全 文 ：植物保护学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ２０１６， ４３（４）： ５８０ － ５８７ ＤＯＩ： １０􀆰 １３８０２ ／ ｊ． ｃｎｋｉ． ｚｗｂｈｘｂ． ２０１６􀆰 ０４􀆰 ００８
基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项（２０１５０３１１４），国家自然科学基金（３１４６０４６３）
∗通讯作者（Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）， Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｌｉｈｘ＠ ｇｓａｕ． ｅｄｕ． ｃｎ
收稿日期： ２０１５ － １１ － ２７
甘肃定西地区马铃薯线虫病病原的分离鉴定
李惠霞１∗　 徐鹏刚１ 　 李健荣１ 　 坚晋卓１ 　 赵　 鹏１ 　 彭德良２
（１．甘肃农业大学草业学院， 草业生态系统教育部重点实验室， 中 －美草地畜牧业可持续发展研究中心，
兰州 ７３００７０； ２．中国农业科学院植物保护研究所， 植物病虫害生物学国家重点实验室， 北京 １００１９３）
摘要： 为明确甘肃省定西市马铃薯线虫病的病原种群分类地位，采用形态学结合分子生物学的方
法对该地区马铃薯上的 ４ 个线虫群体进行了鉴定，观察和测量其形态特征值，基于 ｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ 序列
以 ＵＰＧＭＡ法构建线虫群体的系统发育树，并按照柯赫氏法则进行了致病性测定。 结果表明，４ 个
线虫群体在形态学上与马铃薯腐烂茎线虫 Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ 一致，但群体 ＤＸ２７ 与群体 ＤＸ１１、
ＤＸ１６、ＤＸ１９ 雌虫的体长、体长 ／食道长、体长 ／尾长值存在极显著差异。 利用通用引物 ＴＷ８１ ／ ＡＢ２８
扩增 ｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ序列均获得长度为 ９１５ ｂｐ的片段；序列比对分析表明，群体 ＤＸ２７ 与其它 ３ 个群体
相比在 ＩＴＳ１ 区的第 ９６ ～ ２５５ ｂｐ片段内有 ２５ 个碱基的差异；系统发育树显示，群体 ＤＸ２７ 与 Ｃ型群
体聚为 １ 支，群体 ＤＸ１１、ＤＸ１６、ＤＸ１９ 与 Ｂ型群体聚为 １ 支。 根据形态学特征及 ｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ 序列分
析结果确定该病原线虫为马铃薯腐烂茎线虫，其中群体 ＤＸ２７ 属于 Ｃ 型，群体 ＤＸ１１、ＤＸ１６、ＤＸ１９
属于 Ｂ型。
关键词： 马铃薯腐烂茎线虫； 马铃薯； 鉴定； 致病性
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ ｆｒｏｍ ｐｏｔａｔｏｅｓ
ｉｎ Ｄｉｎｇｘｉ ｏｆ Ｇａｎｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ
Ｌｉ Ｈｕｉｘｉａ１∗ 　 Ｘｕ Ｐｅｎｇｇａｎｇ１ 　 Ｌｉ Ｊｉａｎｒｏｎｇ１ 　 Ｊｉａｎ Ｊｉｎｚｈｕｏ１ 　 Ｚｈａｏ Ｐｅｎｇ１ 　 Ｐｅｎｇ Ｄｅｌｉａｎｇ２
（１． Ｓｉｎｏ⁃Ｕ． Ｓ． Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｇｒａｚｉｎｇｌａｎｄ Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ Ｓｕｓｔａｉｎａｂｉｌｉｔｙ； Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｇｒａｓｓｌａｎｄ Ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ
Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ； Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｒａｔａｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｇａｎｓｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００７０， Ｇａｎｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ；
２． Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｉｎｓｅｃｔ Ｐｅｓｔ， Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １００１９３， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｃｌａｒｉｆｙ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ ｉｎ Ｄｉｎｇｘｉ ｏｆ Ｇａｎｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， ｆｏｕｒ ｎｅｍａｔｏｄｅ
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｏｔａｔｏｅｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｔｈｅ
ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｗｅｒｅ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ａｎｄ ｍｅａｓｕｒｅｄ； ＵＰＧＭＡ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｒａｗ ｔｈｅ
ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ｎｅｍａｔｏｄｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅ， ａｎｄ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ
ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ Ｋｏｃｈ’ｓ ｒｕｌｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ
ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ， ａｎｄ ｔｈｅ ｂｏｄｙ ｌｅｎｇｔｈ， ｔｏｔａｌ ｂｏｄｙ ｌｅｎｇｔｈ ／ ｏｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｌｅｎｇｔｈ ａｎｄ ｔｏｔａｌ
ｂｏｄｙ ｌｅｎｇｔｈ ／ ｔａｉｌ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ｔｈｅ ｆｅｍａｌｅ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｔ Ｐ ＜ ０􀆰 ０１ ｌｅｖｅｌ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ
ＤＸ２７ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｔｈｒｅｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ． Ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｉｍｅｒｓ
ＴＷ８１ ／ ＡＢ２８ ｗｅｒｅ ９１５ ｂｐ ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ． Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｏｆ ２５ ｂａｓｅｓ
ｂｅｔｗｅｅｎ ＤＸ２７ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｔｈｒｅｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｎｏ． ９６ －２５５ ｂａｓｅｓ ｏｆ ＩＴＳ１ ｒｅｇｉｏｎ． Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｓｈｏｗｅｄ
ｔｈａｔ ｔｈｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ＤＸ２７ ｗａｓ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ Ｃ， ａｎｄ ｔｈｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＤＸ１１， ＤＸ１６ ａｎｄ ＤＸ１９
