全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４３(６): ５７４￣５８０(２０１３)
收稿日期: ２０１２￣１２￣１７ꎻ 修回日期: ２０１３￣０８￣０２
基金项目: 农业部公益性行业(农业)科研专项(２００９０３０３４)ꎻ 福建省农业科学院科技创新团队建设基金(ＳＴＩＦ￣Ｙ０７)ꎻ 福建省农业科学院
博士科研启动基金(２０１２ＤＢＳ￣２)ꎻ 福建省农业科学院科技重大专项(ＺＤＺＸ￣１３０２)
通讯作者: 陈庆河ꎬ研究员ꎬ主要从事植物病理及分子生物学研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｃｈｅｎｑｈ＠ ｆａａｓ.ｃｎ
第一作者: 吴敏亮ꎬ男ꎬ漳州诏安人ꎬ在读研究生ꎬ主要从事植物病理及分子生物学研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｗｍｌ.２０１０＠１６３.ｃｏｍꎮ
番石榴焦腐病菌 ＬＡＭＰ检测方法的建立及应用
吴敏亮１ꎬ 张溢溪２ꎬ 兰成忠２ꎬ 刘裴清２ꎬ 李本金２ꎬ 陈庆河１ꎬ２∗ꎬ 翁启勇２
( １福建农林大学植物保护学院ꎬ 福州 ３５０００２ꎻ ２ 福建省农业科学院植物保护研究所ꎬ 福州 ３５００１３)
摘要:以钙黄绿素(ｃａｌｃｅｉｎ)为指示剂ꎬ建立了番石榴焦腐病菌(Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｒｈｏｄｉｎａ)的环介导等温扩增(Ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ
ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬ ＬＡＭＰ)可视化快速检测方法ꎮ 在该方法中ꎬ以番石榴焦腐病菌特异的核糖体转录间隔区( Ｉｎｔｅｒｎａｌ
ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒꎬ ＩＴＳ)序列为目的 ＤＮＡ片段ꎬ设计 ４条引物(２条内引物、２条外引物)ꎬ优化 ＬＡＭＰ反应条件和反应体系ꎬ
并进行特异性和灵敏度验证ꎮ 研究确定最佳反应温度为 ６４℃ꎬ反应时间 １ ｈꎻ特异性检测结果显示ꎬ１５ 株不同地理来源的
番石榴焦腐病菌和 １０份番石榴焦腐病病果组织 ＬＡＭＰ产物均为阳性(绿色)ꎬ而 ２６株其它病原菌及 １０份健康番石榴果实
组织 ＬＡＭＰ产物均为阴性(橘黄色)ꎻ灵敏度验证结果显示ꎬ该方法的检测灵敏度在 ＤＮＡ 水平上可达到 １０ ｐｇꎮ 实验结果
表明ꎬ快速、准确、灵敏的 ＬＡＭＰ检测方法适合基层部门及田间检测番石榴焦腐病菌使用ꎮ
关键词:番石榴ꎻ 葡萄座腔菌ꎻ 内转录间隔区ꎻ 环介导等温扩增ꎻ 钙黄绿素
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｒｈｏｄｉｎａ ＷＵ Ｍｉｎ￣ｌｉａｎｇ１ꎬ ＺＨＡＮＧ Ｙｉ￣ｘｉ２ꎬ ＬＡＮ Ｃｈｅｎｇ￣ｚｈｏｎｇ２ꎬ ＬＩＵ Ｐｅｉ￣ｑｉｎｇ２ꎬ ＬＩ
Ｂｅｎ￣ｊｉｎ２ꎬ ＣＨＥＮ Ｑｉｎｇ￣ｈｅ１ꎬ２ꎬ ＷＥＮＧ Ｑｉ￣ｙｏｎｇ２ ( １ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ ＰｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬＦｕｊｉａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉ￣
ｔｙꎬＦｕｚｈｏｕ ３５０００２ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ｆｕｊｉａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｆｕｚｈｏｕ ３５００１３ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ａ ｖｉｓｕａｌ ＬＡＭＰ (Ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ) ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｒｈｏｄｉｎａ ｗａｓ
ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｗｉｔｈ ｃａｌｃｅｉｎ ａｓ ａ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ. Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ＩＴＳ (Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ)
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｂ. ｒｈｏｄｉｎａꎬ ａ ｓｅｔ ｏｆ ｆｏｕｒ ＬＡＭＰ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ. Ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ａｎｄ
ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＬＡＭＰ ｗｅｒｅ ａｓｓａｙｅｄ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ６４℃
ｆｏｒ １ ｈ ｗａｓ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ＬＡＭＰ. Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ
１５ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｂ. ｒｈｏｄｉｎａ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ａｎｄ １０ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａ ｆｒｕｉｔｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂｙ Ｂ.
