比较了它们
在愈伤组织诱导方面的品种和器官差异 ,这种差异
可能是两者基因型不同造成的。在本研究所使用
的培养基中 , MS 是高盐培养基的主要代表 ,其中
富含 KNO3 ,且 NH4+含量亦较高;White 则是典型
的低盐培养基 ,不含铵盐[ 8] 。这两种培养基对齿
瓣延胡索愈伤组织的诱导表现出了显著差异(表
4),MS培养基更为有利 ,这提示 NH4+对于愈伤组
织的诱导可能是必要的。
这一点也为我们的正交试验结果所证实 。从
对正交试验结果的分析来看 , NH4+/NO3-和 Ca2+
是决定延胡索细胞生长和 THP 形成的显著因子 ,
在愈伤组织培养中低比值的 NH 4+/NO3-对生物
量的积累有利 ,但适当提高该比值则有利于提高
THP 含量 ,这与条叶龙胆的实验结果一致[ 9] ;高
Ca
2+水平虽有利于生物量积累 ,但降低 Ca2+水平
却也能提高 THP含量。这表明齿瓣延胡索愈伤组
织生长和延胡索乙素形成对培养基成分要求并不
一致 ,提示用细胞培养方法生产延胡索乙素 ,宜采
用两步培养法[ 8] 。在愈伤组织培养中 , NH4+/
NO3
-和 Ca2+的交互作用达到极显著水平 ,NH4+/
NO3
-和 K+的交互作用也显著影响干物质积累和
THP形成。这种交互作用的影响 ,在以往的同类
研究中未见报道 ,而实际上 ,在细胞大量(发酵)培
养中培养基各组分之间存在的交互作用是不容忽
视的重要因素 。
H2PO4
-是调节 THP形成的显著因子 ,高水平
H2PO4
-有利于 THP 的产生;维生素 B1 对于培养
物鲜重也具有显著影响 ,低水平的维 B1 对提高培
养物鲜重和 THP 形成有利 ,肌醇对于鲜重和 THP
形成同样显著 。在愈伤组织培养中 ,培养基 pH 值
是调节细胞生长和 THP 形成的重要因素 ,低 pH
有利于加速细胞生长 ,促进干物质积累和 THP 形
成;而 K+浓度适中显著提高培养物干重和 THP
含量 。甘氨酸虽对生物量积累的影响未达到显著
水平 ,但其浓度适中(0.9 mg·L-1)却有利于培养
物 THP 含量提高 。
对正交试验中各主要因素的作用进行比较可
以看出 ,愈伤组织生长对各营养因子的要求均比较
严格 ,对愈伤组织鲜重影响最显著的前三位因素是
NH4
+/NO3- 、pH 值和 NH4+/NO3-与 Ca2+交互
作用;对干物质积累影响最显著的前三位因素是
NH4
+/NO3-、Ca2+和 pH值 。而培养物 THP 形成
306 　　　　　　植　　物　　研　　究　　　　　　　　　　　　　　　　　　23 卷
对各营养因子水平变化更为敏感 ,其中影响最显著
的前三位因素是 Ca2+、pH 和 Gly ,NH4+/NO3-与
K+交互作用的影响居第四位 。
致谢　沈阳药科大学吴维春先生提供试验材料 , 并给予品
种鉴定 ,谨此致谢!
参　考　文　献
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学出版社 , 1978
2.尹作鸿 ,朱蔚华.植物组织与细胞培养生产有用次生产物
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产.中药通报 , 1987 , 12(4):11 ～ 14
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乙素含量的影响.植物研究 , 2003 , 23(1):86 ～ 90
6.北京大学数学力学系.正交设计———一种安排多因素试
验的数学方法.北京:人民教育出版社 , 1977
7.奚镜清 ,金联诚 , 忻纳新 ,等.中药材延胡索的品种整理及
文献索证.现代应用药学 , 1995 , 12(4):12 ～ 15
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出版社 , 2001
9.张治国 ,韩献忠 , 蔡志光 ,等 , 条叶龙胆愈伤组织培养基
龙胆苦甙形成.植物学报 , 1992 , 34(2):96 ～ 100
3073 期　　　　　　　　　张东向等:东北延胡索愈伤组织培养及延胡索乙素形成的适宜条件