ｗｅｒｅ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ Ｂ． Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ａｎａｌｙｓｉｓ， ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｎｅｍａｔｏｄｅｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｄ． ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ， ａｎｄ ｔｈｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ＤＸ２７ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ
ｈａｐｌｏｔｙｐｅ Ｃ ａｎｄ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＤＸ１１， ＤＸ１６ ａｎｄ ＤＸ１９ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ Ｂ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ； ｐｏｔａｔｏ； ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ； ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ
　 　 马铃薯 Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ是全球第 ４ 大粮食作
物（谢从华，２０１２），在农业生产中具有重要的地位。
２０１５ 年，我国马铃薯主粮化战略启动，马铃薯将成
为继水稻 Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ、小麦 Ｔｒｉｔｉｃｕｍａｅ ｓｔｉｖｕｍ、玉米
Ｚｅａ ｍａｙｓ外的又一主要粮食作物。 马铃薯腐烂茎线
虫 Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ是我国重要的植物检疫性有
害生物（中华人民共和国进境植物检疫性有害生物
名录，２００７），其引起的马铃薯线虫病是马铃薯贮藏
期的一种重要病害（Ｈｏｏｐｅｒ，１９７３）。 该病害在欧洲、
南非和美洲许多国家和地区都有发生，主要为害马
铃薯（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ． ，２００９）；在中国很多地区已有
分布，主要为害甘薯 Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａ，一般可引起
甘薯田块减产 ３０％ ～ ５０％ ，严重时甚至绝收（朱秀
珍等，２００４）。 此外还可为害当归 Ａｎｇｅｌｉｃａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ、
薄荷 Ｍｅｎｔｈａ ｈａｐｌｏｃａｌｙｘ、三七 Ｐａｎａｘ ｎｏｔｏｇｉｎｓｅｎｇ 等，
严重时当归发病率达 ８４􀆰 ９％ （刘娟娟等，２０１５）。
目前，我国对马铃薯腐烂茎线虫危害马铃薯的
研究报道相对较少，丁再福和林茂松（１９８２）以及刘
先宝等（２００６）分别在江苏省和河北省发现马铃薯
腐烂茎线虫可为害马铃薯，并进行了形态鉴定；郭全
新和简恒（２０１０）也在河北省发现该线虫为害马铃
薯，并进行了形态学结合分子生物学的鉴定；王宏宝
等（２０１３；２０１４）将甘薯上分离到的马铃薯腐烂茎线
虫成功接种马铃薯薯块，并描述了发病症状。 但对
甘肃省马铃薯线虫病的研究尚未见报道。
马铃薯腐烂茎线虫种群的鉴定目前主要采用形
态学和分子生物学的方法，形态学鉴定主要是对马
铃薯腐烂茎线虫的一些重要分类特征进行测量，分
子鉴定中主要是对 ｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ区序列进行比对分析。
近年来，诸多研究表明马铃薯腐烂茎线虫存在种群
分化现象，如王金成等（２００７）对 ８ 个马铃薯腐烂茎
线虫群体的 ｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ序列进行了比对，发现我国的
马铃薯腐烂茎线虫种群明显分为 Ａ 型和 Ｂ 型 ２ 种
类型，Ａ型群体在 ＩＴＳ１ 区有 １８８ ｂｐ 片段的缺失；章
淑玲和张绍升（２００８）通过设计引物对获得的马铃
薯腐烂茎线虫群体的 ｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ１ 区序列进行比对，