ｒｈｏｄｉｎａ ｗｅｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅꎬ ａｎｄ ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ２６ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ａｎｄ １０ ｈｅａｌｔｈｙ ｆｒｕｉｔｓ ｗｅｒｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ. Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ
ｏｆ ＬＡＭＰ ｗａｓ １０ ｐｇ ｐｕｒｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｐｅｒ ２５ μＬ ｒｅａｃｔｉｏｎ. Ｔｈｅ ＬＡＭＰ ａｓｓａｙ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｗａｓ ｓｉｍ￣
ｐｌｅꎬ ｆａｓｔꎬ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃꎬ ａｎｄ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ Ｂ. ｒｈｏｄｉｎａ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｅｌｄ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａꎻ Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｒｈｏｄｉｎａꎻ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒꎻ ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎꎻ ｃａｌｃｅｉｎ
中图分类号: Ｓ４３６ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１３)０６￣０５７４￣０７
番石榴(Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａ Ｌ.)焦腐病是由葡萄
座腔菌 Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｒｈｏｄｉｎａ (Ｃｋｅ.) Ｖ.Ａ ｒｘ (无
性世代 Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａ ｔｈｅｏｂｒｏｍａｅ ( Ｐａｔ.) Ｇｒｉｆｆ.
Ｍａｕｂｌ)引起ꎬ严重影响番石榴生产的主要真菌病
害[１ꎬ２]ꎮ 除了危害番石榴外ꎬ该病害的病原菌还可
以造成橙、芒果、杨桃、黄皮、番茄、梨、木瓜[３]及龙
眼[４]等热带亚热带水果果实的腐烂ꎬ甚至造成莲
雾、木瓜、荔枝、芒果[３]及柑橘[５]等植株的死亡ꎮ
６期 吴敏亮ꎬ等:番石榴焦腐病菌 ＬＡＭＰ检测方法的建立及应用
目前番石榴焦腐病在世界各番石榴主产区均有出
现ꎬ而我国广东、广西、福建、台湾和海南等省发生
较为严重[６]ꎮ 建立快速、准确检测番石榴焦腐病
菌的方法ꎬ对于及时有效地控制该病害有重要的意
义ꎮ
Ｇａｏ 等[６] 基于不同病原菌间 ＩＴＳ ( Ｉｎｔｅｒｎａｌ
ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ)序列的差异ꎬ建立了检测番石榴
焦腐病菌的普通 ＰＣＲ 和巢式 ＰＣＲ 方法ꎮ 但由于
目前 ＰＣＲ检测技术仍然需要 ＰＣＲ 仪、电泳和凝胶
成像系统等昂贵的专业仪器和分子生物学试剂ꎬ以
及分子生物学专业实验人员操作ꎬ限制了该检测方
法的推广应用ꎮ 因此ꎬ建立一套简便、快速、准确、
适用的番石榴焦腐病菌检测方法十分迫切ꎮ
环介导等温扩增技术(Ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｓｏｔｈｅｒ￣
ｍａｌ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬＬＡＭＰ)具有简单、快速、高效、经
济等特征[７]ꎮ 该技术可在 ６０℃ ~ ６５℃恒温条件
下ꎬ利用高活性的链置换 ＤＮＡ 聚合酶 (Ｂｓｔ ＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ)对目的 ＤＮＡ片段进行特异性扩增[８]ꎮ
在 １ 个小时内ꎬ能够将少量拷贝数的目的基因扩
增至 １０９ 个拷贝数[８] ꎮ ＬＡＭＰ反应产物不仅可以
通过浊度仪、ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ 仪及凝胶电泳仪进行
检测ꎬ而且还可以通过 ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮⅠ、钙黄绿
素[９] 、羟基萘酚蓝[１０]染色后ꎬ肉眼识别ꎮ 为此ꎬ本
研究建立了以镁离子￣钙黄绿素为指示剂的
ＬＡＭＰ检测技术用于番石榴焦腐病菌的快速检
测ꎬ该技术适合于基层部门对番石榴焦腐病菌的
田间检测ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 病原菌的分离鉴定及菌株来源
番石榴焦腐病菌分离鉴定、培养及保存均按照
Ｇａｏ等[６]方法进行ꎬ１２ 份疑似番石榴焦腐病病症
的病果和 １０份健康番石榴果实均采自福建省农业
科学院果树研究所实验农场ꎮ 本研究供试菌株
(表 １)均保存在本实验室ꎮ
