全 文 ：温州蜜柑萎缩病毒实时荧光 砸栽鄄孕悦砸检测
阅藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 杂葬贼泽怎皂葬 凿憎葬则枣 增蚤则怎泽 遭赠 则藻葬造鄄贼蚤皂藻 砸栽鄄孕悦砸
刘科宏摇 宋摇 震摇 李中安摇 周常勇鄢
渊西南大学柑桔研究所袁 重庆 源园园苑员圆冤
蕴蚤怎 运藻澡燥灶早摇 杂燥灶早 在澡藻灶摇 蕴蚤 在澡燥灶早爷葬灶摇 在澡燥怎 悦澡葬灶早赠燥灶早鄢
渊悦蚤贼则怎泽 砸藻泽藻葬则糟澡 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻袁 杂燥怎贼澡憎藻泽贼 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 悦澡燥灶早择蚤灶早 源园园苑员圆袁 悦澡蚤灶葬冤
摇 摇 温州蜜柑萎缩病毒渊杂葬贼泽怎皂葬 凿憎葬则枣 增蚤则怎泽袁杂阅灾冤
属于温州蜜柑萎缩病毒属 杂葬凿憎葬增蚤则怎泽咱员暂 袁其寄主范
围广袁可侵染几乎所有的柑桔属及其近缘属的植
物咱圆暂 遥 感染 杂阅灾的柑桔树矮化袁叶片为典型的船形
或匙形叶袁并造成果实品质和产量下降咱猿暂 遥 杂阅灾 引
起的温州蜜柑萎缩病最初在日本流行袁圆园 世纪 愿园
年代随引种传入我国袁且随着一些优良品种的推广
而逐步扩散咱源暂 遥 目前对温州蜜柑萎缩病尚无有效
的防治药剂袁种植无病毒苗木和加强病毒检测是防
治该病的有效途径遥 近年来袁实时荧光 砸栽鄄孕悦砸 技
术已广泛应用于植物病毒的检测袁其中 杂再月砸 郧则藻藻灶
玉染料法具有灵敏度高尧信噪比高尧适用范围广和低
价等特点遥 为了满足当前柑桔苗木生产中 杂阅灾 快
速检测的需要袁本研究根据 杂阅灾 的 砸晕粤员 序列设计
了 员 对引物袁建立了 杂阅灾 实时荧光 砸栽鄄孕悦砸 检测
体系遥
员 材料与方法
员援 员 材料
带 杂阅灾尧柑桔碎叶病毒渊悦蚤贼则怎泽 贼葬贼贼藻则 造藻葬枣 增蚤则怎泽袁
悦栽蕴灾冤尧柑桔衰退病毒渊悦蚤贼则怎泽 贼则蚤泽贼藻扎葬 增蚤则怎泽袁 悦栽灾冤尧
柑桔裂皮病毒渊悦蚤贼则怎泽 藻曾燥糟燥则贼蚤泽 增蚤则燥蚤凿袁 悦耘灾凿冤尧柑桔
鳞皮病毒渊悦蚤贼则怎泽 责泽燥则燥泽蚤泽 增蚤则怎泽袁 悦孕灾冤的阳性材料和
健康材料均由西南大学柑桔研究所脱毒中心提供遥
栽则蚤扎燥造试剂购自 陨灶增蚤贼则燥早藻灶 公司曰糟阅晕粤 合成试剂购
自 栽燥赠燥遭燥公司曰孕悦砸反应试剂尧杂再月砸 孕则藻皂蚤曾 耘曾 栽葬择
域购自 栽葬运葬砸葬公司遥 引物由华大基因公司合成遥
员援 圆 引物设计与总 砸晕粤的提取
根据郧藻灶月葬灶噪中 杂阅灾的砸晕粤员序列渊粤月园园怨怨缘愿冤
设计 员 对引物袁其扩增片段预期长度为 员员园 遭责袁上游
引物院郧栽郧郧粤郧栽栽郧悦栽栽郧悦栽栽悦栽袁下游引物院悦郧栽悦栽鄄
郧悦栽郧栽栽郧悦栽栽粤郧栽遥 每 缘园 皂早 样品加入 缘园园 滋蕴 栽则鄄
蚤扎燥造袁按说明书介绍的方法提取总 砸晕粤遥
员援 猿 砸栽鄄孕悦砸和实时荧光 砸栽鄄孕悦砸检测体系
糟阅晕粤合成院取 圆 滋蕴 总 砸晕粤袁加入 猿 滋蕴 超纯
水袁怨缘 益解链 猿 皂蚤灶袁冰浴后依次加入 员园 滋皂燥造 辕 蕴 下
游引物 园援 缘 滋蕴尧 缘 伊 孕悦砸 遭怎枣枣藻则 源 滋蕴尧 员园 皂皂燥造 辕 蕴
