全 文 ：第 源员 卷摇 第 缘 期
圆园员源 年 员园 月
植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报
粤悦栽粤 孕匀再栽韵孕匀再蕴粤悦陨悦粤 杂陨晕陨悦粤
灾燥造援 源员摇 晕燥援 缘
韵糟贼援 摇 圆园员源
摇
基金项目院 国家自然科学基金渊猿员员园员源圆远冤袁教育部留学回国人员科研启动基金渊教外司留咱圆园员猿暂远怨猿号冤袁国家公益性行业渊农业冤科研
专项渊圆园员员园猿园员远冤
作者简介院 吴群袁女袁员怨愿怨年生袁硕士研究生袁研究方向为真菌学及植物真菌病害袁 耘鄄皂葬蚤造院 赠噪皂蚤灶员怨怨园岳 澡燥贼皂葬蚤造援 糟燥皂
鄢通讯作者渊粤怎贼澡燥则 枣燥则 糟燥则则藻泽责燥灶凿藻灶糟藻冤袁 耘鄄皂葬蚤造院 澡躁扎澡葬灶早岳 葬澡葬怎援 藻凿怎援 糟灶
收稿日期院 圆园员源 原 园员 原 园苑
核盘菌激发子基因 杂泽悦怎贼克隆尧原核表达及纯化
吴摇 群摇 赵同瑶摇 唐仕妤摇 高智谋摇 张华建鄢
渊安徽农业大学植物保护学院袁 合肥 圆猿园园猿远冤
摘要院 为开发以病原菌激发子为主要成分的新型生物农药袁根据核盘菌的全基因组数据信息袁采用
逆转录聚合酶链式反应渊 则藻增藻则泽藻 贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶鄄孕悦砸袁 砸栽鄄孕悦砸冤技术从核盘菌菌株 晕郧粤源 克隆到编码
角质酶基因的全长 糟阅晕粤 序列袁在不同条件下进行原核表达袁通过 晕蚤圆 垣亲和层析重组蛋白 匀蚤泽鄄
杂泽悦怎贼袁并进行激发子活性检测遥 序列分析表明袁克隆的基因编码核盘菌角质酶开放阅读框为
远园怨 遭责袁预测编码 圆园圆 个氨基酸袁并将基因命名为 杂泽悦怎贼渊杂糟造藻则燥贼蚤灶蚤葬 泽糟造藻则燥贼蚤燥则怎皂 糟怎贼蚤灶葬泽藻冤遥 含 杂泽悦怎贼 辕
责耘栽猿圆葬的表达菌株 月蕴圆员 经异丙基硫代半乳糖苷渊 蚤泽燥责则燥责赠造 茁鄄阅鄄员鄄贼澡蚤燥早葬造葬糟贼燥责赠则葬灶燥泽蚤凿藻袁 陨孕栽郧冤诱
导袁于 圆愿尧猿园 和 猿苑 益均能产生 源源援 猿 噪阅左右的融合蛋白袁其中 猿园 益诱导 猿 澡袁融合蛋白表达量最高袁
浸润的烟草出现过敏性坏死反应遥 经纯化的蛋白 匀蚤泽鄄杂泽悦怎贼 和细菌 匀蚤泽鄄匀葬则责蚤灶 分别浸润烟草叶片
出现类似的细胞死亡遥 表明 匀蚤泽鄄杂泽悦怎贼具有激发子的活性遥
关键词院 核盘菌曰 激发子曰 载体构建曰 原核表达曰 过敏反应
悦造燥灶蚤灶早袁 责则燥噪葬则赠燥贼蚤糟 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 葬灶凿 责怎则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 藻造蚤糟蚤贼燥则 早藻灶藻 杂泽悦怎贼
枣则燥皂 杂糟造藻则燥贼蚤灶蚤葬 泽糟造藻则燥贼蚤燥则怎皂
宰怎 匝怎灶摇 在澡葬燥 栽燥灶早赠葬燥摇 栽葬灶早 杂澡蚤赠怎摇 郧葬燥 在澡蚤皂燥怎摇 在澡葬灶早 匀怎葬躁蚤葬灶鄢