Ｔａｂｌｅ １ Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｒｈｏｄｉｎａ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｓｐｅｃｉｅ Ｈｏｓｔ Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅ Ｓｏｕｒｃｅ
Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｒｈｏｄｉｎａ Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａ １５ Ｆｕｊｉａｎ
Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ Ｐｓｉｄｉｕｍ ｇｕａｊａｖａ １ Ｆｕｊｉａｎ
Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ. ２ Ｆｕｊｉａｎ
Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉ Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｔ Ｌ. ２ Ｆｕｊｉａｎ
Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｏｊａｅ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ Ｌ. ３ Ｆｕｊｉａｎ
Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ Ｐｙｒｕｓ ｓｐｐ. １ Ｆｕｊｉａｎ
Ｒｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ Ｌ. １ Ｇｕａｎｄｏｎｇ
Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ Ｌ. １ Ｆｕｊｉａｎ
Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ Ｌ. １ Ｆｕｊｉａｎ
Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ. １ Ｆｕｊｉａｎ
Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ Ｓｏｌａｎｕｍ ｍｅｌｏｎｇｅｎａ Ｌ. １ Ｆｕｊｉａｎ
Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ Ｄｉｍｏｃａｒｐｕｓ ｌｏｎｇａｎ Ｌｏｕｒ. １ Ｆｕｊｉａｎ
Ｇｌｏｅｏｓｐｒｉｕｍ ｐｉｐｅｒａｔｕｍ Ｃａｐｓｉｃｕｍ ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｔ Ｌ. １ Ｆｕｊｉａｎ
Ａｓｃｏｃｈｙｔａ ｌｏｎｇａｎ Ｄｉｍｏｃａｒｐｕｓ ｌｏｎｇａｎ Ｌｏｕｒ. １ Ｆｕｊｉａｎ
Ｍｅｌａｎｃｏｎｉｕｍ ｏｂｌｏｎｇｕｍ Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ Ｌ. １ Ｆｕｊｉａｎ
Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ ｍａｙｄｉｓ Ｚｅａ ｍａｙｓ Ｌ. １ Ｆｕｊｉａｎ
Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｋｉｋｕｃｈｉａｎａ Ｐｙｒｕｓ ｐｙｒｉｆｏｌｉａ １ Ｆｕｊｉａｎ
Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ １ Ｆｕｊｉａｎ
Ｐｈｙｓａｌｏｓｐｏｒａ ｐｉｒｉｃｏｌａ Ｍａｌｕｓ ｐｕｍｉｌａ １ Ｆｕｊｉａｎ
Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ ｐａｕｃｉｓｅｔａ Ｄｉｍｏｃａｒｐｕｓ ｌｏｎｇｇａｎａ Ｌｏｕｒ. １ Ｆｕｊｉａｎ
Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ １ Ｆｕｊｉａｎ
Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ Ｓｏｌａｎｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ Ｌ. １ Ｆｕｊｉａｎ
Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｌｔｉｍｕｍ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ Ｌ. １ Ｚｈｅｊｉａｎｇ
５７５
植物病理学报 ４３卷
１ .２ 菌丝体的培养、收集及基因组ＤＮＡ的提取
供试菌分别进行液体培养ꎬ收集菌丝ꎬ冷冻干
燥后备用ꎬ具体方法参见文献[１１]ꎮ 疫霉菌用利
马豆培养液培养[１２]ꎬ其它供试真菌用马铃薯葡萄
糖培养液培养[１１]ꎮ 病原菌总 ＤＮＡ 的提取采用
ＤＮＡ提取试剂盒[天根生物科技(北京)有限公
司]ꎮ 病、健果组织 ＤＮＡ 提取参照 ＮａＯＨ 快速裂
解法[１３]ꎮ 提取的 ＤＮＡ保存在－２０℃冰箱中备用ꎮ
１ .３ 病原菌ＩＴＳ序列的扩增及ＬＡＭＰ引物的设计
参照 Ｇａｏ等[６]的方法对番石榴焦腐病菌 ＩＴＳ
序列进行扩增、克隆、测序ꎬ获得的番石榴焦腐病菌
ＩＴＳ序列ꎬ应用在线 ＬＡＭＰ 引物设计软件 ｐｒｉｍｅｒ
ｓｏｆｔｗａｒｅ ＰｒｉｍｅｒＥｘｐｌｏｒｅｒ Ｖ４ (ｈｔｔｐ: / / ｐｒｉｍｅｒｅｘｐｌｏｒｅｒ.
