全 文 ：植物保护学报 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， ２０１６， ４３（２）： ２６０ － ２６６ ＤＯＩ： １０􀆰 １３８０２ ／ ｊ． ｃｎｋｉ． ｚｗｂｈｘｂ． ２０１６􀆰 ０２􀆰 ０１２
基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项（２０１１０３０１８），国家自然科学基金（３１３７１９２２）
∗通讯作者（Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ）， Ｅ⁃ｍａｉｌ： ｌｉｈｍ＠ ｎｊａｕ． ｅｄｕ． ｃｎ
收稿日期： ２０１４ － １０ － ０５
采用环介导等温扩增法（ＬＡＭＰ）快速检测
苹果根结线虫
魏洪岩１ 　 王　 暄１ 　 李红梅１∗　 孙文荣１ 　 顾建锋２
（１．南京农业大学植物保护学院， 农作物生物灾害综合治理教育部重点实验室， 南京 ２１００９５；
２．宁波出入境检验检疫局， 浙江 宁波 ３１５０１２）
摘要： 为高效、简便、快速地对我国进境植物检疫性有害生物名录中的非中国种—苹果根结线虫
Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｍａｌｉ进行检疫，通过比较 ＧｅｎＢａｎｋ中根结线虫相关序列，以苹果根结线虫 ２８Ｓ ｒＤＮＡ非
保守区域序列设计环介导等温扩增（ ｌｏｏｐ⁃ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）的特异性引物，并
优化反应条件，建立一种可快速检测苹果根结线虫的 ＬＡＭＰ 检测体系。 结果显示：ｄＮＴＰｓ 浓度为
０􀆰 ４ ｍｍｏｌ ／ Ｌ、Ｍｇ２ ＋浓度为 ５􀆰 ０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ、不添加甜菜碱、反应时间为 ６０ ｍｉｎ 时，ＬＡＭＰ 检测体系扩增
效率最高；用琼脂糖凝胶电泳、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ 染色和 ＬＦＤ 试纸均能检测到苹果根结线虫的扩增产
物。 所建立的 ＬＡＭＰ检测体系能够从 １０ 种供试植物线虫种群中特异性地检测出苹果根结线虫，灵
敏度为 １ ／ ２０ ０００ 条线虫 ＤＮＡ，比常规 ＰＣＲ灵敏度高 １０ 倍。 表明所建立的苹果根结线虫 ＬＡＭＰ快
速检测体系可用于我国口岸进境植物中苹果根结线虫检疫。
关键词： 苹果根结线虫； 环介导等温扩增； 优化； 特异性； 灵敏度
Ｌｏｏｐ⁃ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ
ｏｆ Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｍａｌｉ
Ｗｅｉ Ｈｏｎｇｙａｎ１ 　 Ｗａｎｇ Ｘｕａｎ１ 　 Ｌｉ Ｈｏｎｇｍｅｉ１∗ 　 Ｓｕｎ Ｗｅｎｒｏｎｇ１ 　 Ｇｕ Ｊｉａｎｆｅｎｇ２
（１． Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ａｎｄ Ｐｅｓｔｓ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ；
Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ， Ｎａｎｊｉｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００９５， Ｊｉａｎｇｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ；
２． Ｎｉｎｇｂｏ Ｅｎｔｒｙ⁃Ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕ， Ｎｉｎｇｂｏ ３１５０１２， Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ， Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ， ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔｌｙ ａｎｄ ｒａｐｉｄｌｙ ｄｅｔｅｃｔ Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｍａｌｉ， ａ ｎｏｎ⁃Ｃｈｉｎｅｓｅ
ｓｐｅｃｉｅｓ ｌｉｓｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ ｏｆ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｐｅｓｔ ｆｏｒ Ｉｍｐｏｒｔ Ｐｌａｎｔｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｐｅｏｐｌｅ’ｓ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｃｈｉｎａ， ａ
ｌｏｏｐ⁃ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ （ＬＡＭＰ） ａｓｓａｙ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ． Ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ＬＡＭＰ
ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ２８Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ （ｒＤＮＡ） ｎｏｎ⁃ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｍ． ｍａｌｉ ｂｙ
ｃｏｍｐａｒｉｎｇ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｓｐｐ． ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ ｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ． Ｔｈｅ ＬＡＭＰ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｗｉｔｈ ｈｉｇｈｅｓｔ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ０􀆰 ４ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ｄＮＴＰｓ， ５􀆰 ０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
Ｍｇ２ ＋ ， ｗｉｔｈｏｕｔ ａｄｄｉｎｇ ｂｅｔａｉｎｅ， ａｎｄ ６０ ｍｉｎｕｔｅｓ ｏｆ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ． Ｔｈｅ ＬＡＭＰ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ
ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ， ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｄｙｉｎｇ ａｎｄ ｌａｔｅｒａｌ ｆｌｏｗ ｄｉｐｓｔｉｃｋ （ＬＦＤ）． Ｔｈｅ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ａｂｌｅ ｔｏ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｄｅｔｅｃｔ Ｍ． ｍａｌｉ ｆｒｏｍ ｔｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ
ｎｅｍａｔｏｄｅｓ． Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＬＡＭＰ ａｓｓａｙ ｗａｓ １ ／ ２０ ０００ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｎｅｍａｔｏｄｅ ＤＮＡ， ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｔｅｎ ｔｉｍｅｓ
ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ ａｓｓａｙ． Ｔｈｅ ＬＡＭＰ ｓｙｓｔｅｍ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｆｏｒ Ｍ． ｍａｌｉ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗａｓ
ｐｒｏｖｅｎ ｔｏ ｂｅ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ， ａｎｄ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ａｐｐｌｉｅｄ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ ａｔ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｐｏｒｔｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｍａｌｉ； ＬＡＭＰ； ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ； ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ； ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ
　 　 根结线虫 Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｓｐｐ． 广泛分布于世界各
地，国际上已报道的就超过 １００ 种（Ｐｅｒｒｙ ＆ Ｍｏｅｎｓ，
２００６），我国有记载发生的近 ４０ 种（刘维志，２００５）；
能寄生 ２ ０００ 多种植物，几乎涵盖了大部分重要的
粮食及经济作物，全球每年因其为害造成近千亿美
元的经济损失（Ａｇｒｉｏｓ，２００５）。 因此，我国于 ２００７
年将根结线虫（非中国种）列入《中华人民共和国进
境植物检疫性有害生物名录》，要求各口岸对其实
施严格检疫，以保护我国农业和生态安全。 近年来，
宁波口岸多次从来自日本的鸡爪槭根系及根围介质
