全 文 ：园 艺 学 报 2012，39（5）：949–956 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–02–27；修回日期：2012–05–02
基金项目：国家葡萄产业技术体系建设项目（CARS-30-bc-3）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：yfdong@163.com）
葡萄 4种病毒多重 RT-PCR检测体系的建立
范旭东，董雅凤*，张尊平，任 芳，李亚惠
（中国农业科学院果树研究所国家落叶果树脱毒中心，辽宁兴城 125100）
摘 要：以复合感染 4 种病毒的‘红地球’（Red Globe）葡萄样品为试材，对影响多重 PCR 的 dNTPS
浓度、Taq 酶浓度、引物浓度、退火温度及模板量进行了调整和优化，建立了能同时检测葡萄卷叶伴随病
毒 3（Grapevine leafroll-associated virus-3，GLRaV-3）、沙地葡萄茎痘相关病毒（Grapevine rupestris stem
pitting associated virus，GRSPaV）、葡萄病毒 B（Grapevine virus B，GVB）和葡萄病毒 A（Grapevine virus
A，GVA）的多重 RT-PCR 方法。灵敏度测验结果显示，多重 RT-PCR 与单一 RT-PCR 检测灵敏度基本一
致。多重 RT-PCR 获得的特异性片段大小分别为 905、546、460 和 196 bp，经过克隆、测序及序列比对，
表明其序列与已报道的病毒序列具有较高的同源性。对 7 个已知带病毒的葡萄样品进行检测验证的结果
表明，所建立的多重 RT-PCR 技术可用于大量田间样品中这些病毒的检测。
关键词：多重 RT-PCR；检测；葡萄卷叶伴随病毒 3；沙地葡萄茎痘病毒；葡萄病毒 B；葡萄病毒 A
中图分类号：S 663.1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2012）05-0949-08

Multiplex RT-PCR for Simultaneous Detection of Four Grapevine Viruses
FAN Xu-dong，DONG Ya-feng*，ZHANG Zun-ping，REN Fang，and LI Ya-hui
（National Center for Eliminating Viruses from Deciduous Fruit Tree，Research Institute of Pomology，Chinese Academy of
Agriculture Sciences，Xingcheng，Liaoning 125100，China）
Abstract：Using the‘Red Globe’infected by four grapevine viruses as a sample，the concentrations
of dNTPs，Taq DNA polymerase，the primers，annealing temperature and template quantity were optimized
for the simultaneous detection of four viruses Grapevine leafroll-associated virus-3（GLRaV-3），
Grapevine rupestris stem pitting associated virus（GRSPaV），Grapevine virus B（GVB），Grapevine virus
A（GVA） by multiplex RT-PCR. Comparison of the sensitivity of both multiplex-and single RT-PCR for
the detection of those viruses showed no significant differences. The target fragments with expected sizes
of 905 bp（GRSPaV），546 bp（GLRaV-3），460 bp（GVB）and 196 bp（GVA）were amplified from the
sample. The multiplex RT-PCR products of those viruses were cloned and sequenced. Result showed that
the obtained sequences had high similarities to reported corresponding sequences of those viruses. The
viral detection results of seven grapevine samples in field suggested that the multiplex RT-PCR could be
used for the simultaneous detection of those four viruses.