渊悦燥造造藻早藻 燥枣 孕造葬灶贼 孕则燥贼藻糟贼蚤燥灶袁 粤灶澡怎蚤 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 匀藻枣藻蚤 圆猿园园猿远袁 粤灶澡怎蚤 孕则燥增蚤灶糟藻袁 悦澡蚤灶葬冤
粤遭泽贼则葬糟贼院 陨灶 燥则凿藻则 贼燥 藻曾责造燥则藻 葬灶 藻造蚤糟蚤贼燥则 葬泽 遭蚤燥鄄责藻泽贼蚤糟蚤凿藻袁 葬灶 藻造蚤糟蚤贼燥则鄄藻灶糟燥凿蚤灶早 早藻灶藻 憎葬泽 蚤泽燥造葬贼藻凿 怎泽蚤灶早
则藻增藻则泽藻 贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶 责燥造赠皂藻则葬泽藻 糟澡葬蚤灶 则藻葬糟贼蚤燥灶 渊砸栽鄄孕悦砸冤 遭葬泽藻凿 燥灶 贼澡藻 泽藻择怎藻灶糟藻凿 早藻灶燥皂蚤糟 蚤灶枣燥则皂葬贼蚤燥灶
燥枣 杂糟造藻则燥贼蚤灶蚤葬 泽糟造藻则燥贼蚤燥则怎皂援 栽澡藻 早藻灶藻 泽藻择怎藻灶糟藻 皂葬贼糟澡藻凿 贼澡藻 早藻灶燥皂蚤糟 泽藻择怎藻灶糟藻 燥枣 葬 责怎贼葬贼蚤增藻 责则燥贼藻蚤灶
糟怎贼蚤灶葬泽藻 枣则燥皂 杂援 泽糟造藻则燥贼蚤燥则怎皂袁 葬灶凿 憎葬泽 灶葬皂藻凿 杂泽悦怎贼 渊 杂糟造藻则燥贼蚤灶蚤葬 泽糟造藻则燥贼蚤燥则怎皂 糟怎贼蚤灶葬泽藻 冤援 杂藻择怎藻灶糟藻
葬灶葬造赠泽蚤泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 蚤贼 蚤灶糟造怎凿藻凿 葬灶 燥责藻灶 则藻葬凿蚤灶早 枣则葬皂藻 燥枣 远园怨 遭责 藻灶糟燥凿蚤灶早 葬 责则燥贼藻蚤灶 燥枣 圆园圆 葬皂蚤灶燥 葬糟蚤凿泽援
栽澡藻 凿藻凿怎糟藻凿 责则燥贼藻蚤灶袁 杂泽悦怎贼袁 憎葬泽 藻曾责则藻泽泽藻凿 蚤灶 耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤援 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 枣则燥皂 杂阅杂鄄孕粤郧耘 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼
贼澡藻 泽责藻糟蚤枣蚤糟 枣怎泽蚤燥灶 责则燥贼藻蚤灶 憎葬泽 葬责责则燥曾蚤皂葬贼藻造赠 源源援 猿 噪阅袁 葬灶凿 憎葬泽 泽怎糟糟藻泽泽枣怎造造赠 蚤灶凿怎糟藻凿 贼燥 藻曾责则藻泽泽 遭赠 陨孕栽郧
葬贼 圆愿袁 猿园 葬灶凿 猿苑益 援 孕藻葬噪 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 憎葬泽 葬糟澡蚤藻增藻凿 葬枣贼藻则 陨孕栽郧 蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶 枣燥则 猿 澡 葬贼 猿园益 援 栽澡藻 藻曾责则藻泽泽藻凿
责则燥贼藻蚤灶 糟燥造造藻糟贼藻凿 枣则燥皂 遭葬糟贼藻则蚤葬 蚤灶凿怎糟藻凿 澡赠责藻则泽藻灶泽蚤贼蚤增藻 则藻泽责燥灶泽藻 蚤灶 贼燥遭葬糟糟燥援 云怎则贼澡藻则 责怎则蚤枣蚤藻凿 匀蚤泽鄄杂泽悦怎贼
蚤灶凿怎糟藻凿 灶藻糟则燥贼蚤糟 造藻泽蚤燥灶泽 蚤灶 贼燥遭葬糟糟燥 造藻葬增藻泽 泽蚤皂蚤造葬则 贼燥 匀蚤泽鄄匀葬则责蚤灶 贼则藻葬贼皂藻灶贼援 栽澡藻泽藻 泽贼怎凿蚤藻泽 泽澡燥憎泽 贼澡葬贼 匀蚤泽鄄