中截获一种根结线虫，鉴定为非中国种的苹果根结
线虫 Ｍ． ｍａｌｉ Ｉｔｏｈ， Ｏｈｓｈｉｍａ ＆ Ｉｃｈｉｎｏｈｅ，初步统计近
３０％的日本鸡爪槭苗木携带该种线虫（顾建锋等，
２０１３ａ），传入我国的风险极大。 苹果根结线虫最早
在日本苹果树根系被发现（ Ｉｔｏｈ ｅｔ ａｌ． ，１９６９），除能
寄生苹果、葡萄、樱桃、鸡爪槭、桑树、玫瑰、海棠果、
枸树和榆树等木本植物外，也能为害番茄、茄子、辣
椒、黄瓜、白菜、大豆、牛蒡等蔬菜作物，对农林业生
产均具有一定威胁（Ｔｏｉｄａ，１９７９）。 由于苹果根结线
虫的寄主范围广泛，一旦传入将给当地的农业及生
态安全带来极大的威胁，因此对其进行高效、快速、
准确的检测和鉴定对于口岸检疫监控尤为重要。
植物病原线虫的传统鉴定方法主要依据形态学
特征，通常需要丰富的专业知识和实践经验，鉴定过
程费时费力。 近年来随着分子生物学技术的发展，
包括限制性片段长度多态性 （ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔ
ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＲＦＬＰ） （Ｘｕ ｅｔ ａｌ． ，２００４）、特定
序列扩增（ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ，
ＳＣＡＲ）（Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ． ，２００４）、实时荧光定量 ＰＣＲ（ｒｅ⁃
ａｌ⁃ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ， ｑＲＴ⁃
ＰＣＲ）（Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ． ，２０１０）等多种技术已被成功运用
到植物病原线虫包括根结线虫的检测鉴定中。 上述
技术的应用均需在实验室条件下借助专业的仪器设
备完成，往往难以满足国际贸易飞速增长带来的口
岸高通量货物进出口需求。 因此亟需建立一种高
效、快速、便捷的苹果根结线虫检测方法，为进出口
口岸的监测防控提供有力的技术支持。
环介导等温扩增技术（ ｌｏｏｐ⁃ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＬＡＭＰ）是一种借助于具有链置换活性
的 ＤＮＡ聚合酶（Ｂｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）实现恒温扩增
的技术，利用扩增过程中产生的焦磷酸镁沉淀物或
者添加荧光染料后颜色的变化，肉眼即可判定扩增
结果，不需要专业的检测仪器，具有简单、快速、高
效、经济等特点（Ｎｏｔｏｍｉ ｅｔ ａｌ． ，２０００）。 目前 ＬＡＭＰ
技术已在松材线虫 Ｂｕｒｓａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ（Ｋｉｋｕ⁃
ｃｈｉ ｅｔ ａｌ． ，２００９）、香蕉穿孔线虫 Ｒａｄｏｐｈｏｌｕｓ ｓｉｍｉｌｉｓ
（Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ． ，２０１２）、象耳豆根结线虫 Ｍ． ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ
（Ｎｉｕ ｅｔ ａｌ． ，２０１２；何旭峰等，２０１３）、禾谷孢囊线虫
Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ ａｖｅｎａｅ（彭德良等，２０１３）等植物寄生线虫
的快速检测中得到应用，有效提高了其鉴定效率和
准确率。 在此基础上，本研究以苹果根结线虫为靶
标，通过设计特异性引物及优化反应条件，建立一套
ＬＡＭＰ快速检测体系，以期为我国口岸部门对苹果
根结线虫的检疫监测提供技术支持。
１ 材料与方法
１􀆰 １ 材料
供试线虫：苹果根结线虫群体截获自进境的日
本鸡爪槭根部和根围介质（顾建锋等，２０１３ａ），由宁
波出入境检验检疫局惠赠，所赠线虫样品均经过热
杀死处理。 用于特异性检测的其它 ９ 种植物寄生线
虫群体，都来自本实验室虫种保存。 其中，南方根结
线虫 Ｍ． ｉｎｃｏｇｎｉｔａ、爪哇根结线虫 Ｍ． ｊａｖａｎｉｃａ、花生
根结线虫Ｍ． ａｒｅｎａｒｉａ、北方根结线虫Ｍ． ｈａｐｌａ、象耳
豆根结线虫 Ｍ． ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ 和西班牙根结线虫 Ｍ．
ｈｉｓｐａｎｉｃａ群体保存在温室的感病番茄品种上，经扩
繁后挑取番茄根系上的卵块，于 ２５℃恒温培养箱孵
化 ２ ｄ 后，收集 ２ 龄幼虫备用；水稻干尖线虫 Ａｐｈｅ⁃
ｌｅｎｃｈｏｉｄｅｓ ｂｅｓｓｅｙｉ、燕麦真滑刃线虫 Ａｐｈｅｌｅｎｃｈｕｓ ａｖｅｎａｅ
和松材线虫群体以平板保存，在长满新鲜灰葡萄孢
菌 Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ的马铃薯葡萄糖琼脂（ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘ⁃
ｔｒｏｓｅ ａｇａｒ，ＰＤＡ）培养基（葡萄糖 １８ ｇ、马铃薯 ２００ ｇ、
琼脂 １７ ｇ、水 １ ０００ ｍＬ）上扩繁 １ ～ ２ 周，待线虫吃完
菌丝后，用贝曼漏斗法分离基质 ２４ ｈ，收集线虫备用
（王婷婷等，２０１４）。