认为我国马铃薯腐烂茎线虫群体的 ＩＴＳ１ 区序列分
化为 Ｓ型和 Ｌ型 ２ 种基因型；黄健等（２００９）对国内
２ 种类型的群体进行了形态学测量，发现 ２ 基因型
在尾长、ｃ值（体长 ／尾长）、Ｖ值（体前端至阴门的距
离 × １００ ／体长）和 Ｖ’值（体前端至阴门的距离 ×
１００ ／体前端至肛门的距离）等测计值上存在显著差
异。 而国外学者如 Ｓｕｂｂｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ． （２０１１）和 Ｊｅｓｚｋｅ
ｅｔ ａｌ． （２０１４）则将不同寄主上的马铃薯腐烂茎线虫
群体分为 ７ 个单元型。
随着马铃薯产业的不断扩大，线虫危害的风险
随之增加，了解马铃薯线虫病的发生情况并明确线
虫种类，对于该病害的及时控制尤为重要。 本研究
运用形态学结合分子生物学的方法对马铃薯上分离
到的线虫进行分类鉴定和致病性测定，旨在为马铃
薯线虫病的诊断和及时有效防治提供理论依据。
１ 材料与方法
１􀆰 １ 材料
供试虫源及马铃薯：线虫群体于 ２０１４ 年 １２ 月
和 ２０１５ 年 ３ 月采自甘肃定西地区贮藏窖中，带回实
验室后 ４℃冷藏柜保存备用。 马铃薯品种为新大
坪，由甘肃一航薯业科技发展有限责任公司提供。
试剂及仪器：线虫 ＩＴＳ 区通用引物 ＴＷ８１： ５′⁃
ＧＴＴＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣ⁃３′和 ＡＢ２８： ５′⁃ＡＴＡＴ⁃
ＧＣＴＴＡＡＧＴＴＣＡＧＣＧＧＧＴ⁃３′（刘斌等，２００７）及试验
所用其余试剂均购于生工生物工程（上海）股份有
限公司。 湘仪 Ｈ１８５０Ｒ 台式离心仪，湖南湘仪实验
室仪器开发有限公司；Ａｘｉｏ Ｓｃｏｐｅ Ａ１ 生物显微镜，
蔡司光学仪器（上海）国际贸易有限公司；ＤＹＣＰ⁃
３１ＤＮ 水平电泳仪，北京六一生物科技有限公司；
Ｂｉｏ⁃Ｒａｄ Ｓ１０００ＴＭＴｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ ＰＣＲ仪，北京赛百奥
科技有限公司。
１􀆰 ２ 方法
１􀆰 ２􀆰 １ 线虫的分离与玻片标本制作
线虫的分离参考徐进军等（２００４）的方法，将采
集到的病薯用自来水冲洗干净，切成小块，在漏斗中
放入铁丝网，上面铺 ２ 层面巾纸，将切好的病薯小块
放入漏斗中，从面巾纸背面加入无菌水，漏斗下面用
带橡胶管的指型管相连，２４ ｈ 后取下指型管，吸去
表层水。 用玻璃吸管将分离到的线虫转移至 ３５％
的蔗糖溶液中，３ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 ２ ｍｉｎ；取表层线虫
悬浮液，转移至无菌水中，３ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ离心 ２ ｍｉｎ；弃
１８５４ 期 李惠霞等： 甘肃定西地区马铃薯线虫病病原的分离鉴定
上清液，用 ０􀆰 ５％ 次氯酸钠消毒 ２ ｍｉｎ 后，移入
０􀆰 ５％青霉素和 ０􀆰 ５％硫酸链霉素混合液中消毒 １０
ｍｉｎ，离心后吸出消毒液，用无菌水冲洗 ３ 遍后 ４℃
保存备用。
玻片标本的制作参照周志强和程瑚瑞（１９９３）
的方法，取少量线虫悬浮液收集于 １􀆰 ５ ｍＬ 离心管
中，于 ６５℃水浴 ３０ ｓ 后，用 ＦＧ 固定液（福尔马林 ∶
甘油 ∶蒸馏水 ＝ １０ ∶ １ ∶ ８９）固定，固定好的线虫采用
甘油酒精脱水法（谢辉，２００５）进行脱水并制作永久
玻片。
１􀆰 ２􀆰 ２ 线虫的形态鉴定
应用 Ａｘｉｏ Ｖｉｓｉｏｎ ４􀆰 ８ 软件在生物显微镜下对马
铃薯腐烂茎线虫的主要形态特征进行测量并拍照。
根据 ｄｅ Ｍａｎ公式计算形态特征测计值，主要包括侧
线、ＳＴ． Ｌ（口针长度）、ａ （体长 ／最大体宽）、ｂ（体长 ／
食道长）、ｂ’（体长 ／体前端至食道腺末端的距离）、ｃ
（体长 ／尾长）、Ｖ（体前端至阴门的距离 × １００ ／体
长）、Ｖ’（体前端至阴门的距离 × １００ ／体前端至肛门
的距离）以及交合刺长和交合伞长等。 并参考刘维
志等（２００３）和谢辉（２００５）关于植物线虫分类系统
描述特征进行种属鉴定。
１􀆰 ２􀆰 ３ 线虫的分子鉴定
参照于海英等（２００９）的方法进行线虫 ＤＮＡ 的
提取，略有改动。 挑取线虫若干条，放入去离子水中
洗涤 ３ 次，备用。 在 ２００ μＬ ＰＣＲ反应管中加入无菌
ｄｄＨ２Ｏ １６ μＬ、ＰＣＲ缓冲液（１０ × ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ）２ μＬ、１
ｍｇ ／ ｍＬ蛋白酶 Ｋ ２ μＬ，向其中挑入 １０ ～ ２０ 条洗过
的线虫，放入液氮中冷冻 ３０ ｓ，取出后用 ７５％酒精