杂泽悦怎贼 蚤泽 葬灶 藻造蚤糟蚤贼燥则袁 葬灶凿 憎蚤造造 澡藻造责 贼燥 责则燥增蚤凿藻 葬 灶燥增藻造 泽贼则葬贼藻早赠 枣燥则 早藻灶藻则葬贼蚤灶早 藻灶增蚤则燥灶皂藻灶贼鄄枣则蚤藻灶凿造赠 藻造蚤糟蚤贼燥则
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责则燥贼藻蚤灶泽援
运藻赠 憎燥则凿泽院 杂糟造藻则燥贼蚤灶蚤葬 泽糟造藻则燥贼蚤燥则怎皂曰 藻造蚤糟蚤贼燥则曰 责造葬泽皂蚤凿 糟燥灶泽贼则怎糟贼蚤燥灶曰 责则燥噪葬则赠燥贼蚤糟 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶曰 澡赠责藻则泽藻灶泽蚤贼蚤增藻
则藻泽责燥灶泽藻摇
摇 摇 核盘菌 杂糟造藻则燥贼蚤灶蚤葬 泽糟造藻则燥贼蚤燥则怎皂 渊 蕴蚤遭援 冤 凿藻 月葬则赠
是一种世界性植物病原真菌袁主要分布于温带与亚
热带地区袁其寄主范围十分广泛袁可寄生 苑缘 科 源园园
多种植物咱员暂 遥 该菌引起的油菜菌核病居我国油菜 猿
大病害首位袁每年造成的损失约占总病害损失的
愿园豫 咱圆暂 袁严重制约油菜生产遥 在长江流域油菜主产
区袁直接经济损失达数亿元咱猿暂 遥 目前对于油菜菌核
病的防治主要采取以种植抗病品种为基础咱源暂 尧改进
栽培管理尧适时化学防治咱缘暂的综合治理策略遥 由于
生产上缺乏高抗品种袁农业防治费时费工且收效甚
微袁化学防治又易导致环境污染尧农药残留及抗药
性咱缘 原 远暂 遥 因此袁需要发展天然且环境友好型的制剂
对油菜菌核病进行防治遥 目前袁生物防治成为研究
热点袁主要的生防菌有枯草芽胞杆菌 月葬糟蚤造造怎泽 泽怎遭贼蚤鄄
造蚤泽尧盾壳霉 悦燥灶蚤燥贼澡赠则蚤怎皂 皂蚤灶蚤贼葬灶泽咱苑 原 愿暂和放线菌 粤糟贼蚤鄄
灶燥遭葬糟贼藻则蚤葬咱怨暂等遥 此外袁研究发现激发子可诱发植物
的抗病性袁从而阻止或限制病害的发生和扩展袁然而
利用激发子进行油菜菌核病防治的报道较少遥
激发子又名植物诱抗剂咱员园暂 袁是能诱导寄主植物
产生防卫反应的一类特殊化合物的总称遥 其从化学
组成上可分为多糖类咱员员暂 尧糖蛋白咱员圆 原 员猿暂 尧多肽类
等咱员源 原 员远暂 遥 现已发现人工合成的化学物质及微生物
来源的蛋白具有诱导免疫反应的活性袁其中微生物
来源的蛋白类激发子具有能够发展为生物农药的潜
力袁在稻瘟菌 酝葬早灶葬责燥则贼澡藻 燥则赠扎葬藻 和疫霉菌 孕澡赠贼燥责澡鄄
贼澡燥则葬 泽责责援中研究较为广泛遥 李云峰等咱员苑暂在稻瘟菌
培养液中分离尧纯化到一个大小为 远远 噪阅的蛋白袁该
蛋白能诱导水稻叶片中与抗性相关的过氧化物酶
渊责藻则燥曾蚤凿葬泽藻袁孕韵阅冤和苯丙氨酸解氨酶渊责澡藻灶赠造葬造葬灶蚤灶藻
葬皂皂燥灶蚤葬 造赠葬泽藻袁 孕粤蕴冤活性升高遥 在澡葬灶早等咱员愿暂发现稻
瘟病菌激发子 晕藻责员酝燥可诱导烟草过氧化氢和一氧
化氮积累袁激活蛋白激酶曰此外袁晕藻责员酝燥处理过的烟
草叶片通过过敏性细胞死亡和气孔关闭可提高对烟
草疫霉的抗性咱员怨 原 圆员暂 遥 张宏明等咱圆圆暂从棕榈疫霉 孕澡赠鄄