试剂及仪器：Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶、ｄＮＴＰｓ、蛋白
酶 Ｋ、ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ、ＭｇＣｌ２ 购自宝生物工程（大连）有
限公司；甜菜碱 （ ｂｅｔａｉｎｅ）购自美国 Ｓｉｇｍａ 公司；
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ 染料购自美国 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司； Ｂｓｔ
ＤＮＡ聚合酶购自美国 ＮＥＢ公司；横向流动试纸（ｌａｔ⁃
ｅｒａｌ ｆｌｏｗ ｄｉｐｓｔｉｃｋ，ＬＦＤ）购自德国 Ｍｉｌｅｎｉａ Ｂｉｏｔｅｃ 公
司；异硫氰酸荧光素 （ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ，
ＦＩＴＣ）、生物素（ｂｉｏｔｉｎ）由英潍捷基（上海）贸易有限
公司标记。 Ｌｅｉｃａ ＭＺ９５ 体视显微镜，德国 Ｌｅｉｃａ Ｍｉ⁃
１６２２ 期 魏洪岩等： 采用环介导等温扩增法（ＬＡＭＰ）快速检测苹果根结线虫
ｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ ＩＲ ＧｍｂＨ 公司；培清 ＪＳ⁃７８０ 全自动凝胶
成像分析仪，上海培清科技有限公司。
１􀆰 ２ 方法
１􀆰 ２􀆰 １ 线虫 ＤＮＡ的提取
单条线虫的 ＤＮＡ提取参考宋志强等（２０１３）的
方法。 在体视显微镜下挑取单条线虫（幼虫或成
虫），放入含有 １６ μＬ ｄｄＨ２Ｏ和 ２ μＬ １０ × ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ
（Ｍｇ２ ＋ ｆｒｅｅ）的 ２００ μＬ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，液氮中冷冻 ３
ｍｉｎ 后，置于 ９５℃下 ２ ｍｉｎ，重复 ３ 次；向管中加入 １０
μｇ ／ μＬ蛋白酶 Ｋ ２ μＬ，６５℃温育 １ ｈ 后，置于 ９５℃
下 １０ ｍｉｎ，上清液作为基因组 ＤＮＡ模板备用。
１􀆰 ２􀆰 ２ ＬＡＭＰ引物设计
下载 ＧｅｎＢａｎｋ 中所有根结线虫的 ２８Ｓ ｒＤＮＡ 基
因序列，从 Ｍｅｇａ ４􀆰 ０ 软件的多序列比对结果中，选
择苹果根结线虫（登录号 ＪＸ９７８２２６）与其它根结线
虫种间差异大的非保守区域序列（１１２ ～ ３１７ ｂｐ）作
为 ＬＡＭＰ引物靶标区域，利用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｌｏｒｅｒ ４􀆰 ０ 分
析获得 １２ 组 ＬＡＭＰ 引物，结合特异性及自由能
（△Ｇ）最终筛选获得 １ 组 ＬＡＭＰ 引物，包括 ２ 条外
引物（Ｍｍ⁃Ｆ３ 和 Ｍｍ⁃Ｂ３）、２ 条内引物（Ｍｍ⁃ＦＩＰ 和
Ｍｍ⁃ＢＩＰ）和 ２ 条环引物（Ｍｍ⁃ＬＢ和 Ｍｍ⁃ＬＦ）（表 １）。
为便于扩增产物的 ＬＦＤ 试纸检测，利用 Ｐｒｉｍｅｒ
Ｐｒｅｍｉｅｒ ５􀆰 ０ 软件在引物 Ｍｍ⁃Ｆ３ 和 Ｍｍ⁃Ｂ３ 的扩增区
之间设计杂交探针 Ｍｍ⁃Ｐｒｏｂｅ（表 １），并由英潍捷基
（上海）贸易有限公司对其 ５′端进行 ＦＩＴＣ 标记，同
时对 Ｍｍ⁃ＦＩＰ的 ５′端进行生物素标记。
表 １ 本研究中所用的引物序列
Ｔａｂｌｅ １ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
来源 Ｏｒｉｇｉｎ 引物 Ｐｒｉｍｅｒ 　 　 核苷酸序列 Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ （５′→３′）
本研究中 ＬＡＭＰ检测体系 Ｍｍ⁃Ｆ３ ＡＧＣＧＴＴＴＣＧＧＡＣＴＴＴＧＡＴＣＴ
ＬＡＭＰ ａｓｓａｙ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ Ｍｍ⁃Ｂ３ ＡＴＡＧＡＧＣＴＣＧＴＡＡＧＣＣＴＴＧＣ
Ｍｍ⁃ＦＩＰ ＣＧＣＣＴＣＴＡＣＧＣＡＣＴＣＣＡＣＡＴＧＧＧＧＣＡＣＴＧＴＴＣＧＡＡＡＴＣＧＴ
Ｍｍ⁃ＢＩＰ ＣＴＣＴＧＴＴＴＴＧＡＧＧＣＣＡＧＣＴＴＧＣＡＡＣＧＴＣＣＧＧＡＡＣＡＡＡＡＧＧＴ
Ｍｍ⁃ＬＢ ＴＧＧＴＡＣＣＣＡＡＡＣＴＴＴＧＧＣＡＧＣ
Ｍｍ⁃ＬＦ ＡＡＡＴＧＣＡＣＣＡＣＡＣＣＡＣＣＡＣ
Ｍｍ⁃Ｐｒｏｂｅ ＧＧＡＧＴＧＣＧＴＡＧＡＧＧＣＧＴＣＡＧＧ
ｒＤＮＡ⁃２８Ｓ区扩增（ｄｅ Ｌｅｙ ｅｔ ａｌ． ， １９９９） Ｄ２Ａ ＡＣＡＡＧＴＡＣＣＧＴＧＡＧＧＧＡＡＡＧＴＴＧ
ｒＤＮＡ⁃２８Ｓ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ｄｅ Ｌｅｙ ｅｔ ａｌ． ，１９９９） Ｄ３Ｂ ＴＣＧＧＡＡＧＧＡＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＡ
苹果根结线虫种特异性检测（顾建锋等，２０１３ｂ） ＭｍＦ ＧＧＧＡＣＣＧＡＣＧＧＣＴＴＡＧＴＧ
Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍ． ｍａｌｉ（Ｇｕ ｅｔ ａｌ． ， ２０１３ｂ） ＭｍＲ ＣＣＧＴＴＡＣＡＣＧＡＣＧＡＧＡＧＴＣ
１􀆰 ２􀆰 ３ ＬＡＭＰ反应体系的建立
ＬＡＭＰ反应体系参照 Ｎｏｔｏｍｉ ｅｔ ａｌ． （２０００）所述，