ｊｐ / ｅｌａｍｐ４.０.０ / ｉｎｄｅｘ.ｈｔｍｌꎻ Ｅｉｋｅｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ.ꎬ Ｊａ￣
ｐａｎ)进行 ＬＡＭＰ引物设计(如图 １ꎬ表 ２)ꎮ
Ｆｉｇ. １ Ｔｈｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＬＡＭＰ ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
(Ａ) Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＬＡＭＰ ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ. Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｎｅｒ ｐｒｉｍｅｒｓ ＦＩＰ ａｎｄ ＢＩＰ
ａｒｅ ｓｈｏｗｎ. Ｆ１ｃ ａｎｄ Ｂ１ｃ ａｒｅ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｔｏ Ｆ１ ａｎｄ Ｂ１ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. (Ｂ) Ｐａｒｔｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ
ｒｈｏｄｉｎａ ａｎｄ ｔｈｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ＬＡＭＰ ｐｒｉｍｅｒｓ (Ｆ３ꎬ Ｂ３ꎬ ＦＩＰ [Ｆ１ｃ￣Ｆ２]ꎬ ａｎｄ ＢＩＰ [Ｂ１ｃ￣Ｂ２]) .
Ａｒｒｏｗｓ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈｅ ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ.
Ｔａｂｌｅ ２ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＬＡＭＰ ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＬＡＭＰ ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′－３′)
Ｆ３ ＴＧＣＣＴＧＴＴＣＧＡＧＣＧＴＣＡＴ
Ｂ３ ＴＣＣＧＡＧＧＴＣＡＡＣＣＴＴＧＡＧＡＡ
ＦＩＰ ＣＡＣＣＧＣＣＧＡＧＧＴＣＴＴＴＧＡＧＧ￣ＴＡＣＡＡＣＣＣＴＣＡＡＧＣＴＣＴＧＣＴ
ＢＩＰ ＧＣＴＧＴＴＣＡＧＣＣＣＴＣＡＡＧＣＧＴ￣ＧＴＴＣＡＧＡＡＧＧＴＴＣＧＴＣＣＧＧ
６７５
６期 吴敏亮ꎬ等:番石榴焦腐病菌 ＬＡＭＰ检测方法的建立及应用
１.４ ＬＡＭＰ反应体系的建立
在 ６０℃ ~６５℃范围内对反应温度进行梯度实
验ꎬ反应时间 １ ｈꎬ以确定 ＬＡＭＰ 引物的最佳反应
温度ꎮ 并对 ＬＡＭＰ反应体系成分按以下范围进行
优化ꎬ甜菜碱 (Ｓｉｇｍａ公司) (０.０ ~ １.２ ｍｏｌ / Ｌ)ꎬ硫
酸镁 (Ｓｉｇｍａ公司) (２~ １６ ｍｍｏｌ / Ｌ)ꎬＢｓｔ ＤＮＡ 聚
合酶 (Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ 公司) (１ ~ １２ Ｕ)ꎬ
ｄＮＴＰｓ ( Ｐｒｏｍｅｇａ 公司) (０.４ ~ １.４ ｍｍｏｌ / Ｌ)ꎮ 用
含 ０.５ μｇ / ｍＬ ＥＢ(Ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ)的 ２.０％琼脂