贼燥责澡贼澡燥则葬 责葬造皂蚤增燥则葬 的培养滤液中分离出一个分子
量为 员园援 远 噪阅 的不含糖基的耐热蛋白袁该蛋白可诱
导烟草植物早期的免疫防卫反应袁如叶片过敏性坏
死反应尧匀圆韵圆 迸发等遥 这些研究表明激发子可诱发
植物的防卫反应以抵抗病原菌的侵入遥
植物角质层是植物表面由角质和蜡质组成的膜
状结构袁并由果胶质连接袁覆盖在表皮细胞外表面的
细胞壁上袁对植物起着机械防护和失水保护的作用袁
是植物抵抗病原菌侵入的第一道障碍遥 角质酶
渊糟怎贼蚤灶葬泽藻冤是一种可降解角质并产生大量脂肪酸单
体的水解酶袁是病原菌产生的对寄主细胞壁组分有
降解作用的酶类咱圆猿暂 遥 一方面袁病原菌角质酶由于能
分解植物角质层而可能促进病原菌侵染曰另一方面袁
则是病原菌角质酶还可能同时诱发植物的抗病防御
系统遥 目前袁国内外众多学者对角质酶进行了大量
研究袁主要集中在病原菌致病过程作用机理方面袁其
中研究较多的是豌豆根腐病菌 云怎泽葬则蚤怎皂 泽燥造葬灶蚤 枣援 泽责援
责蚤泽蚤的角质酶咱圆源暂 曰此外袁蕴蚤 等咱圆缘暂通过研究发现芸薹
叶斑病菌 孕赠则藻灶燥责藻扎蚤扎葬 遭则葬泽泽蚤糟葬藻 的角质酶 孕遭糟员 在侵
染油菜中发挥作用遥 但有研究发现角质酶能够诱导
寄主植物的抗病性袁孕葬则噪藻则 驭 运觟造造藻则咱圆远暂研究发现梨
黑星菌 灾藻灶贼怎则蚤葬 灶葬泽澡蚤糟燥造葬的角质酶能够抑制尖孢镰
刀菌 云怎泽葬则蚤怎皂 燥曾赠泽责燥则怎皂 在寄主体内的扩展遥 说明
角质酶在一定范围内能诱导植物产生抗性袁抑制病
原菌的侵入袁但这方面的研究较少遥
本试验克隆了核盘菌中编码角质酶的基因
杂泽悦怎贼袁在不同条件下进行原核表达袁筛选出最佳反
应条件尧纯化其表达蛋白袁以验证该蛋白是否具有引
起植物过敏性反应的激发子活性袁以期为研究植物
抗病及其对病原菌的非寄主抗性分子机理袁设计高
效尧低毒的植物病害控制策略提供理论基础遥
员 材料与方法
员援 员 材料
供试烟草种子及质粒院责耘栽猿圆葬质粒以及本氏烟
种子 晕蚤糟燥贼蚤葬灶葬 遭藻灶贼澡葬皂蚤葬灶葬 由南京农业大学植物保
护学院提供曰云烟 愿苑 晕援 贼葬遭葬糟怎皂 由安徽省农业科学
院烟草研究所提供曰责酝阅鄄员愿栽 质粒为宝生物工程
渊大连冤有限公司产品曰大肠杆菌 耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤
阅匀缘琢尧月蕴圆员 和核盘菌 晕郧粤源 菌株由安徽农业大学
植物保护学院真菌研究室保存并提供遥
试剂院凝胶回收试剂盒尧云蚤则泽贼鄄杂贼则葬灶凿 糟阅晕粤 杂赠灶鄄
贼澡藻泽蚤泽 运蚤贼尧栽砸陨扎燥造襆 孕造怎泽 砸晕粤 孕怎则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 运蚤贼 均购于
宝生物工程渊大连冤有限公司曰质粒提取试剂盒为爱
思进生物技术渊杭州冤有限公司产品曰限制性内切酶
月葬皂匀玉尧杂葬糟玉尧酝鄄酝蕴灾 砸藻增藻则泽藻 栽则葬灶泽糟则蚤责贼葬泽藻尧蚤泽燥责则燥鄄
责赠造鄄遭藻贼葬鄄阅鄄贼澡蚤燥早葬造葬糟贼燥责赠则葬灶燥泽蚤凿藻渊 陨孕栽郧冤购于赛默飞
世尔科技有限公司曰其它试剂均为分析纯遥
仪器院猿运鄄猿园 高速冷冻离心机袁美国 杂蚤早皂葬 公