消毒的玻璃棒迅速研磨。 再置于 － ２０℃冷冻过夜
后，将 ＰＣＲ 反应管置于 ６５℃保温 １ ｈ，最后 ９４℃灭
活 １０ ｍｉｎ，离心后取上清液可直接用于 ＰＣＲ 扩增。
５０ μＬ ＰＣＲ 扩增反应体系：ｄｄＨ２Ｏ ２８􀆰 ６ μＬ、１０ ×
ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ、２５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＭｇＣｌ２ ５ μＬ、１０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
ｄＮＴＰ １ μＬ、１２􀆰 ５ μｍｏｌ ／ Ｌ 上下游引物各 ３ μＬ、５ Ｕ ／
μＬ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶 ０􀆰 ４ μＬ、模板 ＤＮＡ ４ μＬ。 反应
条件： ９４℃预变性 ４ ｍｉｎ；９４℃变性 １ ｍｉｎ，５５℃退火
１􀆰 ５ ｍｉｎ，７２℃延伸 ２ ｍｉｎ，３５ 个循环；最后 ７２℃延伸
１０ ｍｉｎ，４℃保存。
扩增产物在 １􀆰 ０％的琼脂糖凝胶中电泳检测
后，用 ＡｘｙＰｒｅｐ ＤＮＡ 凝胶回收试剂盒纯化 ＰＣＲ 产
物，将纯化后的 ＰＣＲ产物送生工生物工程（上海）股
份有限公司测序。 测序结果用 ＤＮＡＳｔａｒ软件进行序
列拼接后，在 ＮＣＢＩ中进行 ＢＬＡＳＴ比较，下载同源性
较高的部分马铃薯腐烂茎线虫 ＩＴＳ 序列，用 ＤＮＡ⁃
ＭＡＮ和 Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ １􀆰 ８ 软件进行序列比对分析后，采
用 ＭＥＧＡ ６􀆰 ０ 软件以 ＵＰＧＭＡ方法构建马铃薯腐烂
茎线虫群体的系统发育树，分析其系统发育特征。
１􀆰 ２􀆰 ４ 线虫的致病性测定
参照林茂松（１９８９）和宫卫波等（２００８）的方法，
将新大坪薯块洗净后，在 ７５％酒精中消毒 ５ ｍｉｎ 取
出晾干，用无菌解剖刀在薯块上切取一个深度约达
薯块中心的三角形薯块组织，用灭菌滴管吸取已消
毒的线虫约 １ ０００ 条接入三角形穴内，然后将切下
的三角形薯块组织塞回原处，石蜡封口。 接种后的
薯块置于 ２５℃培养箱中培养，４０ ｄ 后观察其侵染情
况，并重新分离鉴定线虫。
１􀆰 ３ 数据分析
采用 ＳＰＳＳ １９􀆰 ０ 统计软件进行试验数据分析，
应用 Ｄｕｎｃａｎ氏新复极差法进行差异显著性检验。
２ 结果与分析
２􀆰 １ 线虫的形态学鉴定
２􀆰 １􀆰 １ 形态特征描述
热杀死后线虫虫体略向腹面弯曲。 线虫唇区低
平，稍缢缩；口针长 １０ ～ １３ μｍ，基部球小而明显、圆
形；中食道球卵圆形，有瓣膜；后食道腺从背面略覆
盖肠的前端（图 １⁃ａ）。 尾圆锥状，稍向腹面弯曲。
雌虫阴门清晰，稍突起；后阴子宫囊较长，常延伸到
肛阴距的 ３ ／ ４ 处（图 １⁃ｂ）；雄虫交合刺略向腹面弯
曲， 基部膨大；交合伞从交合刺前端的水平处向后
延伸至尾长的 １ ／ ３ 处（图 １⁃ｃ）。 卵长椭圆形（图 １⁃
ｄ）。 虫体侧区侧线 ６ 条。
图 １ 马铃薯腐烂茎线虫的形态特征
Ｆｉｇ． １ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ ｏｆ Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ
ａ： 马铃薯腐烂茎线虫体前端； ｂ： 雌虫尾部； ｃ： 雄
虫尾部； ｄ： 卵。 ａ： Ｈｅａｄ； ｂ： ｔａｉｌ ｏｆ ｆｅｍａｌｅ； ｃ： ｔａｉｌ ｏｆ
ｍａｌｅ； ｄ： ｅｇｇ．
　
２８５ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
２􀆰 １􀆰 ２ 线虫的形态测计值
定西马铃薯上 ４ 个雌虫群体体长 ６８１ ～ １ ２９２
μｍ，ａ值为 ２９􀆰 ５ ～ ４１􀆰 ０，ｂ 值为 ５􀆰 ９ ～ １１􀆰 ９，ｃ 值为
１０􀆰 ４ ～ １６􀆰 ４，Ｖ 值为 ７４􀆰 ８ ～ ８４􀆰 ２；雄虫体长 ６５８ ～
１ ２４５ μｍ，ａ值为 ２９􀆰 ４ ～ ４５􀆰 ２，ｂ值为 ６􀆰 ０ ～ ９􀆰 ６，ｃ值
为 １０􀆰 ７ ～ １８􀆰 ５，其形态测计值与马铃薯腐烂茎线虫
的测计值基本一致。 但 ４ 个雌虫群体间存在差异，
其中 ＤＸ１１、ＤＸ１６ 和 ＤＸ１９ 三个群体间无极显著差
异；而群体 ＤＸ２７ 的体长极显著大于其它 ３ 个群体，
ｂ值极显著大于群体 ＤＸ１６，ｃ 值极显著大于 ＤＸ１６
和 ＤＸ１１ 群体（表 １）。 ４ 个雄虫群体间的形态测计
值无极显著差异。 结合形态特征，从形态学上将甘
肃定西马铃薯线虫群体初步鉴定为马铃薯腐烂茎线
虫，且群体 ＤＸ２７ 与 ＤＸ１１、ＤＸ１６、ＤＸ１９ 群体可能属