Key words：multiplex RT-PCR；detection；Grapevine leafroll-associated virus-3；Grapevine rupestris
stem pitting associated virus；Grapevine virus B；Grapevine virus A

950 园 艺 学 报 39 卷
葡萄卷叶病和皱木复合病均是全世界普通发生、危害严重的葡萄病毒病之一。引起葡萄卷叶病
的病原为葡萄卷叶伴随病毒（Grapevine leafroll-associated virus，GLRaV），共 11 种，包括
GLRaV-1 ~ 9、GLRaV-Pr 和 GLRaV-De（Maliogka et al.，2008a, 2008b）；皱木复合病在指示植物沙
地葡萄上表现为茎痘病或栓皮症状，而在‘Kober’和‘LN33’则引起茎沟症状，病原病毒主要有
沙地葡萄茎痘相关病毒（Grapevine rupestris stem pitting associated virus，GRSPaV）、葡萄病毒 A
（Grapevine virus A，GVA）、葡萄病毒 B（Grapevine virus B，GVB）等（Martelli & Boudon-Podieu，
2006）。中国目前已报道了 6 种卷叶伴随病毒（GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3、GLRaV-4、GLRaV-5、
GLRaV-7），3 种皱木复合相关病毒（GRSPaV、GVA、GVB），1 种线虫传多面体病毒，即葡萄扇叶
病毒（Grapevine fanleaf virus，GFLV），和葡萄斑点病毒（Grapevine fleck virus，GFkV）（何水涛 等，
2001；刘永清，2003；牛建新 等，2003；董雅凤 等，2007；杨发恒，2007；王建辉 等，2008；裴
光前 等，2010；Pei et al.，2010；杨相昆 等，2010）。由于长期不规范的苗木生产、引进及田间操
作，导致这些病毒广泛传播和流行，对葡萄产业造成严重的危害。多重 RT-PCR 检测技术具有简便、
快速、经济的特点，非常适合于大量脱毒样品的检测。近年来，国内外研究者逐步将多重 RT-PCR
技术运用到多种植物病毒检测（Roy et al.，2005；王继华 等，2005；丁芳 等，2006；Gambino &
Gnbaudo，2006；Periasamy et al.，2006；张志宏 等，2006；徐榕雪 等，2007；Wei et al.，2008；
赵丽 等，2008；范旭东 等，2009；裴光前 等，2010），但能够检测包含 GLRaV-3、GRSPaV、GVB
和 GVA 的多重 RT-PCR 反应体系尚未见报道。本试验中在前人的研究基础上，探索建立能同时检测
GLRaV-3、GRSPaV、GVB 和 GVA 的多重 RT-PCR 检测体系，以期为葡萄上多种病毒的田间调查以
及病毒的脱除提供简便、快速、高效的检测方法。
1 材料与方法
1.1 材料及试剂
2010 年 11 月从辽宁省兴城市中国农业科学院果树研究所国家落叶果树脱毒中心毒源保存圃采
集葡萄 1 年生休眠枝条，置于 4 ℃冰箱保存备用。以同时带有 GRSPaV、GLRaV-3、GVB 和 GVA
的‘红地球’葡萄样品用作为建立多重 RT-PCR 检测体系的试材。挑选经过单一 RT-PCR 法检测过
的其他田间带毒葡萄样品，编号为 1 ~ 7，其中 1 号是 GLRaV-3 和 GVA 复合侵染的样品；2 号为
GRSPaV、GLRaV-3 和 GVB 复合侵染的样品；3、4 和 5 号是 GRSPaV、GLRaV-3、GVB 和 GVA 复
合侵染的样品；6 号为 GLRaV-3 和 GRSPaV 复合侵染的样品；7 号为 GLRaV-3、GVB 和 GVA 复合
侵染的样品，这些样品用来验证多重 RT-PCR 检测的准确性。
PCR Fragment Recovery Kit、pMD18-T Vector 和感受态细胞 DH5α 购自大连宝生物公司
（TaKaRa），M-MLV 逆转录酶购自普洛麦格（Promega）公司。10 × PCR Buffer（含 20 mmol · L-1 Mg+）
Taq 酶，dNTPs 购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。DNA Mark-D 购自上海生工生物工程技术服
务公司。引物序列及 PCR 产物大小见表 1。所有引物均由上海生工生物工程技术服务公司合成。
1.2 总 RNA提取及反转录