司曰阅哉鄄苑猿园 紫外 辕可见分光光度计袁美国贝克曼公
司曰微量移液器袁德国 耘责责藻灶凿燥则枣 公司曰 杂蚤皂责造蚤糟蚤贼赠
员愿缘 垣 孕赠则燥早葬则凿 阅 组合型超纯水站袁法国密理博公
司曰月蚤燥鄄砸葬凿皂蕴怎造援 孕则燥贼藻蚤灶电泳系统尧梯度 孕悦砸 仪袁美
员猿远缘 期 吴摇 群等院 核盘菌激发子基因 杂泽悦怎贼克隆尧原核表达及纯化
国 月蚤燥鄄砸葬凿公司曰核酸 辕蛋白凝胶图像分析管理系
统袁美国 哉灾孕 公司曰栽郧员远宰 微量高速台式离心机袁
长沙平凡仪器仪表制造有限公司遥
员援 圆 方法
员援 圆援 员 烟草植株的培养
将本氏烟和云烟 愿苑 种子均匀洒在装有营养土
的盆钵内袁在 圆缘益尧员远 蕴 颐 愿 阅条件下 苑 凿左右开始萌
发袁待植株第 猿 片叶子展开后移栽袁每盆 员 耀 圆 株袁转
移至 圆缘 益尧员远 蕴 颐 愿 阅 的温室中继续培养袁员源 凿 左右
植株具有 缘 耀 远 片叶子时即可用于接种遥
员援 圆援 圆 杂泽悦怎贼基因克隆及测序
采用 栽砸陨扎燥造襆 孕造怎泽 砸晕粤 孕怎则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 运蚤贼 提取核
盘菌 晕郧粤源 菌丝体的总 砸晕粤袁使用 酝鄄酝蕴灾 砸藻增藻则泽藻
栽则葬灶泽糟则蚤责贼葬泽藻进行 糟阅晕粤 的合成遥 根据核盘菌编码
角质酶基因序列合成上游引物 杂泽悦怎贼鄄云院缘忆鄄悦郧悦郧鄄
郧粤栽悦悦粤栽郧粤粤郧粤悦悦栽悦粤粤悦悦悦粤粤悦鄄猿忆渊月葬皂匀玉冤和下
游引物 杂泽悦怎贼鄄砸院缘忆鄄悦郧粤郧悦栽悦栽栽粤悦粤粤粤悦悦悦郧悦粤郧悦鄄
栽栽栽悦鄄猿忆渊杂葬糟玉冤袁以核盘菌 糟阅晕粤 为模板进行 孕悦砸
扩增袁孕悦砸 程序为 怨源 益预变性 缘 皂蚤灶曰怨源 益 猿园 泽袁
缘远 益 猿园 泽袁苑圆 益 源园 泽袁猿源 个循环曰苑圆 益 员园 皂蚤灶遥 扩增
产物按照凝胶回收试剂盒使用说明进行回收袁将回
收目的片段连接于 责酝阅鄄员愿栽 载体遥 连接产物转化
感受态 耘援 糟燥造蚤 阅匀缘琢袁进行阳性克隆筛选遥 阳性克隆
由上海英骏生物技术有限公司进行序列测定遥
员援 圆援 猿 原核表达载体构建
提取测序正确的质粒后用 云葬泽贼阅蚤早藻泽贼 月葬皂匀玉
和 云葬泽贼阅蚤早藻泽贼 杂葬糟玉双酶切袁在 栽源 阅晕粤 蕴蚤早葬泽藻的作用
下连接到以相同酶切后回收的 责耘栽猿圆葬 载体上袁员远
益连接过夜遥 将连接产物转入 耘援 糟燥造蚤 阅匀缘琢袁在氨苄
青霉素抗性的 蕴月平板上挑取重组质粒袁通过 孕悦砸尧
双酶切筛选阳性克隆遥 构建成功的表达质粒命名为
杂泽悦怎贼 辕 责耘栽猿圆葬袁进而转化入 耘援 糟燥造蚤 月蕴圆员感受态细胞遥
员援 圆援 源 杂泽悦怎贼 辕 责耘栽猿圆葬的原核表达及 杂阅杂鄄孕粤郧耘分析
将 员援 圆援 猿 中验证成功的单克隆接种到 猿 皂蕴 含
有 缘园 滋早 辕 皂蕴 粤皂责 的 蕴月 培养基中袁振荡培养 员圆 澡
后袁将菌液按 员 颐 员园园的比例加入到 猿园园 皂蕴含有 缘园 滋早 辕
皂蕴 粤皂责的 蕴月培养基中 圆园园 则 辕 皂蚤灶尧猿苑益振荡培养至