于 ２ 种类型。
２􀆰 ２ 线虫 ｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ序列分析
２􀆰 ２􀆰 １ ＰＣＲ产物检测结果
以 ＡＢ２８ 和 ＴＷ８１ 为引物，对 ４ 个线虫群体的
ｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ进行扩增，结果表明所有种群的序列长度
均为 １ ０００ ｂｐ左右（图 ２）。
表 １ 甘肃定西马铃薯腐烂茎线虫种群的形态测计值
Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ Ｄｉｎｇｘｉ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ
种群
Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ
雌虫群体 Ｆｅｍａｌｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ 雄虫群体 Ｍａｌｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ
体长 （μｍ）
Ｂｏｄｙ ｌｅｎｇｔｈ ａ ｂ ｃ Ｖ
体长 （μｍ）
Ｂｏｄｙ ｌｅｎｇｔｈ ａ ｂ ｃ
ＤＸ１１ ７３１ ～１ １０１
（８７７） Ｂ
３３􀆰 ３ ～３８􀆰 ３
（３５􀆰 ６） Ａ
７􀆰 ３ ～１０􀆰 ４
（８􀆰 ３） ＡＢ
１１􀆰 ６ ～１５􀆰 ５
（１３􀆰 １） Ｂ
７７􀆰 １ ～８３􀆰 ６
（８０􀆰 ４） Ａ
７３８ ～９９２
（８３０） Ａ
３１􀆰 １ ～４３􀆰 １
（３８􀆰 ３） Ａ
７􀆰 ０ ～８􀆰 ９
（８􀆰 ０） Ａ
１１􀆰 ８ ～１４􀆰 ３
（１３􀆰 ０） Ａ
ＤＸ１６ ６８１ ～１ １４２
（９２２） Ｂ
３１􀆰 ４ ～３６􀆰 ９
（３３􀆰 ７） Ａ
５􀆰 ９ ～１０􀆰 ４
（８􀆰 ２） Ｂ
１０􀆰 ４ ～１５􀆰 ８
（１２􀆰 ６） Ｂ
７７􀆰 ２ ～８３􀆰 ９
（７９􀆰 ９） Ａ
６７６ ～１ １２２
（９２７） Ａ
３０􀆰 ０ ～４５􀆰 ２
（３７􀆰 ４） Ａ
６􀆰 １ ～８􀆰 ４
（７􀆰 ７） Ａ
１１􀆰 ５ ～１６􀆰 ６
（１３􀆰 ４） Ａ
ＤＸ１９ ７９４ ～１ ０１２
（８９７） Ｂ
３１􀆰 ３ ～４１􀆰 ０
（３４􀆰 ０） Ａ
７􀆰 ６ ～９􀆰 ７
（８􀆰 ４） ＡＢ
１１􀆰 ６ ～１５􀆰 ２
（１３􀆰 ７） ＡＢ
７８􀆰 ７ ～８１􀆰 １
（８０􀆰 ４） Ａ
６５８ ～１ １６６
（８５８） Ａ
３１􀆰 １ ～４３􀆰 ８
（３８􀆰 ２） Ａ
６􀆰 ０ ～９􀆰 ６
（８􀆰 ０） Ａ
１０􀆰 ７ ～１７􀆰 ７
（１２􀆰 ８） Ａ
ＤＸ２７ ９０１ ～１ ２９２
（１１２１） Ａ
２９􀆰 ５ ～３８􀆰 ４
（３３􀆰 ５） Ａ
７􀆰 １ ～１１􀆰 ９
（９􀆰 ７） Ａ
１２􀆰 ９ ～１６􀆰 ４
（１５􀆰 ０） Ａ
７４􀆰 ８ ～８４􀆰 ２
（８０􀆰 ５） Ａ
７５６ ～１ ２４５
（９７５） Ａ
２９􀆰 ４ ～３９􀆰 ０
（３４􀆰 ０） Ａ
７􀆰 ３ ～８􀆰 ２
（７􀆰 ６） Ａ
１２􀆰 ８ ～１８􀆰 ５
（１５􀆰 ０） Ａ
　 　 ａ： 体长 ／最大体宽； ｂ： 体长 ／食道长； ｃ： 体长 ／尾长； Ｖ： 体前端至阴门的距离 × １００ ／体长。 表中数据为马铃薯腐烂茎线
虫主要形态测计值的范围，括号内为平均数。 同列数据后不同字母表示经 Ｄｕｎｃａｎ氏新复极差法检验在 Ｐ ＜ ０􀆰 ０１ 水平差异显
著。 ａ： Ｔｏｔａｌ ｂｏｄｙ ｌｅｎｇｔｈ ／ ｍａｘｉｍｕｍ ｂｏｄｙ ｄｉａｍｅｔｅｒ； ｂ： ｔｏｔａｌ ｂｏｄｙ ｌｅｎｇｔｈ ／ ｏｅｓｏｐｈａｇｅａｌ ｌｅｎｇｔｈ； ｃ： ｔｏｔａｌ ｂｏｄｙ ｌｅｎｇｔｈ ／ ｔａｉｌ ｌｅｎｇｔｈ； Ｖ： ｐｏｓｉ⁃
ｔｉｏｎ ｏｆ ｖｕｌｖａ ｆｒｏｍ ａｎｔｅｒｉｏｒ ｅｎｄ × １００ ／ ｂｏｄｙ ｌｅｎｇｔｈ． Ｄａｔａ ａｒｅ ｔｈｅ ｒａｎｇｅｓ ｏｆ Ｄ． ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ’ｓ ｍａｉｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ， ａｎｄ ｔｈｅ
ｄａｔａ ｉｎ ｂｒａｃｋｅｔｓ ａｒｅ ａｖｅｒａｇｅ ｖａｌｕｅｓ． Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｌｕｍｎ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｔ Ｐ ＜ ０􀆰 ０１ ｌｅｖｅｌ ｂｙ Ｄｕｎｃａｎ’ｓ