取葡萄休眠枝条韧皮部 100 mg，采用二氧化硅吸附法（Foissac et al.，2000）进行总 RNA 提取。
然后进行反转录：在 1.5 mL 灭菌离心管中，依次加入纯水 9.0 L，随机引物 6（上海生工生物工程
有限公司合成）1.0 L 和总 RNA 5.0 L，离心混匀，95 ℃水浴 5 min ，冰上放置 2 min。加入以下
混合液：5  M-MLV buffer 5.0 L，10 mmol · L-1 dNTPs 1.5 L，200 U · L-1 M-MLV 逆转录酶 0.8 L，
5 期 范旭东等：葡萄 4 种病毒多重 RT-PCR 检测体系的建立 951

灭菌纯水 2.7 L。37 ℃ 水浴 10 min，然后转入 42 ℃ 水浴 50 min，最后 70 ℃水浴 5 min，立即进
行 PCR 扩增或–20 ℃保存备用。
表 1 多重和单一 RT-PCR引物
Table 1 Primers used in multiplex RT-PCR and single RT-PCR
病毒
Virus
引物序列（5′–3′）
Sequence of primer
扩增产物/bp
Amplicon
参考文献
Reference
5′-CGCTAGGGCTGTGGAAGTATT-3′ GLRaV-3
5′-GTTGTCCCGGGTACCAGATAT-3′
546 Oman & Rwhani，2006
5′-TGAAGGCTTTAGGGGTTAG-3′ GRSPaV
5′-CTTAACCCAGCCTTGAAAT-3′
905 Nolasco et al.，2000
5′-ATCAGCAAACACGCTTGAACCG-3′ GVB
5′-GTGCTAAGAACGTCTTCACAGC-3′
460 Minafra et al.，1994
5′-CCAGAGGAGTTTGAGACAATA-3′ GVA
5′-GTCCCGACCAAGGCGATGTACCC-3′
196 de Meyer et al.，2000
1.3 单一 RT-PCR
PCR 反应体系为 25 L，含 10 × Taq 酶 buffer 2.5 L，10 mol · L-1 dNTPs 0.5 L，10 mol · L-1
上、下游引物（表 1）各 0.5 L，5 U · L-1 Taq 酶 0.5 L，模板 cDNA 2.5 L，最后加灭菌纯水补
足 25 L。PCR 反应程序为：94 5 min℃ ；94 40 s℃ ，56 45 s℃ ，72 1 min℃ ，循环 35 次；72 ℃ 7
min；4 ℃终止反应。
1.4 多重 RT-PCR
对 PCR 反应体系（25 L）中 dNTPs、Taq 酶和模板 cDNA 的最终用量进行优化，设定 7 种用
量组合（表 2），通过 PCR 产物电泳确定最佳组合。设置梯度 PCR 仪（Biometra Tgradient）中的梯
度温差为 10 ℃，设定了 12 个退火温度（T1 ~ 12）：51.0、51.2、51.9、53.0、54.2、55.4、56.6、57.8、
58.9、60.0、60.7 和 61 ℃，通过 PCR 产物电泳确定适宜的退火温度。设定 4 种不同引物终浓度，分
别为 0.08、0.16、0.24、0.32 mol · L-1，通过电泳观察 PCR 产物条带清晰度，确定适宜引物浓度。
表 2 多重 PCR 体系中 dNTPs、Taq酶和模板 cDNA的用量组合
Table 2 Different combination of dNTPs，Taq enzyme，and template cDNA
组合
Composition
dNTPs 浓度/（mmol · L -1）
The concentration of dNTPs
Taq 酶量/U
Taq enzyme volume
模板 cDNA 量/L
Template cDNA volume
1 0.2 0.75 3.0
2 0.2 1.00 3.0
3 0.4 1.00 3.0
4 0.4 1.00 5.0
5 0.4 2.00 5.0
6 0.4 3.00 7.0
7 0.6 3.00 7.0
1.5 单一和多重 PCR检测灵敏度比较
将从‘红地球’葡萄样品中提取的病毒 RNA 依次稀释至 10-1 ~ 10-7 倍，分别采用单一 RT-PCR
和多重 PCR 技术进行检测，比较其灵敏度。
1.6 RT-PCR产物克隆、测序
PCR 扩增获得的目的 DNA 片段经 PCR Fragment RecoveryKit 回收纯化，取 5 L 与 pMD18-T
Vector 试剂盒中 Solution 4 Ⅰ L 及 pMD18-T 1 L 混匀后，16 ℃连接 16 h，转化大肠感菌 DH5α 受