韵阅远园园为 园援 缘 耀 园援 远 时袁加入 陨孕栽郧 至终浓度为 员 皂酝 辕
蕴进行诱导表达袁分别在 圆愿尧猿园 和 猿苑 益诱导 猿 澡 和
远 澡后收集菌体袁源 益保存备用遥 诱导全部完成后袁
各取 缘园 皂蕴菌液离心收集菌体后用 员 伊 孕月杂 将沉淀
菌悬起袁经过超声波细胞破碎袁员园 园园园 则 辕 皂蚤灶 离心 员园
皂蚤灶分离上清和沉淀袁上清分别加入 杂阅杂 上样缓冲
液袁悬浮混匀袁员园园 益 猿 皂蚤灶袁进行 杂阅杂鄄孕粤郧耘袁分析蛋
白表达结果遥
员援 圆援 缘 激发子的生物活性
将 员援 圆援 源 不同条件诱导得到的粗蛋白袁用去针
头的注射器从植物背面主脉一侧的两侧脉之间将蛋
白注射入烟草叶组织内至水渍状斑直径约 员 糟皂遥 每
处理设 猿 次重复遥 以空载体 责耘栽猿圆葬经 陨孕栽郧诱导的
蛋白作为对照遥 处理后的植物置温室 圆缘 益培养袁观
察试验结果遥 若注射部位在 源愿 澡 内变为褐色枯斑袁
记为过敏反应遥 试验重复 圆 次遥
员援 圆援 远 目的蛋白的纯化
将检测具有激发子活性的粗蛋白进行 晕蚤圆 垣亲
和层析柱纯化袁粗蛋白溶液 源 益尧员猿 园园园 则 辕 皂蚤灶 离心
猿园 皂蚤灶袁收集上清遥 将破碎液上清缓慢通过螯合
晕蚤圆 垣的 晕栽粤 柱子袁用 缘园 皂酝 咪唑的 月蚤灶凿蚤灶早 遭怎枣枣藻则
渊圆园 皂酝 栽则蚤泽鄄匀悦陨 责匀 愿援 园尧缘园园 皂酝 晕葬悦造冤洗脱杂蛋
白袁然后用含有 缘园园 皂酝 咪唑的 月蚤灶凿蚤灶早 遭怎枣枣藻则渊耘造怎鄄
贼蚤燥灶 遭怎枣枣藻则冤洗脱目的蛋白遥 使用紫外分光光度计测
量目的蛋白浓度袁测定 韵阅圆愿园 辕 韵阅圆远园值袁确定纯化过
程核酸是否去除干净遥 杂阅杂鄄孕粤郧耘 鉴定蛋白浓度尧
纯度及分子大小遥 纯化蛋白注射入烟草进行激发子
活性测定袁以 匀蚤泽鄄匀葬则责蚤灶 蛋白为阳性对照袁匀蚤泽鄄贼葬早
为阴性对照遥
圆 结果与分析
圆援 员 杂泽悦怎贼基因克隆
提取核盘菌 晕郧粤源 菌丝体总 砸晕粤袁反转录得其
糟阅晕粤袁经 砸栽鄄孕悦砸扩增得到大小为 远园园 遭责左右的片
段渊图 员冤袁回收后的 阅晕粤片段浓度为 苑愿援 员 灶早 辕 滋蕴遥
图 员 核盘菌 杂泽悦怎贼基因的克隆
云蚤早援 员 栽澡藻 葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 杂泽悦怎贼 早藻灶藻 枣则燥皂 糟阅晕粤 燥枣
杂糟造藻则燥贼蚤灶蚤葬 泽糟造藻则燥贼蚤燥则怎皂
摇 摇 酝院 阅蕴圆园园园 皂葬则噪藻则曰 员院 杂泽悦怎贼 片段遥 酝院 阅蕴圆园园园 皂葬则噪藻则曰 员院
贼澡藻 枣则葬早皂藻灶贼 燥枣 杂泽悦怎贼援
将上述回收产物与 责酝阅鄄员愿栽载体连接袁通过热
击法转化到大肠杆菌 阅匀缘琢 感受态细胞袁得到重组
质粒 杂泽悦怎贼 辕 责酝阅鄄员愿栽遥 菌落 孕悦砸检测结果显示该片
圆猿远 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源员 卷
段已经与 责酝阅鄄员愿栽 载体连接渊图 圆冤遥 经测序分析
发现克隆的基因编码核盘菌角质酶渊糟怎贼蚤灶葬泽藻袁 载酝赃
园园员缘怨园怨愿远援 员冤袁包含 远园怨 个碱基对的核苷酸袁命名为