糖凝胶电泳检测扩增结果ꎬ条带最亮的为最佳使用
浓度ꎮ 本实验选用 ５０ μｍｏｌ / Ｌ 钙黄绿素 － ５００
μｍｏｌ / Ｌ氯化锰(Ｓｉｇｍａ 公司) [１４]搭配作为指示剂
浓度ꎬ阳性反应为绿色ꎬ阴性反应为橘黄色ꎮ
１.５ 特异性及灵敏度检测
根据已优化的反应体系对所有供试菌株进行
特异性检测ꎬ用紫外分光光度计(ＮＤ２０００Ｃꎬ Ｔｈｅｒ￣
ｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 公司)将其浓度调为 １００ ｎｇ / μＬꎬ并按
１０ 倍梯度(１０－１ ~ １０－７) 稀释为 １０ ｎｇ / μＬ、１ ｎｇ /
μＬ、１００ ｐｇ / μＬ、１０ ｐｇ / μＬ、１ ｐｇ / μＬ、１００ ｆｇ / μＬ、
１０ ｆｇ / μＬꎬ用于 ＬＡＭＰ 检测体系灵敏度验证ꎬ无菌
水作为空白对照ꎮ 检测结果可直接用肉眼观察ꎬ绿
色为阳性ꎬ橘黄色为阴性ꎻ也可用含 ０.５ μｇ / ｍＬ ＥＢ
的 ２.０％琼脂糖凝胶电泳检测ꎮ
２ 结果与分析
２.１ ＬＡＭＰ反应体系的建立
通过对反应温度进行优化ꎬ确定 ＬＡＭＰ 引物
最佳反应温度为 ６４℃ꎮ 最终优化后用于检测番石
榴焦腐病菌的 ＬＡＭＰ最佳反应体系(２５ μＬ)为:１×
Ｔｈｅｒｍｏｌｐｏｌꎬ甜菜碱 ０.８ ｍｏｌ / Ｌꎬ硫酸镁 ８.０ ｍｍｏｌ /
ＬꎬＢｓｔ ＮＤＡ聚合酶为 ６ ＵꎬｄＮＴＰｓ １.０ ｍｍｏｌ / ＬꎬＦＩＰ
和 ＢＩＰ各 １.６ ｍｍｏｌ / ＬꎬＦ３和 Ｂ３为 ０.２ ｍｍｏｌ / Ｌꎬ模
板 ＤＮＡ ２. ０μＬ ( ５０ ~ １００ ｎｇ / μＬ)ꎬ钙黄绿素 ５０
μｍｏｌ / Ｌꎬ氯化锰 ５００ μｍｏｌ / Ｌꎬ无菌水补至 ２５ μＬꎮ
反应程序为:６４℃ １ ｈꎬ８５℃ １０ ｍｉｎꎮ 反应效果如
图 ２所示ꎮ
２.２ 特异性检测
在钙黄绿素指示剂的作用下ꎬ１５ 个不同地理
来源的番石榴焦腐病菌 ＬＡＭＰ 检测均显示绿色ꎬ
而阴性对照和其它 ２６ 个病原菌 ＬＡＭＰ 检测均显
示橘黄色ꎬ如[图 ３(Ｂ)]ꎮ 用含 ０.５ μｇ / ｍＬ ＥＢ 的
２ ０％琼脂糖凝胶电泳检测结果显示ꎬ番石榴焦腐
病菌 ＬＡＭＰ扩增产物均出现梯度条带ꎬ阴性对照
和其它 ２６个病原菌则没有出现任何条带ꎬ如[图 ３
(Ａ)]ꎮ 结果表明ꎬ该 ＬＡＭＰ 引物能够特异性的检
测不同地理来源的番石榴焦腐病菌ꎮ
Ｆｉｇ. ２ Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｒｈｏｄｉｎａ ｂｙ ＬＡＭＰ
(Ａ) Ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＬＡＭＰ ｆｏｒ Ｂ. ｒｈｏｄｉｎａ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ２.０％ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ. (Ｂ) Ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＬＡＭＰ
ｆｏｒ Ｂ. ｒｈｏｄｉｎａ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｃａｌｃｅｉｎ. Ｌａｎｅ １: Ｂ. ｒｈｏｄｉｎａꎻ Ｌａｎｅ ２: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ Ｌａｎｅ Ｍ: ＤＬ２ ０００ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ.