对体系中的 ｄＮＴＰｓ、Ｍｇ２ ＋ 、甜菜碱和反应时间进行优
化。 反应体系包括 ＤＮＡ模板 １ μＬ、内引物 Ｍｍ⁃ＦＩＰ
和 Ｍｍ⁃ＢＩＰ各 ０􀆰 ８ μｍｏｌ ／ Ｌ、外引物 Ｍｍ⁃Ｆ３ 和 Ｍｍ⁃Ｂ３
各 ０􀆰 ２ μｍｏｌ ／ Ｌ、环引物 Ｍｍ⁃ＬＢ 和 Ｍｍ⁃ＬＦ 各 ０􀆰 ４
μｍｏｌ ／ Ｌ、 ｄＮＴＰｓ （０、０􀆰 ２、０􀆰 ４、０􀆰 ８、１􀆰 ０、１􀆰 ２、１􀆰 ６ 或
２􀆰 ０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ）、ＭｇＣｌ２ （１􀆰 ０、２􀆰 ０、３􀆰 ０、４􀆰 ０、５􀆰 ０ 或 ６􀆰 ０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ）、甜菜碱（０、０􀆰 ２、０􀆰 ４、０􀆰 ６、０􀆰 ８、１􀆰 ０、１􀆰 ２ 或
１􀆰 ４ ｍｏｌ ／ Ｌ）、１０ × Ｔｈｅｒｍｏｐｏｌ Ｂｕｆｆｅｒ ２􀆰 ５ μＬ、Ｂｓｔ ＤＮＡ
聚合酶 ８ Ｕ，ｄｄＨ２Ｏ 补足至 ２５ μＬ。 混合均匀后，置
于 ６５℃恒温水浴锅中保温 １５ ～ ７５ ｍｉｎ，８０℃保温
１０ ｍｉｎ。
１􀆰 ２􀆰 ４ ＬＡＭＰ扩增产物的检测
采用 ３ 种方法检测 ＬＡＭＰ扩增产物，① 琼脂糖
凝胶电泳法，取 ４ μＬ扩增产物在 ２％琼脂糖凝胶上
电泳， ＥＢ 染色后在凝胶成像仪中观察并拍照；
② ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ染料显色法，在 ＬＡＭＰ反应终止后
的 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管中，加入 ０􀆰 ２ μＬ该染料，混匀后用肉
眼直接观察颜色的变化；③ ＬＦＤ 试纸测试法，在
ＬＡＭＰ反应终止后的 Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ 管中，加入 ５ μＬ
ＦＩＴＣ标记的 ２０ ｐｍｏｌ ／ Ｌ 探针 Ｍｍ⁃Ｐｒｏｂｅ，６３℃保温 ５
ｍｉｎ，自然冷却到室温，取 １０ μＬ杂交液加入 １００ μＬ
ＰＢＳ缓冲液混合均匀，将 ＬＦＤ 试纸浸入其中，５ ｍｉｎ
后观察显色情况（何旭峰等，２０１３）。
１􀆰 ２􀆰 ５ ＬＡＭＰ的特异性检测
分别提取苹果根结线虫以及其它 ９ 种供试线虫
的基因组 ＤＮＡ 作为模板进行 ＬＡＭＰ 反应的琼脂糖
凝胶电泳法和 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ 显色法检测。 此外，以
引物 Ｄ２Ａ ／ Ｄ３Ｂ扩增各线虫的 ２８Ｓ ｒＤＮＡ 区作为对
照（ｄｅ Ｌｅｙ ｅｔ ａｌ． ，１９９９），反应体系为：ＤＮＡ 模板 ２
μＬ、２􀆰 ５ μｍｏｌ ／ Ｌ 正反引物各 ２ μＬ、 ２􀆰 ５ ｍｍｏｌ ／ Ｌ
ｄＮＴＰｓ ２ μＬ、１０ × Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２ ＋ ｆｒｅｅ）２􀆰 ３ μＬ、
１０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ＭｇＣｌ２ ２ μＬ、Ｅｘ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶 ０􀆰 １ μＬ，
２６２ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
ｄｄＨ２Ｏ补足至 ２５ μＬ。 扩增条件：９４℃ ４ ｍｉｎ；９４℃
４０ ｓ，５５℃ ４０ ｓ，７２℃ １ ｍｉｎ，３９ 个循环；７２℃ １０ ｍｉｎ。
ＰＣＲ产物在琼脂糖凝胶电泳上检测。
图 １ 苹果根结线虫环介导等温扩增（ＬＡＭＰ）反应各优化条件的扩增结果
Ｆｉｇ． １ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｒｏｍ Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｍａｌｉ ｂｙ ＬＡＭＰ ｕｎｄｅｒ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
Ａ： １ ～ ８ 分别为 ０、０􀆰 ２、０􀆰 ４、０􀆰 ８、１􀆰 ０、１􀆰 ２、１􀆰 ６、２􀆰 ０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ ｄＮＴＰｓ，９ 为阴性对照； Ｂ： １ ～ ６ 分别为 １􀆰 ０、２􀆰 ０、３􀆰 ０、４􀆰 ０、
５􀆰 ０、６􀆰 ０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ Ｍｇ２ ＋ ，７ 为阴性对照； Ｃ： １ ～ ８ 分别为 ０、０􀆰 ２、０􀆰 ４、０􀆰 ６、０􀆰 ８、１􀆰 ０、１􀆰 ２、１􀆰 ４ ｍｏｌ ／ Ｌ甜菜碱，９ 为阴性对照； Ｄ：
１ ～ ５ 分别为 １５、３０、４５、６０、７５ ｍｉｎ反应时间，６ 为阴性对照； Ｍ： ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００。 Ａ： １ － ８ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｄＮＴＰｓ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ
ｏｆ ０， ０􀆰 ２， ０􀆰 ４， ０􀆰 ８， １􀆰 ０， １􀆰 ２， １􀆰 ６， ２􀆰 ０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ； ９： ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ； Ｂ： １ － ６ ｉｎｄｉｃａｔｅ Ｍｇ２ ＋ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ
１􀆰 ０， ２􀆰 ０， ３􀆰 ０， ４􀆰 ０， ５􀆰 ０， ６􀆰 ０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ； ７： ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ； Ｃ： １ － ８ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈｅ ｂｅｔａｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ０， ０􀆰 ２，
０􀆰 ４， ０􀆰 ６， ０􀆰 ８， １􀆰 ０， １􀆰 ２， １􀆰 ４ ｍｏｌ ／ Ｌ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ； ９： ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ； Ｄ： １ － ５ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｏｆ １５， ３０， ４５， ６０，
７５ ｍｉｎ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ； ６： ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ； Ｍ： ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００． 　
１􀆰 ２􀆰 ６ ＬＡＭＰ的灵敏度检测
从苹果根结线虫单条幼虫的 ２０ μＬ ＤＮＡ 模板
中取 １ μＬ，即初始浓度为 １ ／ ２０ 单条幼虫 ＤＮＡ，按 １０
倍梯度分别稀释 １０ － １、１０ － ２、１０ － ３、１０ － ４、１０ － ５和 １０ － ６
后，用于琼脂糖凝胶电泳法和 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ 显色法
检测 ＬＡＭＰ反应灵敏度。 此外，以苹果根结线虫的
种特异性引物 ＭｍＦ ／ ＭｍＲ进行常规 ＰＣＲ扩增（顾建
锋等，２０１３ｂ），反应体系同 １􀆰 ２􀆰 ５。 扩增条件：９４℃ ４
ｍｉｎ；９４℃ ４０ ｓ，６０℃ ４０ ｓ，７２℃ １ ｍｉｎ，３９ 个循环；
７２℃ １０ ｍｉｎ。 ＰＣＲ产物在琼脂糖凝胶电泳上检测。
２ 结果与分析
２􀆰 １ ＬＡＭＰ反应体系各条件的优化
以苹果根结线虫 ＤＮＡ为模板，当 ｄＮＴＰｓ浓度在
０􀆰 ２ ～ １􀆰 ２ ｍｍｏｌ ／ Ｌ之间，ＬＡＭＰ反应均有扩增产物出
现，其中 ０􀆰 ４ ｍｍｏｌ ／ Ｌ 的扩增梯形条带最亮，反应效
率最高（图 １⁃Ａ）；随着 Ｍｇ２ ＋浓度的增加，ＬＡＭＰ 反
应的扩增效率先增高后降低， Ｍｇ２ ＋ 浓度为 ５􀆰 ０
ｍｍｏｌ ／ Ｌ时扩增产物最多（图 １⁃Ｂ）；在反应体系中添
加不同浓度的甜菜碱后，对扩增效率无明显促进作
用，表明本体系中不需添加甜菜碱（图 １⁃Ｃ）；反应时
间为 １５ ｍｉｎ时无扩增产物，达到 ６０ ｍｉｎ时可检测到
大量扩增产物，随着时间的进一步延长，扩增产物无
明显变化（图 １⁃Ｄ）。 综上所述，优化后的苹果根结
线虫 ＬＡＭＰ反应体系为：ｄＮＴＰｓ浓度为 ０􀆰 ４ ｍｍｏｌ ／ Ｌ、
Ｍｇ２ ＋浓度为 ５􀆰 ０ ｍｍｏｌ ／ Ｌ、不添加甜菜碱、反应时间
６０ ｍｉｎ。
２􀆰 ２ 苹果根结线虫 ＬＡＭＰ反应的扩增产物
采用优化后的 ＬＡＭＰ 反应体系检测苹果根结线
虫，反应结束后，琼脂糖凝胶电泳、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ染色
和 ＬＦＤ试纸条均能检测到扩增产物。 ＬＡＭＰ 反应产
物经电泳后可检测到明亮的梯形条带，而阴性对照无
条带出现（图 ２⁃Ａ）。 向 ＬＡＭＰ扩增产物中加入 ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ Ｉ染料，混匀后阳性产物迅速变成绿色，阴性对
照则呈现橘黄色 （图 ２⁃Ｂ）。 用 ＬＦＤ 试纸条检测
ＬＡＭＰ反应产物，结果显示阳性产物在试纸条上出现
２个显色带，而阴性对照只出现控制带（图 ２⁃Ｃ）。
２􀆰 ３ 苹果根结线虫 ＬＡＭＰ反应的特异性
以苹果根结线虫等 １０ 种植物线虫 ＤＮＡ为模板
３６２２ 期 魏洪岩等： 采用环介导等温扩增法（ＬＡＭＰ）快速检测苹果根结线虫
图 ２ 苹果根结线虫环介导等温扩增（ＬＡＭＰ）反应扩增产物的检测
Ｆｉｇ． ２ Ｐｒｏｄｕｃｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｂｙ ＬＡＭＰ ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｍａｌｉ
Ａ： 琼脂糖凝胶电泳检测； Ｂ： ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ 检测； Ｃ： ＬＦＤ 试纸检测； Ｍ： ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００； １： 苹果根结线虫；
２： 阴性对照。 Ａ： Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ； Ｂ： ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ； Ｃ： ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ
ｂｙ ＬＦＤ ｔｅｓｔ； Ｍ： ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００； １： Ｍ． ｍａｌｉ； ２： ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ．
　
进行 ＬＡＭＰ 反应的特异性检测结果显示，加入
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ 染料后，只有苹果根结线虫 ＬＡＭＰ 反
应产物呈现绿色，其它线虫的反应产物都呈现橘黄
色（图 ３⁃Ａ）；凝胶电泳同样显示只有苹果根结线虫
呈现出清晰的梯形条带（图 ３⁃Ｂ）。 所有线虫的 ＤＮＡ
模板在 ２８Ｓ ｒＤＮＡ区均能成功扩增（图 ３⁃Ｃ），表明本
研究设计的苹果根结线虫 ＬＡＭＰ引物具有很好的特
异性。
２􀆰 ４ 苹果根结线虫 ＬＡＭＰ反应的灵敏度
将初始浓度为 １ ／ ２０ 单条幼虫 ＤＮＡ 的模板按
１０ 倍梯度稀释后进行 ＬＡＭＰ 反应，扩增产物用
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ 染色，稀释 １ ０００ 倍时反应产物仍能
呈现绿色（图 ４⁃Ａ），凝胶电泳检测也可以看到梯形
条带（图 ４⁃Ｂ），稀释 １０ ０００ 倍后则没有检测到产
物，表明该 ＬＡＭＰ体系的检测下限为 １ ／ ２０ ０００ 单条
幼虫 ＤＮＡ。 用苹果根结线虫特异性引物进行常规
ＰＣＲ扩增的结果显示，当模板 ＤＮＡ 稀释 １００ 倍时，
可看到微弱的条带，继续稀释则不能检测（图 ４⁃Ｃ）。
表明本研究建立的 ＬＡＭＰ 检测体系要比常规 ＰＣＲ
检测的灵敏度至少高 １０ 倍。
３ 讨论
形态学特征是根结线虫种类鉴定的重要依据，
但形态学鉴定不仅要求有足够数量的样本，而且需
要收集不同龄期的线虫，如果样品中仅有几条甚至
一条幼虫，其种类是难以鉴定的。 苹果根结线虫的
形态测计值与榆根结线虫 Ｍ． ｕｌｍｉ 很接近，而其会
阴花纹与花生根结线虫及阿登根结线虫 Ｍ． ａｒ⁃
ｄｅｎｅｎｓｉｓ较相似（顾建锋等，２０１３ａ），因此依据形态
图 ３ 苹果根结线虫环介导等温扩增（ＬＡＭＰ）反应
的特异性检测
Ｆｉｇ． ３ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＬＡＭＰ ａｓｓａｙ ｆｏｒ
Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｍａｌｉ
Ａ： ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ 染色； Ｂ： 琼脂糖凝胶电泳； Ｃ：
２８Ｓ ｒＤＮＡ 区检测； １ ～ １０： 苹果根结线虫、南方根结线
虫、爪哇根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫、象耳
豆根结线虫、西班牙根结线虫、水稻干尖线虫、松材线虫
和燕麦真滑刃线虫； １１： 阴性对照； Ｍ： ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ
ＤＬ２０００。 Ａ： ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｄｙｉｎｇ； Ｂ： ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏ⁃
ｐｈｏｒｅｓｉｓ； Ｃ： ２８Ｓ ｒＤＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏ⁃
ｒｅｓｉｓ； １ － １０： Ｍ． ｍａｌｉ， Ｍ． ｉｎｃｏｇｎｉｔａ， Ｍ． ｊａｖａｎｉｃａ， Ｍ．
ａｒｅｎａｒｉａ， Ｍ． ｈａｐｌａ， Ｍ． ｅｎｔｅｒｏｌｏｂｉｉ， Ｍ． ｈｉｓｐａｎｉｃａ， Ａ． ｂｅｓ⁃
ｓｅｙｉ， Ｂ． ｘｙｌｏｐｈｉｌｕｓ ａｎｄ Ａ． ａｖｅｎａｅ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ； １１： ｎｅｇａ⁃
ｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ； Ｍ： ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００．
　
特征准确区分这些线虫种类比较困难。 顾建锋等
（２０１３ｂ）以苹果根结线虫 ｒＤＮＡ⁃ＩＴＳ 区序列为靶标
设计种特异性 ＰＣＲ引物，成功建立了该线虫的分子
４６２ 植　 物　 保　 护　 学　 报 ４３ 卷
图 ４ 苹果根结线虫环介导等温扩增（ＬＡＭＰ）和
特异性 ＰＣＲ引物检测的灵敏度比较
