全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４４(５): ４５５￣４６０(２０１４)
收稿日期: ２０１３￣１０￣０９ꎻ 修回日期: ２０１３￣０５￣１５
基金项目: 国家葡萄产业技术体系建设项目(编号:ＣＡＲＳ￣３０￣ｂｃ￣３)ꎮ
通讯作者: 董雅凤ꎬ研究员ꎬ主要从事落叶果树病毒研究ꎮ Ｔｅｌ:０４２９￣３５９８２７８ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｙｆｄｏｎｇ＠１６３.ｃｏｍ
第一作者: 范旭东ꎬ助理研究员ꎬ主要从事落叶果树病毒研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｆｘｄ８２＠ｓｉｎａ.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１４.０５.００２
葡萄病毒 Ｅ分子检测及基因序列分析
范旭东ꎬ 董雅凤∗ꎬ 张尊平ꎬ 任 芳ꎬ 胡国君ꎬ 朱红娟
(中国农业科学院果树研究所国家落叶果树脱毒中心ꎬ兴城 １２５１００)
摘要:皱木复合病( ｒｕｇｏｓｅ ｗｏｏｄ ｃｏｍｐｌｅｘ ｄｉｓｅａｓｅ)是一种发生普遍、危害严重的葡萄病毒病ꎬ该病与葡萄病毒属(Ｖｉｔｉｖｉｒｕｓ)病
毒的侵染密切相关ꎬ葡萄病毒 Ｅ(Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｖｉｒｕｓ ＥꎬＧＶＥ)是葡萄病毒属的新成员ꎮ 为明确我国 ＧＶＥ侵染状况以及不同分
离物的基因变异情况ꎬ本研究针对 ＧＶＥ的ＭＰ和 ＣＰ基因设计了两对引物ꎬＲＴ￣ＰＣＲ结果表明ꎬ两对引物均能从带毒样品中
扩增到目的基因片段ꎮ 采用上述引物检测了 ２１１株葡萄样品ꎬＧＶＥ 检出率为 ５.７％ꎮ 对 ７ 个 ＧＶＥ 分离物的外壳蛋白基因
进行测序和系统进化树分析ꎬ结果显示ꎬ上述分离物克隆分别处于 ２个明显分化的组群(Ｇｒｏｕｐ Ｉ 和 Ｇｒｏｕｐ ＩＩ)ꎮ 研究测定了
ＧＶＥ中国分离物 ＧＦＭＧ￣１的全基因组序列ꎬ该分离物与日本分离物 ＴｖＡＱ７核苷酸序列相似度高达 ９８％ꎬ但与日本分离物
ＴｖＰ１５、南非分离物 ＳＡ９４、美国分离物ＷＡＨＨ２及波兰分离物 ５９ＰＥ核苷酸序列相似性仅为 ７０％~７５％ꎮ 本研究为进一步明
确我国 ＧＶＥ发生、分布及分子检测提供了依据ꎮ
关键词:葡萄病毒 Ｅꎻ 分子检测ꎻ 序列分析
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｖｉｒｕｓ Ｅ　 ＦＡＮ Ｘｕ￣
ｄｏｎｇꎬ ＤＯＮＧ Ｙａ￣ｆｅｎｇꎬ ＺＨＡＮＧ Ｚｕｎ￣ｐｉｎｇꎬ ＲＥＮ Ｆａｎｇꎬ ＨＵ Ｇｕｏ￣ｊｕｎꎬ ＺＨＵ Ｈｏｎｇ￣ｊｕａｎ　 (Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ
Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ Ｖｉｒｕｓｅｓ ｆｒｏｍ Ｄｅｃｉｄｕｏｕｓ Ｆｒｕｉｔ Ｔｒｅｅꎬ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｏｍｏｌｏｇｙꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ
Ｘｉｎｇｃｈｅｎｇ １２５１００ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｒｕｇｏｓｅ ｗｏｏｄ ｃｏｍｐｌｅｘ ｄｉｓｅａｓｅ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｖｉｔｉｖｉｒｕｓ ｈａｓ ｏｃｃｕｒｒｅｄ ｗｏｒｌｄｗｉｄｅꎬａｎｄ