态细胞。挑取白色菌落进行菌液培养，PCR 鉴定获得重组质粒, 提交北京诺赛基因组研究中心进行
测序。采用 DNA Star 分析软件中的 MegAlign 程序将 4 种病毒扩增片段测序结果与 GenBank 数据库
中已登录的一些分离物的核苷酸序列进行同源性分析。
952 园 艺 学 报 39 卷
1.7 田间样品检测
对田间样品进行多重 RT-PCR 检测，将检测结果与这些样品单一 RT-PCR 的结果进行比较，验
证多重 RT-PCR 检测效果。
2 结果与分析
2.1 多重 PCR反应体系建立
在退火温度为 52 ℃，引物终浓度 0.2
mol · L-1 时，比较 7 组具有不同 dNTPs、Taq
酶和模板浓度的多重 RT-PCR 反应（图 1）发
现，适当增加 dNTPs、Taq 酶和模板 cDNA 的
量，有利于此多重 RT-PCR 的建立，最佳组合
为 25 L 体系包含 dNTPs 0.6 mmol · L-1，Taq
酶 3 U，模板 cDNA 量 7.0 L。
采用上述最佳的各组分用量，分析不同引
物终浓度（0.08、0.16、0.24、0.32 mol · L-1）
对多重 PCR 的影响进行分析。琼脂糖电泳显示
随着引物浓度的增加有引物二聚体及抹带的出
现（图 2）。当各引物用量为 0.16 mol · L-1 时，
多重 PCR 有较好的扩增。
梯度 PCR 结果显示 54.2 ~ 56.6 ℃之间多
重 PCR 扩增产物具有较好的结果，初步定为退
火温度为 56 ℃。
根据上述结果，最终将多重 PCR 反应体
系（25 L）定为：10 × Taq 酶 buffer（含 20
mmol · L-1 Mg2+）2.5 L，dNTPs 0.6 mmol · L-1，
GLRaV-3、GRSPaV、GVB 和 GVA 引物为 0.16
mol · L-1，Taq 酶 3 L，模板 7 L，灭菌纯水
补足 25 L。多重 PCR 反应程序：94 5 min℃ ；
94 40 s℃ ，56 45 s℃ ，72 1 min℃ ，循环 35
次；72 7 min℃ ；4 ℃终止反应。
对同一葡萄样品进行多重 RT-PCR 和单一
RT-PCR，扩增结果显示建立的多重反应体系有
较好的扩增（图 3）。
2.2 单一和多重 PCR检测灵敏度比较结果
灵敏度测验结果显示，单一 PCR 对该样品能够检测出 GRSPaV 和 GVB 的 RNA 最大稀释倍数
为 10-2（图 4，A、C），能够检测出 GLRaV-3 的最大稀释倍数为 10-4（图 4，B）、能够检测 GVA 的
RNA 最大稀释倍数分别为 10-3（图 4，D）。多重 PCR 能够检测 GRSPaV 和 GVB 的 RNA 最大稀释
倍数为 10-2，能够检测 GLRaV-3 和 GVA 的 RNA 最大稀释倍数为 10-3，接近单一 PCR 的检测灵敏度。
图 1 不同 dNTPs、Taq酶和模板 cDNA量组合多
重 RT-PCR扩增结果
M：DNA marker；1 ~ 7 见表 1。
Fig. 1 Multiplex RT-PCR amplification with different amount
of dNTPs，Taq enzyme，Template cDNA
M：DNA marker；1–7：Showed in Table 1.
图 2 不同引物用量多重 RT-PCR影响扩增结果
M：DNA marker；1 ~ 4：引物浓度：0.08、
0.16、0.24 和 0.32 mol · L -1。
Fig. 2 Multiplex RT-PCR amplification with different
amount of primer
M：DNA marker；1–4：Primer concentration：0.08，
0.16，0.24 and 0.32 mol · L-1.
5 期 范旭东等：葡萄 4 种病毒多重 RT-PCR 检测体系的建立 953



图 3 4种葡萄病毒的单一 RT-PCR和多重 RT-PCR扩增
M：DNA marker；1：多重 RT-PCR 检测结果；2 ~ 5：分别为 GRSPaV，GLRaV-3，GVB 和 GVA 的单一 RT-PCR 检测结果。
Fig. 3 Detection of RSPaV，GLRaV-3，GVB，GVA by mRT-PCR and sRT-PCR
M：DNA marker；1：Multiplex RT-PCR；2–5：Single RT-PCR for GRSPaV，GLRaV-3，GVB and GVA，respectively.


