全 文 ：植　　　物　　　研　　　究
BULLETIN OF BOTANICAL RESEARCH
第 19 卷　第 3 期 1999 年　7 月
Vol.19　No.3 July , 　1999
大蒜根尖细胞有丝分裂同步化诱导与中期染色体分离
彭永康1　赵　建2　陈瑞阳2
(1.天津师范大学生物系 ,天津　300074)　(2.南开大学生物系 ,天津　300071)
摘　要　本研究以大蒜(Allium sativum)根尖为材料 ,用 HU-APM 双阻断法对细
胞有丝分裂中期同步化和前 、后 、末期部分同步化作了探讨 ,表明在 1.25mmol/L
HU ,4μmol/APM 处理可使细胞有丝分裂中期指数(Met.I)达 35%, 18hr的 HU 单
独处理可检测到 27%的前期分裂细胞 。HU 对后 、末期的部分同步化也有明显作
用 ,约有 17%的后 、末期细胞被检测到 。用 Schubert 介绍的方法 ,分离出中期染色
体 ,每微升悬浮液中含 170条染色体。
关键词　同步化;中期指数;大蒜;羟基脲;甲酰氨草磷
INDUCTION OF SYNCHRONY AND ISOLATION
OF METAPHASE CHROMSOMES FROM MITOTIC
ROOT TIP CELLS IN ALLIUM SATI VUM
Peng Yong-kang1　Zhao Jian2　Chen Rui-yang
(1.Department of Bio logy , T ianjin Normal University , T ianjin 300074)
(2.Department of Bio logy , Nankai University , Tianjin 300071)
Abstract　In this study , metaphase cell synchrony and prophase , anaphase-telophase
partial synchrony during mitosis of roo t tip cells in All ium sativum have been studied
by using hydroxyurea(HU)and amiprophosmethyl(APM)treatment.It w as show n
that metaphase index(Met.I)can be increased around 35%at 1.25mmol/ L HU plus
4μmol/L APM treatments in root tip cells.About 27%prophase cell division can be
detected w hen root tips t reated for 18hr w ith 1.25mmol/L HU.Partial synchroniza-
tion of cell division at anaphase-telophase has also been obtained only using HU treat-
ment , mitotic f requency has reached at 17%.
Metaphase chromosomes isolat ing f rom root tip cells w as performed using Schu-
国家教委跨世纪优秀人才基金资助项目。　收稿日期:1998-7-6
bert method , about 170 chromosomes were obtained in per-microlitre of the isolation
buf fer.
Key words 　Synchronization;Metaphase index ;Allium sativum ;Hydroxyurea;
Amiprophosmethy l
由于高等植物细胞同步化可得到大量分裂一致的细胞群体 ,便于研究细胞周期和分裂
调控 、染色体显微切割 、原位杂交及生化特性等 ,故同步化的诱导一直受到高度重视 。然而 ,
迄今几乎植物细胞有丝分裂同步化诱导和染色体分离均是以悬浮细胞系为材料〔1～ 3〕 ,直接
以根尖细胞为材料诱导有丝分裂同步化并分离染色体国外只有少数报道〔4 ～ 5〕 ,我国除周钟
信〔6〕等以玉米细胞系为材料作过有丝分裂同步化诱导和染色体分离外 ,尚未有人直接以根
尖为材料 ,开展同步化诱导和染色体分离的研究。
本文用羟基脲(Hydroxyurea.HU)和甲酰氨草磷(Amiprophose methyl.APM)双阻断法
对大蒜根尖分生组织有丝分裂中期高频率同步化诱导进行了实验 ,并对染色体分离及前期 、
后期 、末期细胞有丝分裂部分同步化作了初步探讨 ,下面报道的是我们的初步结果。
1　材料和方法
1.1　细胞有丝分裂中期同步化诱导
大蒜(Allium sativum)蒜瓣洗净后23℃下 1.25mmol/L HU 中处理 16 ～ 24h ,蒸馏水洗
净后转入水培 5h ,然后在 4μmol/L APM 中继续培养 3 ～ 6h 。将同步化根尖分成 2份 , 1份
固定于 70%乙醇中 ,另 1份迅速置染色体分离缓冲液中。
1.2　细胞有丝分裂样品制备和中期染色体分离
将固定根尖用碳酸品红染色 ,压片后光镜下检查并统计细胞有丝分裂中期指数(Met.