ａｆｆｅｃｔｅｄ ｖｉｔｉｃｕｌｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｈｅａｖｉｌｙ. Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｖｉｒｕｓ Ｅ ｗａｓ ｆｉｒｓｔ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｉｎ ２００８ ａｓ ｏｎｅ ｎｅｗ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ
ｇｅｎｕｓ Ｖｉｔｉｖｉｒｕｓ. Ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒꎬ ｔｗｏ ｓｅｔｓ ｏｆ ＧＶＥ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＣＰ ａｎｄ ＭＰ ｇｅｎｅ ｆｏｒ
ＲＴ－ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＧＶＥ. Ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ １２ ｏｕｔ ｏｆ ２１１ ｔｅｓｔｅｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ｓｈｏｗｅｄ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ
ａｂｏｖｅ ｐｒｉｍｅｒｓꎬ ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ５.７％ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ｏｆ ＧＶＥ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ. Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ａｌｌ ｃｌｏｎｅｓ ｏｆ
ＧＶＥ ＣＰ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ７ ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔｌｙ ｄｉｖｉｄｅｄ ｉｎｔｏ ｔｗｏ ｇｒｏｕｐｓ ｎａｍｅｄ ｂｙ ｇｒｏｕｐ Ｉ ａｎｄ ｇｒｏｕｐ
ＩＩ. Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅꎬ ｉｔ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｏｎｅ Ｃｈｉｎｅｓｅ ＧＶＥ ｉｓｏｌａｔｅ ＧＦＭＧ￣１ ｈａｓ ９８％
ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅ ＴｖＡＱ７( Ｊａｐａｎ)ꎬ ａｎｄ ７０％ ~ ７５％ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｗｉｔｈ ｉｓｏｌａｔｅ ＴｖＰ１５( Ｊａｐａｎ) ꎬ
ＳＡ９４(Ｓｏｕｔｈ Ａｆｒｉｃａｎ)ꎬ ＷＡＨＨ２(Ａｍｅｒｉｃａｎ) ａｎｄ ５９ＰＥ(Ｐｏｌａｎｄ) . Ａｌｌ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｌａｙ ｔｈｅ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｕｔｕｒｅ
ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ、ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＧＶＥ ｉｎ Ｃｈｉｎａ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｖｉｒｕｓ Ｅꎻ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎꎻ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ
中图分类号: Ｓ４３２.４４　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０５￣０４５５￣０６
　 　 葡萄皱木复合病 ( ｒｕｇｏｓｅ ｗｏｏｄ ｃｏｍｐｌｅｘ ｄｉ￣
ｓｅａｓｅ)是一种发生普遍、危害严重的葡萄病毒病ꎮ
该病导致葡萄嫁接不亲和ꎬ开花延迟ꎬ生长衰退ꎬ甚
至死亡[１]ꎮ 迄今为止ꎬ已报道了 ５种与皱木复合病
相关的葡萄病毒属(Ｖｉｔｉｖｉｒｕｓ)病毒[２]ꎮ 其中ꎬ葡萄
病毒 Ａ(Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｖｉｒｕｓ Ａꎬ ＧＶＡ)和葡萄病毒 Ｂ
　
植物病理学报 ４４卷
(Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｖｉｒｕｓ Ｂꎬ ＧＶＢ)的分布及其分子特性在
世界许多葡萄种植地区均有报道ꎬ而葡萄病毒 Ｄ
(Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｖｉｒｕｓ Ｄꎬ ＧＶＤ)ꎬ葡萄病毒 Ｅ (Ｇｒａｐｅ￣
ｖｉｎｅ ｖｉｒｕｓ Ｅꎬ ＧＶＥ)和葡萄病毒 Ｆ(Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｖｉｒｕｓ
Ｆꎬ ＧＶＦ)报道很少[３]ꎮ 目前我国仅报道了葡萄病
毒 Ａ和 Ｂ的分子检测技术及基因变异情况[４ꎬ５]ꎮ
　 　 ２００８年日本首次报道了侵染葡萄的两个 ＧＶＥ
分离物ꎬ即 ＴｖＡＱ７和 ＴｖＰ１５ꎬ并测定了其基因组大
部分序列ꎬ同时证明了它们均可通过粉蚧进行传
播[６]ꎮ 之后ꎬ采用高通量测序技术在南非发现了
ＧＶＥꎬ并通过 ＲＴ￣ＰＣＲ 进行了证实[７]ꎮ 目前已报
道了 ＧＶＥ两个分离物的全长基因序列ꎬ分别为南
非分离物 ＳＡ９４ 和美国分离物 ＷＡＨＨ２(ＧｅｎＢａｎｋ
登录号分别为 ＧＵ９０３０１２ 和 ＪＸ４０２７５９ )ꎬ均与
ＴｖＰ１５分离物均具有较高的相似性ꎮ 与其他葡萄
病毒属成员相同ꎬＧＶＥ 基因组共编码 ５ 个开放阅
读框(ＯＲＦ１ ~ ５)ꎬ并具有 ５’帽子结构和 ３’ ｐｌｏｙＡ
尾序ꎮ 其中ꎬＯＲＦ１ 编码的蛋白与病毒复制相关ꎬ
包括甲基转移酶(ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅꎬＭｔ)ꎬ两个解旋
酶( ｈｅｌｉｃａｓｅꎬＨｅｌ)和依赖于 ＲＮＡ 的 ＲＮＡ 聚合酶
(ＲＮＡ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅꎬＲｄＲｐ)ꎮ 已报
道的 ＧＶＥ基因组序列中ꎬ解旋酶区域都包含一个
ＡｌＫＢ 结构域ꎬ以往的研究表明 ＡＩＫＢ 参与甲基化
修复ꎬ对抗寄主的防御机制ꎮ 目前ꎬＧＶＥ 是唯一被
发现 ＡＩＫＢ 位于解旋酶区域内部的植物病毒[７]ꎮ
ＧＶＥ具备葡萄病毒属的基本基因组结构ꎬ也具有
自身独特的分子特点ꎬ进一步研究其分布状况及分
子特性ꎬ对全面认识葡萄皱木复合病病原有重要的
意义ꎮ 本文建立了 ＧＶＥ 的 ＲＴ￣ＰＣＲ 检测方法ꎬ对
２１１株葡萄样品进行了 ＧＶＥ 的检测ꎬ获得了 ７ 个