图 4 单一 RT-PCR（A ~ D）和多重 RT-PCR（E）灵敏度比较
M：DNA marker；N：阴性对照。
Fig. 4 The sensitivity of sRT-PCR（A–D）and mRT-PCR（E）
M：DNA marker；N：Negative control.
2.3 RT-PCR产物测序
对 RT-PCR 特异性目的产物进行回收、克隆和测序，得到与目标片段大小相符的 DNA 序列。
其中，GRSPaV 的外壳蛋白全序列为 905 bp，GLRaV-3 的热激蛋白 HSP70 序列为 546 bp，GVB 的
RNA 结合蛋白序列为 460 bp，GVA 的外壳蛋白序列为 195 bp。GRSPaV、GLRaV-3、GVB 扩增片
段提交至 GenBank，登录号为 JF927939、JF927941 和 JF927940。扩增片段与 GenBank 登录的病毒
序列比对结果显示较高的同源性，其中 GRSPaV 扩增片段（JF927939）与两个日本分离物同源性均
高达 99%，与巴西和美国分离物同源性均达 96%，与意大利分离物同源性为 95%。GLRaV-3 扩增片
段与意大利和美国分离物（GQ344826）同源性为 99%，与其他分离物同源性均在 91%。GVB 扩增
片段与先前提交的中国兴城分离物（GQ478316）同源性为 98%，与其他分离物同源性均 87%以上。
GVA 分离物 GVA-1 与南非分离物（DQ855087）同源性为 95%，与先前提交的中国分离物（FJ445219）
同源性为 90%，与其他分离物同源性均在 90%以上（图 5）。
954 园 艺 学 报 39 卷

图 5 GRSPaV（JF927939）、GLRaV-3（JF927941）、GVB（JF927940）、GVA（GVA-1）与其他分离物核苷酸序列的系统进化树
Fig. 5 Phylogenetic dendrogram of the GRSPaV，GLRaV-3，GVB and GVA nucleotide sequence

2.4 田间葡萄样品中 4种病毒的多重 RT-PCR检测效果
采用优化后的多重 RT-PCR 体系对 7 个已知带毒情况的葡萄样品进行检测，检测结果与样品已
知带毒情况一致（图 6）。


图 6 多重 RT-PCR检测田间样品结果
M：DNA marker；N：健康样品；1：GLRaV-3 和 GVA 侵染的样品；2：GRSPaV、GLRaV-3 和 GVB 复合侵染的样品；
3 ~ 5：GRSPaV、GLRaV-3、GVB 和 GVA 复合侵染的样品；6：GLRaV-3 和 GRSPaV 复合侵染的样品；
7：GLRaV-3、GVB 和 GVA 复合侵染的样品；P：阳性对照。
Fig. 6 The multiplex RT-PCR detection results of four viruses from flied grapevine samples
M：DNA marker；N：Healthy apple sample；1：The sample with GLRaV-3 and GVA；2：The sample with GRPSaV，GLRaV-3 and GVB；
3–5：The sample with GRSPaV，GLRaV-3，GVB and GVA；6：The sample with GLRaV-3 and GRSPaV；
7：The sample with GLRaV-3，GVB and GVA；P：Positive control.