I)。中期染色体的分离参照 Schubert〔4〕介绍的方法 ,先将根尖分生组织(约 0.2cm)置染色
构体分离缓冲液中(15mmol/ L Tris-HCl , 80mmol/L KCl , 20mmol/L NaCl , 2mmol/L ED-
TA , 0.5mmol/ L精胺 , 0.1% Triton x 100 , 15mmol/ L巯基乙醇 ,pH7.5),用组织捣碎器匀
浆破壁 ,匀浆液分别用 300目 、400目三层不锈钢网抽滤 ,除去未裂解细胞和间期核。用注
射器来回抽动匀浆液数十次 ,破膜使释放部分染色体 ,取滤液加至 40%蔗糖分离液中 ,
350rpm 离心 20min ,进一步去核。取悬浮液 , 1000g 离心 15min ,取沉淀 ,再次用染色体悬浮
液悬起 ,如染色体纯度不够 ,可反复数次以达一定纯度为止 。
取分离悬浮液 1 ～ 2μl ,置干净载玻片上风干后滴一滴碳酸品红染液染数分钟 ,盖片并轻
压 ,光镜检查并照相 。
2　结果与讨论
2.1　用羟基脲(HU)和甲酰氨草磷(APM)双阻断法诱导大蒜根尖细胞有丝分裂中期同步
化。
以往对于植物细胞有丝分裂中期同步化诱导多采用 HU 和秋水仙素双阻断法 ,并且多
以悬浮细胞系为材料 ,但用这种方法诱导 ,其细胞有丝分裂中期指数(Met.I)偏低〔6〕 ,并且
悬浮细胞培养所需时间长 ,因此进展缓慢 。一些研究者为探讨一种简便且 Met.I 较高的诱
导方法 ,曾直接以根尖为材料 ,用 HU 和秋水仙素双阻断法诱导 。采用这种方法尽管 Met.I
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有所提高 ,但部分分裂细胞并未完全被阻断在中期 ,在经中期同步化的根尖细胞中尚可见到
不少前期和后 、末期细胞 ,因此 ,同步化效果并不理想。本研究参照 Pan〔7〕等在大麦 、春小麦
中采用的方法 ,用HU和 APM 双阻断法诱导大蒜根尖细胞有丝分裂中期同步化 ,得到较为
理想的结果 。我们发现 ,当在 23℃下用 1.25mmol/L HU 处理 18h ,室温下 4μmol/L APM
处理 5.5h ,其 Met.I 高达 35%(图 1a)。APM 是一种干扰细胞微管蛋白合成的特异性药
物〔8〕 。因此 ,它能阻止中期细胞纺锤丝的产生而使细胞分裂停留在中期。近来 ,国外一些
研究者将 APM 用于大麦 、春小麦等根尖细胞有丝分裂中期同步化诱导中〔7〕 ,但大蒜中还没
有正式报道 。图 1b是利用HU和 APM 双阻断后大蒜根尖细胞有丝分裂中期照片 ,可以清
楚的看到 ,细胞分裂基本被阻断在中期 ,除可见到部分间期细胞外 ,未发现前期和后 、末期细
胞 ,表明 ,利用 HU-APM 双阻断法可有效的将大蒜根尖分生组织细胞阻断在中期 。
图 1a　在 1.25mol/ L H U下培养 18h后的大蒜经 4μmol/ L APM 处理 1～ 6h 后根尖细胞中的百分率
Fig.1a　Percentage of metaphase root tip in Allium sativum after treatment with 1.25mmo l/ L HU
fo r 18hr and 4 μmol/ L APM fo r 1～ 6hr
2.2　细胞前 、后 、末期有丝分裂部分同步化诱导
一些研究者曾用 0.75mmol/L HU处理洋葱根尖 ,研究其对细胞有丝分裂的影响 ,结果
表明 ,当用 HU处理 8h后 ,分裂细胞中约有 80%〔9〕在 S期累积 ,但HU不影响 G1期细胞的
分裂 ,而对处于 G2期的细胞则有使其延缓进入 M 期的特性。这个实验结果表明 ,如果掌握
合适的HU浓度与时间 ,可望将植物细胞有丝分裂同步在前期。图 2a是我们在 23℃下 1.