Ｆｉｇ． ４ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｒｏｍ ＬＡＭＰ ａｓｓａｙ
ａｎｄ ｓｐｅｃｉｅｓ⁃ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒ ＰＣＲ ｆｏｒ Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ ｍａｌｉ
Ａ： ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ染色 ＬＡＭＰ反应产物； Ｂ： 琼脂糖
凝胶电泳检测 ＬＡＭＰ 反应产物； Ｃ： 琼脂糖凝胶电泳检
测种特异性引物 ＰＣＲ 扩增产物； １ ～ ７： １ ／ ２０、１ ／ ２０ ×
１０ － １、１ ／ ２０ × １０ － ２、１ ／ ２０ × １０ － ３、１ ／ ２０ × １０ － ４、１ ／ ２０ × １０ － ５
和 １ ／ ２０ × １０ － ６单条线虫； ８： 阴性对照； Ｍ： ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ
ＤＬ２０００。 Ａ： ＬＡＭＰ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉ ｄｙ⁃
ｉｎｇ； Ｂ： ＬＡＭＰ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏ⁃
ｒｅｓｉｓ； Ｃ： ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｂｙ ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍ⁃
ｅｒｓ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ； １ － ７： １ ／ ２０，
１ ／ ２０ × １０ － １， １ ／ ２０ × １０ － ２， １ ／ ２０ × １０ － ３， １ ／ ２０ × １０ － ４，
１ ／ ２０ × １０ － ５ ａｎｄ １ ／ ２０ × １０ － ６ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｎｅｍａｔｏｄｅ； ８： ｎｅｇ⁃
ａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｗｉｔｈｏｕｔ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ ｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ； Ｍ： ＤＮＡ
ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００．
　
检测技术，提高了鉴定效率和准确率。 由于根结线
虫属核糖体 ２８Ｓ区核酸序列种间变异比 ＩＴＳ 区明显
（林宇等，２０１３），且序列比对显示苹果根结线虫 ２８Ｓ
区序列与已报道的其它根结线虫种间变异相对较
大，因此本研究针对 ｒＤＮＡ⁃２８Ｓ 区序列设计苹果根
结线虫 ＬＡＭＰ 引物，能够有效降低 ＬＡＭＰ 引物在其
它根结线虫中产生非特异性扩增的概率。 此外，针
对 ２８Ｓ区 ７ 个非保守位点设计 ６ 条引物，进一步提
高了扩增的特异性，且与常规 ＰＣＲ 相比，ＬＡＭＰ 检
测体系有着更高的灵敏度，能够检测到 １ ／ ２０ ０００ 单
条苹果根结线虫幼虫，是前者的 １０ 倍以上，因此只
需要极少量的样本即能完成检测。
目前我国已建立了南方根结线虫（Ｎｉｕ ｅｔ ａｌ． ，
２０１１）和象耳豆根结线虫（Ｎｉｕ ｅｔ ａｌ． ，２０１２；何旭峰
等，２０１３）的 ＬＡＭＰ检测体系，并已在根结线虫病害
的快速检测中得到应用，而 ＬＡＭＰ 技术应用于根结
线虫非中国种的检测研究尚无相关报道。 本研究建
立的苹果根结线虫 ＬＡＭＰ 快速检测体系，在 ６５℃恒
温条件下，最快 ３０ ｍｉｎ 即可检测到靶标，且检测过
程中不需要任何专业设备，常规的水浴锅甚至暖水
瓶即可完成，利用反应过程中产生的沉淀，通过应用
荧光染料或者 ＬＦＤ试纸后颜色的变化，仅凭肉眼就
能判定结果，无需接触紫外光和 ＥＢ 等有毒试剂，具
有操作简单、经济高效、安全无毒等特性，能有效提
高我国口岸进境苗木检疫过程中对苹果根结线虫的
检测效率，在进出口高通量货物的植物检疫中具有
广泛的应用前景，对于控制该有害生物传入我国具
有重要意义。
甜菜碱可提高反应的扩增效率（Ｎｏｔｏｍｉ ｅｔ ａｌ． ，
２０００），而在本研究中，甜菜碱的有无对于 ＬＡＭＰ 扩
增效果无明显影响，反而添加到一定浓度后会抑制
扩增反应，这与扩增区域 ＧＣ 含量较低有关。 此外
值得注意的是，由于 ＬＡＭＰ 技术具有扩增效率高以
及扩增产物又是循环扩增模板的特性，因此 ＬＡＭＰ
反应产物在检测过程中易受到操作环境及试剂污染
的影响而导致后续试验出现假阳性，因此需要规范
操作流程，在反应体系配制完成后可用石蜡油覆盖
密封，避免因污染而影响到检测结果的准确性。
参 考 文 献 （Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）
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（责任编辑：李美娟）
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