凿晕栽孕泽 园援 缘 滋蕴尧砸晕葬泽蚤灶 园援 缘 滋蕴尧砸栽葬泽藻 园援 缘 滋蕴尧超纯水
怨 滋蕴遥 反转录条件院源圆 益 猿园 皂蚤灶遥
圆缘 滋蕴 砸栽鄄孕悦砸 反应体系院糟阅晕粤 模板 员 滋蕴尧员园
滋皂燥造 辕 蕴上下游引物各 园援 远 滋蕴尧员园 伊 孕悦砸 遭怎枣枣藻则 圆援 缘
滋蕴尧员园 皂皂燥造 辕 蕴 凿晕栽孕泽 园援 缘 滋蕴尧圆缘 皂皂燥造 辕 蕴 酝早悦造圆 员援 缘滋蕴尧栽葬择酶 园援 猿 滋蕴尧超纯水 员愿 滋蕴遥 反应条件院怨源益 圆
皂蚤灶曰怨源 益 圆园 泽袁缘缘 益 圆园 泽袁苑圆 益 源缘 泽袁源园 个循环曰苑圆
益 员园 皂蚤灶遥
圆缘 滋蕴 实时荧光 砸栽鄄孕悦砸 反应体系院 杂再月砸
孕则藻皂蚤曾 耘曾 栽葬择域员圆援 缘 滋蕴尧员园 滋皂燥造 辕 蕴 上下游引物各
园援 猿 滋蕴尧糟阅晕粤 模板 员 滋蕴尧超纯水 员园援 怨 滋蕴遥 反应条
件院怨缘 益 缘 泽袁远园 益 猿园 泽袁采集荧光信号袁共 源园 个
循环遥
员援 源 体系的特异性和灵敏度检测
取带 杂阅灾尧悦栽蕴灾尧悦栽灾尧悦耘灾凿 和 悦孕灾 样品的总
砸晕粤进行实时荧光 砸栽鄄孕悦砸 扩增袁观察荧光信号的
变化遥
将 杂阅灾样品的 糟阅晕粤 经 员园 倍梯度稀释后作为
模板袁分别进行 砸栽鄄孕悦砸 和实时荧光 砸栽鄄孕悦砸袁比较
两种方法检测下限遥
基金项目院 重庆市自然科学基金渊圆园员园月月员员源怨冤袁中央高校基本科研业务费专项资金渊载阅允运圆园员圆悦园苑愿冤
作者简介院 刘科宏袁女袁员怨苑愿年生袁助理研究员袁研究方向为柑桔病毒袁 耘鄄皂葬蚤造院 造蚤怎噪藻澡燥灶早岳 糟则蚤糟援 糟灶
鄢通讯作者渊粤怎贼澡燥则 枣燥则 糟燥则则藻泽责燥灶凿藻灶糟藻冤袁 耘鄄皂葬蚤造院 扎澡燥怎糟赠岳 糟则蚤糟援 糟灶
收稿日期院 圆园员圆 原 园愿 原 园苑
第 源园 卷摇 第 员 期
圆园员猿 年摇 圆 月
植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报
粤悦栽粤 孕匀再栽韵孕匀再蕴粤悦陨悦粤 杂陨晕陨悦粤
灾燥造援 源园摇 晕燥援 员
云藻遭援 摇 圆园员猿
员援 缘 植物叶片粗提液和印迹浸提液的检测
取感染 杂阅灾 的柑桔叶片 园援 缘 早袁加入磷酸缓冲
液 缘园园滋蕴袁经研磨尧离心后取上清制成植物叶片粗提
液袁进行实时荧光 砸栽鄄孕悦砸检测遥
参照 月藻则贼燥造蚤灶蚤等咱缘暂的方法袁取感染 杂阅灾 的柑桔
叶和茎袁用刀片横切样品茎和叶柄袁随即均匀地压印
于硝酸纤维素膜渊晕悦酝冤上袁干燥后袁剪下 晕悦酝 上 员
糟皂圆 面积的印迹浸泡于 员园园 滋蕴 超纯水中袁取印迹浸
提液进行实时荧光 砸栽鄄孕悦砸检测遥
圆 结果与分析
圆援 员 特异性和灵敏度
带 杂阅灾 的样品有典型的扩增曲线袁且重复性
好袁带 悦栽蕴灾尧悦栽灾尧悦耘灾凿 和 悦孕灾的样品均无扩增曲
线渊图 员冤袁表明该体系可特异检测 杂阅灾遥
图 员 体系的特异性检测
云蚤早援 员 杂责藻糟蚤枣蚤糟蚤贼赠 燥枣 则藻葬造鄄贼蚤皂藻 砸栽鄄孕悦砸
摇 摇 用两种方法扩增 糟阅晕粤梯度稀释模板的结果显
示袁当 糟阅晕粤 模板稀释至 员园 原苑袁砸栽鄄孕悦砸 能检测到
杂阅灾袁而当 糟阅晕粤 模板稀释至 员园 原怨袁实时荧光 砸栽鄄