中国分离物的 ＣＰ 基因及 １ 个中国分离物全长序
列ꎬ并对序列的变异情况进行了分析ꎬ为进一步明
确我国 ＧＶＥ的发生、分布及其分子检测提供了理
论依据ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 材料
　 　 ２０１１年 １１月在中国农科院果树研究所国家
落叶果树中心试材保存圃(辽宁兴城)采集 ２１１ 株
葡萄样品的休眠枝条ꎬ保湿存放于 ４℃冰箱中ꎮ 除
部分样品秋季表现明显的卷叶病症状外ꎬ未发现其
他病毒病症状ꎮ
１.２　 引物
　 　 根据 ＧｅｎＢａｎｋ 登录的 ＧＶＥ 分离物 ＣＰ 和 ＭＰ
基因序列保守区域设计了 ２ 对用于 ＲＴ￣ＰＣＲ 检测
的特异性引物 (ＧＶＥＣＰ１ / ＧＶＥＣＰ２ 和 ＧＶＥＭＰ１ /
ＧＶＥＭＰ３)和 １ 对扩增 ＧＶＥ 外壳蛋白基因全序列
的引物(ＧＶＥＣＰ１Ａ / ＧＶＥＣＰ１Ｂ)ꎬ引物序列见表 １ꎮ
另外ꎬ根据 ＧＶＥ 分离物 ＴｖＡＱ７(ＧｅｎＢａｎｋ 登录号:
ＡＢ４３２９１０)设计了用于扩增 ＧＶＥ基因组全长的引
物和用于扩增 ５′和 ３′非编码区的巢式 ＰＣＲ 引物ꎬ
引物序列信息见表 ２ꎮ
１.３　 ＲＮＡ提取方法
　 　 本研究采用了两种方法从葡萄休眠枝条中提
取 ＲＮＡꎮ 第一种方法是二氧化硅法ꎬ具体步骤见
参考文献[８]ꎮ 第二种方法为 ＲＮＡ 柱式提取方
法ꎬ具体步骤如下:刮取 ５０ ｍｇ 葡萄休眠枝条韧皮
部放入塑料袋中ꎬ加入 １ ｍＬ裂解液(４.０ Ｍ 硫氰酸
胍ꎬ０.２ Ｍ 醋酸钠ꎬ２５ ｍＭ ＥＤＴＡꎬ１. ０Ｍ 醋酸钾ꎬ
２.５％ ＰＶＰ￣４０)研磨ꎻ将匀浆转入事先加入 １５０ μＬ
１０％ Ｎ￣ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ(Ｓｉｇｍａ)的 １.５ ｍＬ 离心管
中ꎬ７０℃保温 １０ ｍｉｎꎬ期间混匀几次ꎬ冰中放置 ５ ｍｉｎ
Ｔａｂｌｅ １　 Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ＲＴ￣ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＧＶＥ ＣＰ ｇｅｎｅ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ / ５′￣３′ Ｇｅｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｔ ｓｉｚｅ / ｂｐ
ＧＶＥＣＰ１ ＧＴＧＧＧＴＧＡＡＣＣＡＣＴＣＡＡＧＧＴ
ＧＶＥＣＰ２ ＡＧＡＣＣＡＣＴＴＧＣＧＧＣＴＣＴＴＴＡ
ＣＰ ｇｅｎｅꎬ ｐａｒｔｉａｌ ２２０
ＧＶＥＭＰ１ ＴＧＴＧＧＧＧＴＧＣＡＴＡＧＴＣＡＴＡＧＧ
ＧＶＥＭＰ３ ＡＧＴＧＣＧＧＴＴＧＧＡＴＴＣＴＣＴＴＧ
ＭＰ ｇｅｎｅꎬ ｐａｒｔｉａｌ ４１４
ＧＶＥＣＰ１Ａ ＡＡＴＧＧＡＧＴＣＡＡＡＡＧＣＧＡＴＣＣ
ＧＶＥＣＰ１Ｂ ＣＴＡＧＡＣＴＴＣＣＡＣＣＧＡＧＣＴＴＴＣ
ＣＰ ｇｅｎｅꎬ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ６００
６５４
　
　 ５期 范旭东ꎬ等:葡萄病毒 Ｅ分子检测及基因序列分析
　 Ｔａｂｌｅ ２　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｆｏｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆ ＧＶＥ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ / ５′－３′ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ
ＧＶＥ５’ ＩＮ ＴＴＧＡＡＧＣＴＡＡＡＡＡＧＴＣＧＴＡＴ ２４６－２２６
ＧＶＥ５’ＯＵＴ ＧＣＡＡＴＴＧＡＴＡＧＡＴＡＡＧＧＧＴＡＡＡＣ ２７２－２４９
ＧＶＥＦ１ ＴＡＣＧＣＡＡＡＴＡＴＡＧＧＡＴＣＡＧＡＣＡＡＧ １１０－１３４
ＧＶＥＲ３ ＧＡＣＣＣＣＧＣＡＡＡＴＣＣＴＡＡＡＣＡＣＡＴ ２３２９－２３０６
ＧＶＥＦ４ ＴＣＣＧＧＧＡＧＴＧＧＧＧＣＡＧＡＴ ２１４６－２１６４
ＧＶＥＲ５ ＡＡＡＧＴＣＣＧＣＡＡＡＡＣＧＣＡＡＴＣＴＣ ４０３７－４０１５
ＧＶＥＦ６ ＣＣＣＧＧＡＧＡＣＴＡＴＡＡＧＧＡＣＡＣ ３７８４－３８０４
ＧＶＥＲ７ ＣＴＴＣＣＡＣＴＧＣＣＣＧＣＴＴＣＴＡＴＧ ５５３１－５５１０
ＧＶＥＦ８ ＴＴＧＴＧＴＴＧＣＣＴＡＧＣＧＡＧＴＴＧＴＴＴＡ ５２３９－５２６３
ＧＶＥＲ９ ＡＡＴＣＧＣＣＧＧＧＧＴＴＣＴＴＡＴＧ ７２７０－７２５１
ＧＶＥ３’ ＩＮ ＴＡＡＧＣＧＧＴＡＴＧＧＴＡＧＧＴＧＴＴ ７１６１－７１８１
ＧＶＥ３’ＯＵＴ ＧＴＣＡＣＡＧＧＴＧＧＧＣＧＡＡＡＡＣＴＣ ７０６０－７０８１
　
后ꎬ１３ ０００ ｒｐｍ离心 １０~１５ ｍｉｎꎻ取上清 ６００ μＬꎬ加
入 ３００ μＬ 的无水乙醇ꎬ来回颠倒 ４５ ｓ 混匀ꎻ将混
合物加入吸附柱中(购自北京艾德莱生物科技有限
公司)１２ ０００ ｒｐｍ 离心 １ ｍｉｎꎬ弃掉废液ꎻ加 ７００ μＬ
去蛋白液 (含 ３ Ｍ 硫氰酸胍ꎬ０.０２１ ７ Ｍ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌꎬ
５０％乙醇)ꎬ室温放置 ２ ｍｉｎꎬ１２ ０００ ｒｐｍ 离心 １ ｍｉｎꎬ
弃掉废液ꎻ加入 ７００ μＬ 漂洗液(ＮａＣｌ ０.０５ ｇꎬＴｒｉｓ￣
ＨＣｌ ０.０１２ ５ ｇꎬ溶于 １０ ｍＬ ＤＥＰＣ水ꎬ加 ４０ ｍＬ无水
乙醇)ꎬ１２ ０００ ｒｐｍ离心 １ ｍｉｎꎬ弃掉废液ꎻ再加入 ５００
μＬ漂洗液ꎬ重复洗涤一遍ꎻ将吸附柱放至空收集管
中ꎬ１２ ０００ ｒｐｍ 离心 ２ ｍｉｎꎬ除去漂洗液ꎻ取出吸附
柱ꎬ放入无 ＲＮＡ酶污染的离心管中ꎬ根据预期 ＲＮＡ
产量在吸附膜的中间部位加 ３０~５０ μＬ ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ
ｗａｔｅｒꎬ室温放置 １ ｍｉｎꎬ１２ ０００ｒｐｍ 离心 １ ｍｉｎꎻ将离
心得到的 ＲＮＡ 溶液立即用于反转录或者保存于
－７０℃超低温冰箱中备用ꎮ
　 　 本研究中ꎬ用于 ＧＶＥ 检测的 ＲＮＡ 采用了二
氧化硅提取法ꎬ用于 ＧＶＥ 外壳蛋白基因和全长基
因组分段扩增的 ＲＮＡ采用了柱式提取法ꎮ
１.４　 ＲＴ￣ＰＣＲ及其产物的克隆、测序
　 　 逆转录在 １.５ ｍＬ 灭菌离心管中进行ꎬ依次加
入灭菌纯水 ７.０ μＬ、６ ｂｐ随机引物(上海生工生物
工程技术服务公司合成)１.０ μＬ、总 ＲＮＡ ２.０ μＬꎬ
离心混匀ꎬ９５℃水浴 ５ ｍｉｎꎬ冰上放置 ２ ｍｉｎꎻ加入
５×Ｍ￣ＭＬＶ ｂｕｆｆｅｒ ５.０ μＬ、１０ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ｄＮＴＰｓ １.５
μＬ、２００ Ｕ􀅰ｍＬ－１ Ｍ￣ＭＬＶ 逆转录酶 ０.８ μＬ、灭菌
纯水 ２.７ μＬꎬ３７℃水浴 １０ ｍｉｎꎬ４２℃水浴 ５０ ｍｉｎꎬ
７０℃水浴 ５ ｍｉｎꎮ 合成的 ｃＤＮＡ 立即进行 ＰＣＲ 扩
增或－２０℃保存备用ꎮ
　 　 ＰＣＲ反应体系为 ２５ μＬꎬ含 １０×Ｔａｑ ＤＮＡ聚合
酶缓冲液 ２.５ μＬ、１０ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ｄＮＴＰｓ ０.５ μＬ、１０
ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１引物各 ０.５ μＬ(引物见表 １)、５ Ｕ􀅰ｍＬ－１
Ｔａｑ酶 ０.５ μＬ、模板 ｃＤＮＡ ２.５ μＬ、灭菌纯水 １８ μＬꎮ
ＰＣＲ反应程序为:９４℃ ５ ｍｉｎꎻ９４℃ ４０ ｓꎬ５６℃ ４５ ｓꎬ
７２℃ １ ｍｉｎꎬ循环 ３５次ꎻ７２℃ ７ ｍｉｎꎻ４℃终止反应ꎮ
　 　 ＰＣＲ扩增获得的目 ＤＮＡ 片段采用北京艾德
莱生物科技有限公司的 ＰＣＲ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ
Ｋｉｔ 回收纯化ꎬ 取 ５ μＬ 纯化 ＤＮＡ 与 ｐＭＤ１８￣Ｔ
Ｖｅｃｔｏｒ 试剂盒中的 ＳｏｌｕｔｉｏｎⅠ４ μＬ 和 ｐＭＤ１８￣Ｔ
１ μＬ混匀后ꎬ１６℃连接 １６ ｈꎬ转化大肠杆菌 ＤＨ５ɑ
感受态细胞ꎬ经蓝白斑筛选ꎬ挑取白色菌落进行菌
液培养ꎬ通过 ＰＣＲ鉴定获得的重组质粒ꎬ由北京诺
赛基因组研究中心进行测序ꎮ
１.５　 ＧＶＥ全长基因组扩增及克隆、测序
　 　 参照日本分离物 ＴｖＡＱ７ 基因组序列(登录
号:ＡＢ４３２９１０)设计引物ꎬ分 ４ 段扩增贵妃玫瑰样
品中的 ＧＶＥ基因组全长序列ꎬ具体操作按照 ＮＥＢ
公司的 Ｐｈｕｓｉｏｎ®超保真 ＰＣＲ 试剂盒(Ｅ０５５３)说明
书进行ꎬ各片段重叠部分长度均大于 １００ ｂｐꎮ ＧＶＥ
的 ３′和 ５′端扩增按照 Ｃｌｏｎｔｅｃｈ 试剂盒的说明进
行ꎮ ＰＣＲ 扩增获得的目的 ＤＮＡ 片段通过 ＰＣＲ
Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔ回收纯化后ꎬ与 ＰＧＥＭ￣Ｔ 载
体(Ｐｒｏｍｅｇａ公司)连接过夜ꎬ转化大肠杆菌 ＤＨ５ɑ
感受态细胞ꎬ挑取白色菌落进行菌液培养ꎬ经 ＰＣＲ
７５４
　
植物病理学报 ４４卷
鉴定获得的重组质粒ꎬ 由北京诺赛基因组研究中
心进行测序ꎮ
１.６　 序列分析
　 　 将所有 ＧｅｎＢａｎｋ 上已登录的 ＧＶＥ 分离物和
本研究获得的 ＧＶＥ分离物的 ＣＰ基因采用 ＤＮＡＳ￣
ＴＡＲ中的 ＭｅｇＡｌｉｇｎ程序的进行多序列比对ꎬ并用
ＭＥＧＡ５.２ 软件中的 Ｍａｘｉｍｕｍ Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ 方法进
行系统进化树分析ꎮ 各个 ＧＶＥ分离物之间的相似
性分析采用 ＣｌｕｓｔａｌＷ 程序进行ꎮ 利用 ＤＮＡＳＴＡＲ
中的 ＭｅｇＡｌｉｇｎ程序中的 Ｊｏｔｕｎ Ｈｅｉｎ方法将获得的
中国 ＧＶＥ 分离物基因组全长与所有已报道的
ＧＶＥ分离物进行各阅读框的核苷酸和氨基酸序列
相似性比较分析ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 ＧＶＥ分子检测
　 　 根据 ＧＶＥ ＣＰ和 ＭＰ 基因序列设计的 ２ 对引
物均能用于 ＲＴ－ＰＣＲ检测ꎬ其扩增片段经克隆、测
序ꎬ证实为 ＧＶＥ 特异性片段ꎬ测序结果已登录至
ＧｅｎＢａｎｋꎬ登录号为 ＫＣ４１２２５４ 和 ＫＣ４１２２５５ꎮ 采
用上述两对引物检测了 ２１１ 个葡萄样品ꎬ结果 １２
个样品为阳性ꎬ平均带毒率为 ５.７％ꎮ
２.２　 ＧＶＥ分离物外壳蛋白基因序列分析
　 　 扩增了火焰无核(１２ 号、２５３ 号)、黑贝蒂(２４５
号)、金星无核(２４９ 号)、郑果大无核(２５５ 号)、红
茧(２６４ 号)和黑蜜 (２６７ 号)等 ７ 株葡萄样品的
ＧＶＥ外壳蛋白基因ꎬ并对 ＰＣＲ 产物进行了克隆、
测序ꎮ 测序结果显示ꎬ所有获得的 ＣＰ 基因克隆序
列大小均为 ６００ ｂｐꎬ其核苷酸序列的一致性为
７７.０％~１００.０％ꎬ氨基酸序列的一致性为 ８６.１％ ~
１００.０％ꎮ 从分离物内同源性在 ９９％以上的克隆中