25mmol/L HU 处理 18h后检测到的前期分裂细胞。统计结果表明 ,其频率已达到 27%。
很显然 ,HU在诱导大蒜根尖有丝分裂前期部分同步化方面起着重要的作用 。
尽管在动物中已有后 、末期有丝分裂同步化的报道 ,但在植物中还没有见到 。我们曾推
测 ,具有较高频率的中期同步化细胞在解除了 APM 药物抑制后可能会有部分中期细胞恢
复沿周期运行进入后 、末期 ,但实际结果与推测不同 ,由 HU 、APM 双阻断后同步在中期的
细胞去除 APM 转入水培使根尖恢复正常生长后再检测根尖中的细胞 。其后 ,末期细胞出
现的频率很低(1.5%)。但我们同时注意到 ,经HU部分同步在前期的细胞 ,去除HU作用 ,
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图 1b　经 HU-APM 双阻断后的大蒜根尖有丝分裂中期同步化细胞(600x)
Fig.1b　Mito tic metaphase synchrony cells in Allium sativum after treatment with HU-APM (600x)
图 2a　大蒜根尖部分前期同步化细胞(400x)
F ig.2a　Partial prophase synchrony cells of root tip in Allium sativum (400x)
水培使根尖恢复正常生长后却可检测到高达 17%左右的后 、末期细胞(图 2b)。这些后 、末
期细胞形态正常 ,它们中间有一部分可能是用 HU 同步在前期的分裂细胞在去除 HU 抑制
作用后恢复正常生长的结果 ,因为HU 对细胞分裂作了第一次阻断 ,使许多细胞分裂暂时累
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图 2b　大蒜根尖部分后 、末期细胞(400x)
Fig.2b　Partial anaphase-telophase cells of root tip in Allium sativum (400x)
积在 S期 ,当去除HU作用后 ,细胞恢复生长 ,因此有较多的后 、末期细胞 ,而对照中 ,未能检
测到如此高的后 、末期细胞 ,因为没有经 HU 的第一次阻断 。这样看来 ,似乎HU对后 、末期
细胞的同步化方面也起着一定的作用。
APM 的作用是破坏纺锤丝的形成 ,但被 APM 阻断在中期的细胞在去除 APM 的抑制
作用后 ,这些细胞是否还能恢复生长? 这方面至今尚未见到正式报道。本文中 ,当我们将
APM 处理后的具较高 Met.I的根尖去除 APM 的抑制作用 ,恢复生长后 1 ～ 24h内连续取
材观察 ,这些中期细胞似乎并没有能进入后 、末期 ,因为我们未能检测到较高频率的后 、末期
细胞 ,但这一问题尚需作更多的工作才能定论 。
2.3　中期染色体分离
中期染色体的分离与纯化在动物中较易成功 ,但在植物中由于细胞具有坚硬的细胞壁 ,
去壁进而裂解细胞难度大 ,加之去壁后留下大量的细胞碎片 ,为进一步纯化染色体增加了难
度 ,因而进展缓慢。当今 ,尽管分离高等植物染色体已有一些报道 ,但多以悬浮细胞系为材
料。本研究采用的分离中期染色体的方法是参照 Schubert〔4〕介绍的植物根尖分生组织细胞
中的分离方法 ,实验中省去了酶解步骤 ,改用将根尖置染色体分离悬浮液中 ,然后用机械方
法离散根尖细胞 ,去壁进一步裂解细胞使释放染色体 ,未破碎细胞 、间期核和较大细胞碎片
通过双层不锈钢网过滤弃去 ,滤液中的染色体和细胞碎片再经分部离心进一步分开 。图 3
所示为我们从 HU-APM 双阻断法同步化的大蒜根尖中期细胞中分离的部分染色体。光
镜观察表明 ,分离的染色体样品中 ,没有看到未裂解细胞和间期核 ,细胞碎片也不多。统计
结果表明 ,每微升染色体分离液中约含有 170条染色体 ,这一得率稍低于 Schubert〔4〕在蚕豆
根尖中所得到的结果 。
Pan等利用 HU 、APM 的双阻断法在大麦等根尖分生组织细胞中期同步化诱导中得到
高达 50%Met.I ,并将 APM 对中期细胞的诱导效果与秋水仙素作了比较 ,得出较有意义的
实验结果 ,但他们没有探讨双阻断过程中细胞的前期和后 、末期部分同步化现象 ,并且也未
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图 3　分离的大蒜根尖中期染色体(850x)
Fig.3　The chromosomes isolated from root tip cells in Allium sativum(850x)
对中期同步化细胞中的染色体进行分离 。本工作利用 Pan介绍的方法在大蒜根尖分生组织
中得到 35%的中期同步化细胞 ,并且还对前期和后 、末期细胞的部分同步化进行了观察和
统计分析 ,这对于进一步探讨 HU 、APM 对细胞有丝分裂的影响 、细胞有丝分裂不同时期同
步化诱导条件探讨都有参考意义。本工作还分离了根尖分生组织细胞中期染色体 ,这为进
一步研究染色体的结构 、功能 、生化特性提供了实验材料。因此 ,也是有价值的 。
参　　考　　文　　献
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