７７５
植物病理学报 ４３卷
Ｆｉｇ. ３ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＬＡＭＰ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｒｈｏｄｉｎａ ｓｔｒａｉｎｓ
Ｍ: ＤＬ２ ０００ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ Ｌａｎｅ ２￣７: Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｒｈｏｄｉｎａꎻ
Ｌａｎｅ ８: Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓꎻ ｌａｎｅ ９: Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ ｐａｕｃｉｓｅｔａꎻ ｌａｎｅ １０: Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｃａｐｓｉｃｉꎻ
Ｌａｎｅ １１: Ｐｙｔｈｉｕｍ ｕｌｔｉｍｕｍꎻ Ｌａｎｅ １２: Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍꎻ Ｌａｎｅ １３: Ｒｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ ꎻ (Ａ) Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ
(２.０％) ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｌｏｏｐ￣ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｂ. ｒｈｏｄｉｎａ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ.
Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｓｅｅｎ ａｓ ａ ｌａｄｄｅｒ￣ｌｉｋｅ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｎ ２.０％ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎａｌｙｓｉｓ.
(Ｂ) Ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＬＡＭＰ ｆｏｒ Ｂ. ｒｈｏｄｉｎａ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｃａｌｃｅｉｎ. Ｔｈｅ ｇｒｅｅｎ ｃｏｌｏｕｒ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｎａｋｅｄ ｅｙｅ
ｉｎ ｔｈｅ ｔｕｂｅｓ ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ Ｂ. ｒｈｏｄｉｎａ ｗｈｅｒｅａｓ ｔｈｅ ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｒｅｍａｉｎｅｄ ｏｒａｎｇｅ ａｆｔｅｒ ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ.
２.３ 灵敏度验证
采用 １０倍浓度系列稀释法将提取的番石榴焦
腐病菌 ＤＮＡ进行梯度稀释ꎬ并各取 １ μｌ不同浓度
的 ＤＮＡ用于 ＬＡＭＰ反应ꎮ 在以 １０ ｐｇ ＤＮＡ 为模
板时ꎬ反应产物仍然可显示淡绿色[图 ４(Ｂ)]ꎬ说
明该 ＬＡＭＰ反应体系可以检测到 １０ ｐｇ 的番石榴
焦腐病菌 ＤＮＡꎮ 取 ２.５ μＬ ＬＡＭＰ 产物用于 ２.０％
琼脂糖凝胶电泳检测ꎬ结果显示从 １００ ｎｇ ~ １０ ｐｇ
的模板 ＤＮＡ 都可以出现 ＬＡＭＰ 产物特有的梯度
条带[图 ４(Ａ)]ꎮ
２.４ 病果的检测
各取 １ μＬ被番石榴焦腐病菌感染的病果组织
和健康番石榴果实组织 ＤＮＡ 用于 ＬＡＭＰ 检测ꎮ
检测结果显示ꎬ阳性对照及带番石榴焦腐病菌的病
果组织 ＤＮＡ的 ＬＡＭＰ反应产物均显示绿色ꎬ电泳
条带为 ＬＡＭＰ 特有梯度条带ꎬ而阴性对照和健康
果实组织 ＤＮＡ的 ＬＡＭＰ反应产物均显示橘黄色ꎬ