选取 １个ꎬ与 ＧｅｎＢａｎｋ 登录的 ＧＶＥ ＣＰ 基因进行
核苷酸系统进化分析ꎬ结果显示ꎬ所有的 ＧＶＥ ＣＰ
基因核苷酸序列分为 ２ 个明显的组群ꎬ组群 ＩＩ 中
２５３号的两个克隆与日本报道的 ＴｖＡＱ７ 分离物同
源性达 ９８％以上ꎬ组群 Ｉ 中各 ＧＶＥ 分离物之间同
源性在 ９８％以上ꎮ ２５３号分离物克隆在 Ｇｒｏｕｐ Ｉ的
比例为 ７７.８％(７ / ９)ꎬ在 Ｇｒｏｕｐ ＩＩ 的比例为 ２２.２％
(２ / ９)(图 １)ꎮ 本研究将部分 ＧＶＥ 克隆序列提交
至 ＧｅｎＢａｎｋ上ꎬ登录号为 ＫＦ５８８０１６~ＫＦ５８８０３４ꎮ
Ｆｉｇ. １　 Ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ￣ｂａｓｅｄ ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｓｈｏｗｉｎｇ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ
ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ａｎｄ ｆｏｒｅｉｇｎ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｖｉｒｕｓ Ｅ (ＧＶＥ)
Ｏｎｌｙ >５０％ ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｖａｌｕｅｓ ｗｅｒｅ ｓｈｏｗｎ.
８５４
　
　 ５期 范旭东ꎬ等:葡萄病毒 Ｅ分子检测及基因序列分析
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｐｅｒｃｅｎｔ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ / ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅｓ ａｎｄ
ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ (ＵＴＲ) ｂｅｔｗｅｅｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｉｓｏｌａｔｅ ＧＦＭＧ￣１ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ＧＶＥ ｉｓｏｌａｔｅｓ
Ｖｉｒｕｓ ｉｓｏｌａｔｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. ５′ＵＴＲ / ％ Ｒｅｐ / ％ ＨＰ / ％ ＭＰ / ％ ＣＰ / ％ ＮＢ / ％ ３′ＵＴＲ / ％
ＧＶＥ ＴｖＡＱ７ ＡＢ４３２９１０ １００ ９８.１ / ９８.８ ９７.９ / ９５.４ ９６.９ / ９８.９ ９９.５ / １００ ９７.９ / ９６.４ ９８.１
ＧＶＥ Ｔｖｐ１５ ＡＢ４３２９１１ － / － － / － ７９.８ / ７８.０ ７３.１ / ７７.９ ７７.４ / ８７.１ ７９.６ / ７９.１ ７４.８
ＧＶＥ ＷＡＨＨ２ ＪＸ４０２７５９ ８６.４ ６９.８ / ７３.８ ８０.７ / ７９.８ ７３.２ / ７７.９ ７７.４ / ８７.１ ８０.５ / ８０.９ ７５.０
ＧＶＥ ＳＡ９４ ＧＵ９０３０１２ ８６.４ ６９.４ / ７３.９ ８０.１ / ８０.７ ７３.３ / ７７.９ ７７.９ / ８７.１ ７９.９ / ８１.８ ７５.０
ＧＶＥ ５９ＰＥ ＫＦ０２９７５１ － / － － / － ７０.２ / ７８.９ ７３.７ / ７６.６ ７７.２ / ８７.１ ７２.４ / ８０.０ － / －