杂泽悦怎贼遥 将 杂泽悦怎贼基因的 糟阅晕粤序列翻译成氨基酸序
列袁与公共数据库进行比对遥 结果显示 杂泽悦怎贼 蛋白
和其它真菌角质酶一样含有保守的 源 个半胱氨酸残
基及一个保守的 郧再杂匝郧 基序遥 不同真菌角质酶氨
基酸序列分析结果表明核盘菌 杂援 泽糟造藻则燥贼蚤燥则怎皂 和灰
葡萄孢 月燥贼则赠燥贼蚤灶蚤葬 枣怎糟噪藻造蚤葬灶葬 角质酶在进化上亲缘
关系较近遥
图 圆 杂泽悦怎贼 辕 责酝阅鄄员愿栽阳性克隆 孕悦砸检测
云蚤早援 圆 杂糟则藻藻灶蚤灶早 燥枣 责燥泽蚤贼蚤增藻 糟燥造燥灶赠 燥枣 杂泽悦怎贼 辕 责酝阅鄄员愿栽 遭赠 孕悦砸 葬灶葬造赠泽蚤泽
摇 摇 酝院 阅蕴圆园园园 皂葬则噪藻则曰 员院阳性对照质粒 孕悦砸曰 圆院阴性对照曰 猿 耀 员源院 杂泽悦怎贼 辕 责酝阅鄄员愿栽单菌落 孕悦砸遥 酝院 阅蕴圆园园园 皂葬则噪藻则曰 员院 孕悦砸 燥枣 责燥泽蚤鄄
贼蚤增藻 责造葬泽皂蚤凿曰 圆院 灶藻早葬贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造曰 猿 原 员源院 孕悦砸 燥枣 杂泽悦怎贼 辕 责酝阅鄄员愿栽 糟燥造燥灶赠援
圆援 圆 杂泽悦怎贼基因表达和载体构建
将经测序正确的重组质粒 杂泽悦怎贼 辕 责酝阅鄄员愿栽 和
责耘栽猿圆葬原核表达载体同时用 云葬泽贼阅蚤早藻泽贼 月葬皂匀玉和
云葬泽贼阅蚤早藻泽贼 杂葬糟玉进行双酶切渊图 猿冤袁回收目的基因小
片断和原核表达载体大片断袁连接并转化 耘援 糟燥造蚤
阅匀缘琢感受态细胞袁转化成功的菌株挑取单克隆进
行 孕悦砸鉴定袁员园 个克隆可扩增出与阳性对照质粒
杂泽悦怎贼 辕 责酝阅鄄员愿栽大小一致的片段渊图 源鄄粤冤遥
图 猿 重组质粒 杂泽悦怎贼 辕 责酝阅鄄员愿栽和载体质粒 责耘栽猿圆葬双酶切
云蚤早援 猿 阅蚤早藻泽贼蚤燥灶 燥枣 杂泽悦怎贼 辕 责酝阅鄄员愿栽 葬灶凿 责耘栽猿圆葬 遭赠 月葬皂匀玉 葬灶凿 杂葬糟玉
摇 摇 酝院 阅蕴圆园园园 皂葬则噪藻则曰 员 耀 圆院 重组质粒 杂泽悦怎贼 辕 责酝阅鄄员愿栽曰 猿 耀 源院 责耘栽猿圆葬遥 酝院 阅蕴圆园园园 皂葬则噪藻则曰 员 原 圆院 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 责造葬泽皂蚤凿 杂泽悦怎贼 辕 责酝阅鄄
员愿栽曰 猿 原 源院 责耘栽猿圆葬援
图 源 重组质粒 杂泽悦怎贼 辕 责耘栽猿圆葬阳性克隆 孕悦砸检测及双酶切验证
云蚤早援 源 孕悦砸 增藻则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 责燥泽蚤贼蚤增藻 糟燥造燥灶蚤藻泽 燥枣 杂泽悦怎贼 辕 责耘栽猿圆葬 葬灶凿 凿蚤早藻泽贼蚤燥灶 燥枣 杂泽悦怎贼 辕 责耘栽猿圆葬 遭赠 月葬皂匀玉 葬灶凿 杂葬糟玉
摇 摇 粤院 重组质粒 杂泽悦怎贼 辕 责耘栽猿圆葬阳性克隆 孕悦砸检测曰 酝院 阅蕴圆园园园 皂葬则噪藻则曰 员院 阳性对照质粒 孕悦砸曰 圆院 阴性对照曰 猿 耀 员猿院 杂泽悦怎贼 辕 责耘栽猿圆葬