电泳检测未出现任何条带ꎮ 这与供试的果实病斑
常规分离培养和显微镜形态观察验证结果一致ꎮ
实验结果再次证明的了这组 ＬＡＭＰ 引物具有很强
的特异性ꎮ
３ 讨论
本研究基于在真菌中存在较多位点差异的
ＩＴＳ序列[１５]设计了一组用于特异性检测番石榴焦
腐病菌的 ＬＡＭＰ引物ꎬ并对反应条件和甜菜碱、硫
酸镁、ｄＮＴＰｓ、Ｂｓｔ ＤＮＡ 聚合酶等试剂的使用浓度
进行了优化ꎬ最终建立了番石榴焦腐病菌 ＬＡＭＰ
检测方法ꎮ 从 ＬＡＭＰ 反应效果图可以看出ꎬ此体
系在 １ ｈ的反应时间里就能够有效地检测到目的
ＤＮＡ片段ꎬ而 ＰＣＲ 检测通常需要花费 ２ ~ ３ 个小
时ꎮ 对 １５个不同来源的番石榴焦腐病菌及 １０ 份
被番石榴焦腐病菌感染果实组织的ＤＮＡ检查结
８７５
６期 吴敏亮ꎬ等:番石榴焦腐病菌 ＬＡＭＰ检测方法的建立及应用
Ｆｉｇ. ４ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＬＡＭＰ ａｓｓａｙ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｓｅｒｉａｌｌｙ ｄｉｌｕｔｅｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
( ｆｒｏｍ １００ ｎｇ ｔｏ １０ ｆｇ) ｗｉｔｈ Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ ｒｈｏｄｉｎａ ｉｓｏｌａｔｅ Ｂｒ１３ ａｓ ｔｅｍｐｌａｔｅ
(Ａ) ＬＡＭＰ ａｓｓａｙ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ２.０％ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ. (Ｂ) Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＬＡＭＰ ｍｅｔｈｏｄ ｂｙ ｃａｌｃｅｉｎ.
Ｌａｎｅ Ｍ: ＤＬ２ ０００ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ Ｌａｎｅ １￣８: Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｕｓｉｎｇ ＤＮＡ ａｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ １００ ｎｇꎬ
１０ ｎｇꎬ １ ｎｇꎬ １００ ｐｇꎬ １０ ｐｇꎬ １ ｐｇꎬ １００ ｆｇꎬ １０ ｆｇ ｉｎ ａ ２５ μＬ ＬＡＭＰ ｒｅａｃｔｉｏｎ.
果都为阳性ꎬ而其它 ２６个常见病原菌及 １０份健康
果实组织的 ＤＮＡ 检测结果为阴性ꎬ说明这组
ＬＡＭＰ引物具有很强的特异性ꎮ 而此 ＬＡＭＰ 方法
的灵敏度验证实验结果显示ꎬ其检测极限达到 １０
ｐｇ的目的基因组 ＤＮＡꎬ比本实验室 Ｇａｏ 等[６]开发
的用普通 ＰＣＲ检测番石榴焦腐病菌的灵敏度高了
１ ０００倍ꎬ但比巢式 ＰＣＲ检测灵敏度低一些ꎮ
钙黄绿素的显色效果与其使用浓度成正比ꎬ但
是浓度太高时会使 ＬＡＭＰ 反应速度变慢[１４]ꎮ 为
了满足肉眼观察结果及不影响 ＬＡＭＰ 反应速率的
要求ꎬ最终选择 ５０ μｍｏｌ / Ｌ 钙黄绿素－５００ μｍｏｌ / Ｌ
氯化锰搭配[１４]作为指示剂浓度ꎮ 钙黄绿素指示剂
的使用ꎬ不仅使得我们可以直接通过肉眼识别
ＬＡＭＰ 检测结果ꎬ不需依赖如浊度仪、 ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ
ＰＣＲ仪、及电泳仪等设备ꎬ而且钙黄绿素可以在
ＬＡＭＰ反应前加入到反应液中ꎬ可以有效避免反应
后开盖加入 ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮⅠ造成的污染问题[７]ꎮ
总之ꎬ相对 ＰＣＲ检测而言ꎬ本研究在基于番石
榴焦腐病菌 ＩＴＳ 特异序列基础上建立的番石榴焦
腐病菌可视化 ＬＡＭＰ检测方法具有快速、准确、灵
敏、简便等优点ꎬ更适合在基层部门及设备简陋的
实验室使用ꎮ
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责任编辑:张宗英
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