　
２.３　 ＧＶＥ中国分离物全长序列分析
　 　 本研究获得了一个 ＧＶＥ 分离物全长序列ꎬ命
名为 ＧＦＭＧ￣１ꎬ其全基因组序列长 ７ ５７１ ｂｐ(登录
号:ＫＦ５８８０１５)ꎬ比南非分离物 ＳＡ９４(７ ５６８ ｂｐꎬ登
录号:ＧＵ９０３０１２)和美国分离物 ＷＡＨＨ２ (７ ５６８
ｂｐꎬ登录号:ＪＸ４０２７５９)多 ３ 个核苷酸ꎮ 核苷酸序
列比较结果表明ꎬ中国 ＧＶＥ 分离物 ＧＦＭＧ￣１与日
本分离物 ＴｖＡＱ７(７５６４ꎬ登录号:ＡＢ４３２９１０)最为
相似ꎬ相似度为 ９８.０％ꎬ且具有更完整的 ５’末端序
列ꎮ 与日本分离物 Ｔｖｐ１５、美国分离物 ＷＡＨＨ２、
南非分离物 ＳＡ９４和波兰分离物 ５９ＰＥ 的相似度为
７０.０％~７５.０％ꎮ 对这些分离物的开放阅读框单独
进行了核苷酸和氨基酸的比对ꎬ结果表明ꎬＧＦＭＧ￣
１与日本分离物 ＴｖＡＱ７ 的核苷酸序列相似度为
９６.９％ ~ １００％ꎬ氨基酸序列相似度为 ９５. ４％ ~
１００％ꎮ 而与日本分离物 Ｔｖｐ１５、美国分离物
ＷＡＨＨ２、南非分离物 ＳＡ９４ 和波兰分离物的核苷
酸序列相似度分别为 ７３. １％ ~ ７９. ８％、 ６９. ８％ ~
８６.４％、６９.４％~８６.４％和 ７０.２％ ~ ７７.２％ꎬ氨基酸序
列相似度分别为 ７７.９％ ~ ８７.１％、７３.８％ ~ ８７.１％、
７３.９％~８７.１％和 ７６.６％~８７.１％(表 ３)ꎮ
３　 讨论
　 　 本研究起初采用了引物 ＧＶＥ￣１￣Ｆｏｒ / ＧＶＥ￣
Ｒｅｖ[７]进行 ＧＶＥ ＰＣＲ 扩增ꎬ结果其扩增产物的杂
带较多ꎬ且扩增效率不高ꎮ 为了获得更好的检测效
果ꎬ针对 ＧＶＥ的 ＭＰ和 ＣＰ 基因分别设计了引物ꎬ
ＰＣＲ扩增结果表明ꎬ新设计的两对引物检测效果
良好ꎬ可以用于 ＧＶＥ 的常规检测ꎮ 本研究采用的
柱式 ＲＮＡ提取方法与国外报道的 Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ
ｍｅｔｈｏｄ吸附柱法[９]类似ꎬ但采用了价格相对低廉
的国产吸附柱和试剂ꎬ能够高效快速地提取葡萄总
ＲＮＡꎬ所提 ＲＮＡ的质量可以满足 ＧＶＥ ＣＰ 基因及
全基因组序列的扩增ꎬ具有较好的应用价值ꎮ 进化
树分析结果表明ꎬ本研究获得的 ＧＶＥ 分离物外壳
蛋白基因序列绝大部分与 Ｇｒｏｕｐ Ｉ 中的日本分离
物 Ｔｖｐ１５相似度高ꎮ 目前 Ｇｒｏｕｐ ＩＩ 中仅有一个不
完整的日本 ＴｖＡＱ７ 分离物序列被报道ꎬ本研究新
报道了一个属于 Ｇｒｏｕｐ ＩＩ 的中国分离物 ＧＦＭＧ￣１
全长序列ꎬ丰富了 ＧＶＥ 全基因组序列信息ꎮ 研究
中发现ꎬ我国 ７个分离物中的 ６ 个分离物ꎬ无论在
分离物之间ꎬ还是分离物内部克隆之间ꎬ其外壳蛋
白基因相似度均在 ９９％以上ꎬ未表现品种特异性ꎬ
在某种程度上表明 ＧＶＥ 较 ＧＶＡ 的种群变异小ꎬ
这与先前对 ＧＶＡ 和 ＧＶＥ 的高通量测序的深度分
析结果吻合[７ꎬ１０]ꎮ
　 　 葡萄病毒种类繁多ꎬ田间多为复合侵染ꎬ这给
葡萄病毒病的病原鉴定带来困难ꎮ 目前的研究表
明ꎬ葡萄皱木复合病的发生与葡萄病毒属成员的侵
染密切相关ꎬ但其病因并不十分清楚ꎮ 只有对相关
的病原进行细致的调查和研究ꎬ才能更全面地认识
该病害ꎮ ＧＶＥ 作为葡萄病毒属的新成员ꎬ自报道
以来ꎬ逐渐引起了研究者的重视ꎮ 本研究建立了
ＧＶＥ的分子检测方法ꎬ初步分析了 ＧＶＥ 在我国的
发生及其基因变异情况ꎬ为进一步明确我国 ＧＶＥ
发生、分布及分子检测提供了依据ꎮ
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责任编辑:李晖
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