ｎｅｗ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒａｎｇｅ ｔｅｓｔ．
图 ２ 甘肃马铃薯线虫群体 ｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ序列
ＰＣＲ扩增产物
Ｆｉｇ． ２ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ ｏｆ Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ
ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｇａｎｓｕ
　 Ｍ： ＤＬ２０００ ｍａｒｋｅｒ； １ －４： ＤＸ１１， ＤＸ１６， ＤＸ１９， ＤＸ２７．
　
２􀆰 ２􀆰 ２ ｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ序列特征与聚类分析
测序拼接结果表明，所得 ４ 个线虫群体的 ｒＤ⁃
ＮＡ⁃ＩＴＳ序列长度均为 ９１５ ｂｐ，在 ＮＣＢＩ 中 ＢＬＡＳＴ 比
对发现与马铃薯腐烂茎线虫察北种群（ＦＪ９１１５５１）
的同源性在 ９９％以上。 用 ＤＮＡＭＡＮ 软件对所得 ４
个群体的 ｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ序列进行比对分析，发现 ＤＸ１１、
ＤＸ１６、ＤＸ１９ 三个群体的序列完全相同，且与群体
ＤＸ２７ 相比在 ＩＴＳ１ 区的 ９６ ～ ２５５ ｂｐ 片段内有 ２５ 个
碱基的差异（图 ３）。
将定西 ４ 个线虫群体提交 ＧｅｎＢａｎｋ，得到序列
号依 次 为 ＫＸ１８１６４７、 ＫＸ１８１６４８、 ＫＸ１８１６４９ 和
ＫＸ１８１６５０。 将其与 ＧｅｎＢａｎｋ 中下载的国内外 ７ 个
线 虫 群 体 （ ＥＦ０６２５７５、 ＡＭ２３２２２７、 ＡＹ９８７００７、
ＥＦ０６２５７２、ＦＪ９１１５５１、 ＫＣ９２３２２３、 ＥＦ０６２５７４ ） 的 ｒＤ⁃
ＮＡ⁃ＩＴＳ序列进行 Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ 比对分析后构建系统发
育树 （图 ４ ）。 １１ 个序列聚为 ３ 个分支， ＤＸ１１、
ＤＸ１６、ＤＸ１９ 群体和 Ｂ 型的 ＡＹ９８７００７、ＥＦ０６２５７２、
ＦＪ９１１５５１ 群体聚为 １ 个分支，ＤＸ２７ 群体和 Ｃ 型的
ＫＣ９２３２２３、ＥＦ０６２５７４ 群体聚为 １ 分支，Ａ 型的 ２ 个
３８５４ 期 李惠霞等： 甘肃定西地区马铃薯线虫病病原的分离鉴定
图 ３ 甘肃马铃薯上 ４ 个线虫群体间 ＩＴＳ１ 区的序列比较
Ｆｉｇ． ３ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ｏｆ ＩＴＳ１ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ａｍｏｎｇ ｆｏｕｒ Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｇａｎｓｕ
小写字母表示该处碱基不同； “ － ”： 碱基相同； “． ”： 碱基缺失。 Ｌｏｗｅｒｃａｓｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂａｓｅｓ ｆｒｏｍ ｃａｐｉｔａｌ
ｏｎｅｓ； “ － ”： ｓａｍｅ ｂａｓｅｓ； “． ”： ｌｏｓｔ ｂａｓｅｓ．
　
图 ４ 基于 ＵＰＧＭＡ法构建的甘肃马铃薯腐烂茎线虫系统进化树
Ｆｉｇ． ４ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｇａｎｓｕ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ＵＰＧＭＡ ｍｅｔｈｏｄ
　
群体 ＡＭ２３２２２７ 和 ＥＦ０６２５７５ 聚为 １ 分支，与形态学
鉴定结果一致。 在第 １ 分支中，与国内已报到的 ２
个马铃薯上的线虫群体 ＥＦ０６２５７２ 和 ＦＪ９１１５５１ 相
比，本研究的 ３ 个线虫群体与河北张北县线虫群体
ＥＦ０６２５７２ 具有更近的亲缘性。 因此，根据形态学特
征结合 ｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ序列分析结果，将该病原线虫确定
为马铃薯腐烂茎线虫，其中群体 ＤＸ１１、ＤＸ１６、ＤＸ１９
属于 Ｂ型，群体 ＤＸ２７ 属于 Ｃ型。
４８５ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
２􀆰 ３ 线虫的致病性