5 期 范旭东等：葡萄 4 种病毒多重 RT-PCR 检测体系的建立 955

3 讨论
全世界已明确分类的葡萄病毒有 58 种（Martelli & Boudon-Padieu，2006），国内已报道了 11 种。
培育葡萄无病毒母本树和苗木，以及开展葡萄病毒种类调查时，均需要对多种病毒进行检测。采用
酶联免疫吸附法检测，需要从国外购买昂贵的试剂盒，而且其灵敏度低于依赖核酸的分子检测技术；
目前常用的单一 RT-PCR 检测方法费时、费工，因此建立简便、快速、高效的检测方法是病毒检测
未来的发展方向。牛建新等（2003）建立了 GLaV-3 和 GFLV 的 RT-PCR 多重检测方法。裴光前等
（2010）建立了 4 种葡萄卷叶病毒的多重 RT-PCR 方法。最近，王建辉等（2011）建立了 GLaV-3
和 GVA 的的多重 PCR 体系。而本研究建立了能同时检测 GLRaV-3、GRSPaV、GVB 和 GVA 的多
重 RT-PCR 反应体系，所获得的特异性片段序列与已报道的序列均具有较高同源性，与单一 RT-PCR
相比，具有简便、快速、灵敏、高效的特点，能够用于大量葡萄样品的检测。
本试验在前人的研究基础上，整体考虑模板 cDNA、dNTPs、Taq 酶的浓度变化对多重 RT-PCR
反应的影响，采用递增反应体系中模板 cDNA、dNTPs、Taq 酶的用量，从而获得较适宜的模板、dNTPs、
Taq 酶的用量组合。研究发现在保证检测灵敏度不降低的同时适当减少引物用量，可以有效减少二
聚体的产生。本试验中 GVA 片段较短且接近二聚体及其弥散物，有时会造成 GVA 产物不易分辨，
因此增加琼脂糖胶浓度及适当延长电泳时间会对 GVA 扩增结果会有明显改善。实际检测工作中，
由于病毒 RNA 浓度、试剂的不同，只需对本体系进行适当调整即可。通过进一步选择较为合适的
葡萄内参基因加入到该多重 RT-PCR 体系中去，更能完善这 4 种葡萄病毒的多重 RT-PCR 检测体系。

References
Dong Ya-feng，Zhang Zun-ping，Liu Feng-zhi，Wang Bao-liang，Zhang Shao-yu. 2007. Detection of Grapevine rupestris stem pitting associated
virus by RT-PCR method. Journal of Fruit Science，24 (5)：705–708. (in Chinese)
董雅凤，张尊平，刘凤之，王宝亮，张少瑜. 2007. 沙地葡萄茎痘相关病毒 RT-PCR 检测. 果树学报，24 (5)：705–708.
Ding Fang，Cao Qing，Wang Guo-ping，Yi Gan-jun，Zhong Yun. 2006. Studies on the simultaneous detection of citrus Huanglongbing Pathogen，
citrus exocortis viroid，Citrus tristeza virus by Multiplex RT-PCR. Acta Horticulturae Sinica，33 (5)：947–952. (in Chinese)
丁 芳，曹 庆，王国平，易干军，钟 云. 2006. 柑橘黄龙病、裂皮病和衰退病病原的多重 RT-PCR 检测. 园艺学报，33 (5)：947–952.
De Meyer J，Gaudin M，Bourquin L，Jakab G，Malnoe P，Gugerli P. 2000. New primers for the molecular identification and detection of grapevine
virus A（GVA）// Symons R H，Scott N S，Rezaian M A，Hamiltom R P，Hayes P F. Extended abstracts 13th meeting ICVG. Adelaide，Australia，
138–40.
Fan Xu-dong，Dong Ya-feng，Zhang Zun-ping，Li Li-li，Pei Guang-qian. 2009，Multiplex RT-PCR assay for simultaneous detection of three latent
apple viruses. Acta Horticulturae Sinica，36 (12)：1821–1826. (in Chinese)
范旭东，董雅凤，张尊平，李丽丽，裴光前. 2009. 3 种苹果潜隐病毒多重 RT-PCR 检测体系的建立. 园艺学报，36 (12)：1821–1826.
Foissac X，Svanella-dumasl，Dulucq M J，Candresse T，Centtt P. 2000. Polyvalent detection of fruit tree tricho，capillo and foveraviruses by nested
RT-PCR using degenerated and inosine containing primers（PDORT-PCR）. Acta Horticulturae，550：37–44.
Gambino G，Gnbaudo I. 2006. Simultaneous detection of nine grapevine viruses by multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction with
coamplification of a plant RNA as internal control. Virology，96 (11)：1223–1229.