孕悦砸仍能检测出 杂阅灾袁表明实时荧光 砸栽鄄孕悦砸 灵敏
度比 砸栽鄄孕悦砸高 员园园 倍遥
圆援 圆 叶片粗提液和印迹浸提液的检测
所提取的植物叶片粗提液和印迹浸提液经实时
荧光 砸栽鄄孕悦砸检测袁均有典型的扩增曲线袁健康对照
则无袁说明制备的植物叶片粗提液和印迹浸提液均
可用于进行 杂阅灾的实时荧光 砸栽鄄孕悦砸检测遥
猿 讨论
本研究建立的 杂阅灾 实时荧光 砸栽鄄孕悦砸 体系只
对 杂阅灾进行特异性扩增袁且其灵敏度较 砸栽鄄孕悦砸 高
员园园 倍袁说明该方法可提高检测的灵敏度袁也更适合
检测 杂阅灾含量较低的样品遥 使用植物叶片粗提液
和印迹浸提液检测植物病原物可省去抽提核酸的繁
琐步骤袁将此方法与实时荧光 砸栽鄄孕悦砸 技术相结合
可大大加快检测速度袁且能保证结果的准确性遥 该
方法的建立为 杂阅灾 的研究尧检测尧防治以及无病毒
苗木的生产提供了有力的技术支持遥
参 考 文 献渊砸藻枣藻则藻灶糟藻泽冤
咱员暂 云葬怎择怎藻贼 悦 酝袁 酝葬赠燥 酝 粤袁 酝葬灶蚤造燥枣枣 允袁 藻贼 葬造援 灾蚤则怎泽 贼葬曾燥灶燥皂赠院
灾陨陨陨贼澡 则藻责燥则贼 燥枣 贼澡藻 陨灶贼藻则灶葬贼蚤燥灶葬造 悦燥皂皂蚤贼贼藻藻 燥灶 栽葬曾燥灶燥皂赠 燥枣 灾蚤鄄
则怎泽藻泽援 杂葬灶 阅蚤藻早燥院 耘造泽藻增蚤藻则 粤糟葬凿藻皂蚤糟 孕则藻泽泽袁 圆园园缘
咱圆暂 酝蚤赠葬噪葬憎葬 栽援 杂怎泽糟藻责贼蚤遭蚤造蚤贼赠 燥枣 悦蚤贼则怎泽 泽责责援 葬灶凿 贼澡藻 燥贼澡藻则 则藻造葬贼藻凿
责造葬灶贼泽 贼燥 贼澡藻 泽葬贼泽怎皂葬 凿憎葬则枣 增蚤则怎泽 渊杂阅灾冤援 粤灶灶葬造泽 燥枣 贼澡藻 孕澡赠贼燥鄄
责葬贼澡燥造燥早蚤糟葬造 杂燥糟蚤藻贼赠 燥枣 允葬责葬灶袁 员怨远怨袁 猿缘院 圆圆源 原 圆猿猿
咱猿暂 杂澡蚤皂蚤扎怎 杂袁 云怎躁蚤憎葬则葬 云袁 酝蚤凿燥 匀袁 藻贼 葬造援 悦澡葬灶早藻泽 蚤灶 枣则怎蚤贼 糟澡葬则葬糟鄄
贼藻则 葬灶凿 择怎葬造蚤贼赠 蚤灶 杂葬贼泽怎皂葬 皂葬灶凿葬则蚤灶 蚤灶枣藻糟贼藻凿 憎蚤贼澡 杂葬贼泽怎皂葬 凿憎葬则枣
增蚤则怎泽援 孕则燥糟藻藻凿蚤灶早泽 燥枣 贼澡藻 粤泽泽燥糟蚤葬贼蚤燥灶 枣燥则 孕造葬灶贼 孕则燥贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 杂澡蚤鄄
噪燥噪怎袁 圆园园源袁 猿怨院 圆苑 原 猿猿
咱源暂 周常勇袁赵学源袁蒋元晖援 温州蜜柑萎缩病毒提纯与抗血清
制作及其应用援 病毒学报袁员怨怨远袁 员圆渊员冤院 缘缘 原 远员
咱缘暂 月藻则贼燥造蚤灶蚤 耘袁 蕴燥责藻泽 杂 粤袁 酝蚤则葬灶凿葬 酝 孕袁 藻贼 葬造援 阅蚤则藻糟贼 责造葬灶贼 贼蚤泽鄄
泽怎藻鄄责则蚤灶贼 葬灶凿 蚤灶泽藻糟贼 泽择怎葬泽澡鄄遭造燥贼 皂藻贼澡燥凿泽 枣燥则 造葬则早藻鄄泽糟葬造藻 凿藻贼藻糟鄄
贼蚤燥灶 燥枣 悦葬灶凿蚤凿葬贼怎泽 蕴蚤遭藻则蚤遭葬糟贼藻则 泽责责援 遭赠 则藻葬造鄄贼蚤皂藻 孕悦砸 憎蚤贼澡 灶藻憎
责则蚤皂藻则泽援 愈峪 悦燥灶枣藻则藻灶糟藻 燥枣 贼澡藻 陨韵悦灾袁 悦葬皂责蚤灶葬泽 辕 杂孕袁
月则葬扎蚤造袁 圆园员园
渊责任编辑院高峰冤
源怨 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源园 卷