接种 ４０ ｄ 后观察接种薯块，其症状与自然发病
薯块（图 ５⁃ａ）基本相似，表现为表皮纸化，易剥离，
重量明显变轻（图 ５⁃ｂ）。 切开薯块，皮下组织为干
的白色小颗粒，接种处组织褐白相间，内部组织出现
糠腐，严重时呈黑褐色，最后整个薯块变成褐色糠心
状（图 ５⁃ｃ）。 用接种发病的薯块重新分离线虫，获
得了与原接种线虫一致的病原线虫，表明该线虫为
马铃薯腐烂病的病原线虫。
图 ５ 马铃薯腐烂茎线虫为害马铃薯的症状
Ｆｉｇ． ５ Ｔｈｅ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｆ ｐｏｔａｔｏｅｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ
ａ： 自然发病薯块； ｂ ～ ｃ： 接种薯块外观及内部。 ａ： Ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｔｕｂｅｒ； ｂ － ｃ： ｔｈｅ ｅｘｔｅｒｎａｌ ｏｒ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｕｂｅｒｓ ｉｎｏｃｕｌａ⁃
ｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｄ． ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ．
　
３ 讨论
本研究应用形态学结合分子生物学技术对甘肃
马铃薯主产区马铃薯上的病原线虫进行了鉴定和致
病性测定，将其鉴定为马铃薯腐烂茎线虫，进一步证
实了马铃薯腐烂茎线虫在我国也可以侵染马铃薯。
本研究对采自甘肃定西马铃薯上的 ４ 个线虫群体进
行了形态观察和体值的测量，形态特征与刘维志等
（２００３）和谢辉（２００５）对马铃薯腐烂茎线虫的描述
一致。 除雄虫口针长度和体长 ／尾长略有差异外，其
它形态测计值与 Ｔｈｏｒｎｅ（１９４５）、Ｇｏｏｄｅｙ（１９５２）、刘
维志等（２００３）、谢辉（２００５）等的报道基本一致，形
态测计值的略有差异可能是由于地理或寄主不同造
成的。 本试验中发现 ＤＸ１１、ＤＸ１６ 和 ＤＸ１９ 三个群
体的形态测计值无极显著差异，为 １ 个类型；群体
ＤＸ２７ 的体长、体长 ／体前端至食道与肠连接处的距
离、体长 ／尾长值明显不同于上述 ３ 个群体，为另外
１ 个类型，这与 ｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ序列分析结果相一致。
Ｊｏｎｅｓ ＆ ｄｅ Ｗａｅｋｅ（１９８８）认为马铃薯腐烂茎线
虫存在寄主专化小种，王金成等（２００７）通过 ｒＤＮＡ⁃
ＩＴＳ 序列分析和系统发育研究认为马铃薯腐烂茎线
虫可能是 １ 个复合种，并证实我国山东、山西、河北、
安徽和江苏等地 ７ 个甘薯上的群体分为 ２ 个分支 Ａ
和 Ｂ，且刘先宝等（２００８）、宛菲等（２００８）、张淑玲等
（２００８）、余海英等（２００９）也将甘薯上的线虫群体分
为 Ａ（或 Ｓ）型和 Ｂ（或 Ｌ）型。 Ｓｕｂｂｏｔｉｎ ｅｔ ａｌ． （２０１１）
在此基础上将不同寄主上的马铃薯腐烂茎线虫群体
分为 ７ 个单元型，除没有发现 Ｇ型外，其它 ６ 个单元
型在中国均有分布。 国外 ２ 个马铃薯上线虫群体主
要为 Ｅ型和 Ｇ型，少数为 Ｃ型。 刘先宝等（２００８）发
现我国河北的 １ 个马铃薯腐烂茎线虫群体为 Ｂ 型，
郭全新和简恒（２０１０）从河北省察北区马铃薯上分
离到的线虫群体也属于 Ｂ 型。 本研究中 ｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ
序列分析结果显示，来自甘肃省定西市马铃薯的
３ 个线虫群体属于 Ｂ 型，１ 个线虫群体为 Ｃ 型。 这
意味着马铃薯腐烂茎线虫甘薯群体和马铃薯群体的
类型可能不同，或者优势类型可能不同。 国内外研
究还发现，马铃薯腐烂茎线虫种群分化现象明显，来
自不同寄主的植物线虫群体致病力存在差异，但目
前还不能划分出生理小种（ｄｅ Ｗａｅｌｅ ｅｔ ａｌ． ，１９８９），
而且不同地理种群马铃薯腐烂茎线虫的抗药性和乙
酰胆碱酯酶对抑制剂的敏感性存在差异（丁中等，
２００７ａ，ｂ）。 关于国内马铃薯腐烂茎线虫马铃薯群
体是否还存在其它单元型，不同单元型在寄主范围、
致病力、抗药性、生物学和其它序列等方面有何差异
有待进一步研究。
参 考 文 献 （Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）
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（责任编辑：李美娟）
７８５４ 期 李惠霞等： 甘肃定西地区马铃薯线虫病病原的分离鉴定