He Yong-tao，Zhou Hou-cheng，Zhang Ya-bing，Guo Wei-dong. 2001. Studies on RT-PCR detection technology of Grapevine fan leaf virus. Journal
of Fruit Science.，18 (3)：186–187. (in Chinese)
何水涛，周厚成，张亚冰，郭卫东. 2001. 利用 RT-PCR 检测葡萄扇叶病毒的研究. 果树学报，18 (3)：186–187.
Liu Yong-qing. 2003. Investigation on the kinds of grapevine virus and the detection of grapevine fleck virus[M. D. Dissertation]. Wuhan：Huazhong
Agricultural University. (in Chinese)
刘永清. 2003. 葡萄病毒种类调查及葡萄斑点病毒检测[硕士学位]. 武汉：华中农业大学.
Minafra A，Saldarelli P，Grieco F，Martelli G P. 1994. Nucleotide sequence of the 3-terminal region of the RNA of two filamentous grapevine viruses.
Arch Virol，137，249–261.
Maliogka V I，Dovas C I，Katis N I. 2008a. Evolutionary relationships of virus species belonging to a distinct lineage within the ampelovirus genus.
956 园 艺 学 报 39 卷
Virus Research，135：125–135.
Maliogka V I，Dovas C I，Katis N I. 2008b. Generic and species-specific detection of viruses belonging to an evolutionary distinct lineage within the
Ampelovirus genus. Journal of Virological Methods，154：41–47.
Martelli G P，Boudon-Padieu E. 2006. Directory of infectious diseases of grapevines and viruses and virus-like diseases of the grapevine：
Bibliographic report of 1998–2004 in Options Mediterraneennes. Serie B：N.55，Ciheam，Bari，Italy.
Niu Jian-xin，Lu Xiao-yan，Chen Ping. 2003. Studies on RT-PCR Detection technology of Grapevine fan leaf virus. Acta Agriculturae
Boreali-occidentalis Sinica，12 (3)：81–85. (in Chinese)
牛建新，鲁晓燕，陈 萍. 2003. 葡萄扇叶病毒 RT-PCR 检测技术研究. 西北农业学报，12 (3)：81–85.
Nolasco G，Mansinho A，Teixeira Santos M，Soares C，Sequiera Z，Sequeira C，Correia P K，Sequeira O A. 2000. Large scale evaluation of primers
for diagnosis of Rupestris stems pitting associated virus-1. European Journal of Plant Pathology，106 (4)：311–318
Oman F，Rwhani A.2006. Application of a spotting sample preparation technique for the detection of pathogens in woody plants by RT-PCR and
real-time PCR（TaqMan）. Journal of Virological Methods，133：130–136.
Pei Guang-qian，Dong Ya-feng，Zhang Zun-ping，Fan Xu-dong，Li Li-li. 2010. Detection of 4 Grapevine leafroll-associated viruses by multiplex
RT-PCR . Acta Phytopathologica Sinica，40(1)：21–26. (in Chinese)
裴光前，董雅凤，张尊平，范旭东，李丽丽. 2010. 四种葡萄卷叶病毒多重 RT-PCR 检测. 植物病理学报，40 (1)：21–26.
Pei Guang-qian，Dong Ya-feng，Zhang Zun-ping，Fan Xu-dong. 2010. First Report of Grapevine leafroll-associated virus -4 and -5 in grapevines in
China . Plant Disease，94：130.
Periasamy M，Niazi F R，Malathi V G. 2006. Multiplex RT-PCR，a novel technique for the simultaneous detection of the DNA and RNA viruses
causing rice tungro disease. Journal of Virological Methods，134：230–236.
Roy A，Fayad A，Barthe G，Brlansky R H. 2005. A multiplex polymerase chain reaction method for reliable，sensitive and simultaneous detection
of multiple viruses in citrus trees. Virological Methods，(129)：47–55
Wang Jian-hui，Liu Xiao，Xi De-hui，Yuan Shu，Jiang Yu，Yang Hui，Du Ju-bo，Zhang Zhong-wei，Chen Ke-ling，Lin Hong-hui. 2008. Cloning
and prokaryotic expression of CP gene of Grapevine virus A Sichuan isolate. Acta Horticulturae Sinica，35 (7)：967–972. (in Chinese)
王建辉，刘 晓，席德慧，袁 澍，蒋 彧，杨 辉，杜俊波，张中伟，陈克玲，林宏辉. 2008. 葡萄 A 病毒四川分离物的外壳蛋白基
因克隆与原核表达. 园艺学报，35 (7)：967–972
Wang Jian-hui，Liu Jian-jun，Chen Ke-ling，Li Hong-wen，Xi De-hui，Lin Hong-hui. 2011. Optimizing multiple detection and phylogenetic studies
on Grapevine leafroll associated virus-3 and Grapevine virus A. Acta Horticulturae Sinica，38 (12)：2401–2410. (in Chinese)
王建辉，刘建军，陈克玲，李洪雯，席德慧，林宏辉. 2011. 葡萄卷叶伴随 3 型病毒和葡萄 A 病毒的多重检测及其系统进化分析.园艺
学报，38 (12)：2401–2410.
Wei T，Lu G.J, Clover G. 2008. Novel approaches to mitigate primer interaction and eliminate inhibitors in multiplex PCR，demonstrated using an
assay for detection of three strawberry viruses. Journal of Virological Methods，151：132–139
Wang Ji-hua，Wang Li-hua，Ding Yuan-ming，Qu Su-ping，Xiong Li，Tang Kai-xue. 2005. Detection of Lily symptom less virus and Lily mottle virus
by multiplex RT-PCR. Acta Horticulturae Sinica，32 (2)：284–287. (in Chinese)
王继华，王丽花，丁元明，瞿素萍，熊 丽，唐开学. 2005. 应用多重 RT-PCR 检测百合无症病毒和百合斑驳病毒. 园艺学报，32 (2)：284–287.
Xu Rong-xue，Ming Jun，Mu Ding，Liu Chun，Tang Geng-guo，Wang Xiao-wu. 2007. Detection of three Lily viruses by multiplex RT-PCR. Acta
Horticulturae Sinica，34 (2)：443–448. (in Chinese)
徐榕雪，明 军，穆 鼎，刘 春，汤庚国，王晓武. 2007. 百合三种病毒的多重 RT-PCR 检测. 园艺学报，34 (2)：443–448.
Yang Fa-heng. 2007. Identification of four etiological virus causing grapevine leafroll by RT-PCR in China[M. D. Dissertation].Wuhan：Huazhong
Agricultural University. (in Chinese)
杨发恒. 2007. 引起我国葡萄卷叶病的四种病原病毒的 RT-PCR 鉴定[硕士论文].武汉：华中农业大学.
Yang Xiang-kun，Tian Hai-yan，Niu Jian-xin，Wang lin，Dai Yong-xin. 2010. Study on the detection of grapevine virus B by RT-PCR. Biotechnology
Bulletin，(5)：97–106. (in Chinese)
杨相昆，田海燕，牛建新，王 林，代永欣. 2010. 葡萄病毒 B 的 RT-PCR 检测技术研究. 生物技术通讯，(5)：97–106.
Zhang Zhi-hong，Yang Hong-yi，Dai Hong-yan，Li He，Xiao Min. 2006. Detection of Strawberry mottle virus and Strawberry mild yellow edge virus
by multiplex RT-PCR. Acta Horticulturae Sinica，33 (3)：507–510. (in Chinese)
张志宏，杨洪一，代红艳，李 贺，肖 敏. 2006. 应用多重 RT-PCR 检测草莓斑驳病毒和草莓轻型黄边病毒. 园艺学报，33 (3)：507–510.
Zhao Li，Gu Qin-sheng，Chen Hong-yun，Shi Tuan-sheng，Tian Yan-ping，Hu Jin-ang. 2008. Multiplex RT-PCR assay for simultaneous detection
of three viruses of zucchini. Journal of Fruit Science，25 (5)：703–707. (in Chinese)
赵 丽，古勤生，陈红运，史团省，田延平，胡京昂. 2008. 葫芦科作物 3 种主要病毒的多重RT-PCR 方法的建立. 果树学报，25 (5)：703–707.