单菌落 孕悦砸遥 月院 阅蚤早藻泽贼蚤燥灶 燥枣 杂泽悦怎贼 辕 责耘栽猿圆葬 遭赠 月葬皂匀玉 葬灶凿 杂葬糟玉曰 酝院 阅蕴圆园园园 皂葬则噪藻则曰 员院 杂泽悦怎贼 辕 责耘栽猿圆葬 双酶切曰 圆院 责耘栽猿圆葬 质粒遥
粤院 孕悦砸 增藻则蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 责燥泽蚤贼蚤增藻 糟燥造燥灶蚤藻泽 燥枣 杂泽悦怎贼 辕 责耘栽猿圆葬曰 酝院 阅蕴圆园园园 皂葬则噪藻则曰 员院 责燥泽蚤贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造曰 圆院 灶藻早葬贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造曰 猿 原 员猿院 贼澡藻 糟燥造燥灶赠 燥枣
杂泽悦怎贼 辕 责耘栽猿圆葬援 月院 阅蚤早藻泽贼蚤燥灶 燥枣 杂泽悦怎贼 辕 责耘栽猿圆葬 遭赠 月葬皂匀玉 葬灶凿 杂葬糟玉曰 酝院 阅蕴圆园园园 皂葬则噪藻则曰 员院 凿蚤早藻泽贼蚤燥灶 燥枣 杂泽悦怎贼 辕 责耘栽猿圆葬曰 圆院 责耘栽猿圆葬援
摇 摇 提取经 孕悦砸鉴定的质粒袁以 云葬泽贼阅蚤早藻泽贼 月葬皂匀玉
和 云葬泽贼阅蚤早藻泽贼 杂葬糟玉进行酶切鉴定袁成功构建 杂泽悦怎贼 辕
责耘栽猿圆葬原核表达载体渊图 源鄄月冤遥 将鉴定的重组质
粒 杂泽悦怎贼 辕 责耘栽猿圆葬转入至表达菌株 耘援 糟燥造蚤 月蕴圆员袁并进
行菌落 孕悦砸 验证袁得到 员园 个阳性克隆渊图 缘冤遥 进
行扩大培养袁利用 陨孕栽郧诱导菌体表达遥
圆援 猿 杂泽悦怎贼的原核表达及其活性检测
杂泽悦怎贼基因全长为 远园怨 遭责袁编码 圆园圆 个氨基酸袁
经计算其分子量约为 圆园援 猿 噪阅袁责耘栽猿圆葬 编码的蛋白
为 圆园援 员 噪阅袁因此融合蛋白大小约为 源园援 源 噪阅遥 在终
猿猿远缘 期 吴摇 群等院 核盘菌激发子基因 杂泽悦怎贼克隆尧原核表达及纯化
浓度为 员 皂酝 辕 蕴 陨孕栽郧尧猿园 益下诱导 猿 澡 进行预试验袁
杂阅杂鄄孕粤郧耘电泳显示院上清液在 源园 噪阅左右有一蛋白
质条带袁与预期融合蛋白大小相近曰沉淀和空白对照
无明显主带渊图 远鄄粤冤遥 为了获得能够可溶性表达的
目的蛋白袁分别采取 员 皂酝 辕 蕴 陨孕栽郧在 圆愿尧猿园尧猿苑 益诱
导 猿 澡 和 远 澡袁诱导完成后分别对上清进行 杂阅杂鄄
孕粤郧耘电泳检测遥 结果表明袁在 圆愿 和 猿园 益融合蛋
白均能被诱导曰在 猿园 益条件下诱导的表达量最多
渊图 远鄄月冤袁且在 源园 噪阅处有一明显的新生蛋白带袁与
重组质粒 杂泽悦怎贼 辕 责耘栽猿圆葬推测的表达蛋白大小相近遥
图 缘 重组质粒 杂泽悦怎贼 辕 责耘栽猿圆葬转化大肠杆菌 月蕴圆员 阳性克隆 孕悦砸筛选
云蚤早援 缘 孕悦砸 燥枣 责燥泽蚤贼蚤增藻 糟燥造燥灶蚤藻泽 糟燥灶贼葬蚤灶蚤灶早 杂泽悦怎贼 辕 责耘栽猿圆葬 葬枣贼藻则 贼则葬灶泽凿怎糟藻凿 蚤灶贼燥 耘援 糟燥造蚤 月蕴圆员
摇 摇 酝院 阅蕴圆园园园 皂葬则噪藻则曰 员院 阳性对照曰 圆院 阴性对照曰 猿 耀 员怨院 杂泽悦怎贼 辕 责耘栽猿圆葬 转化大肠杆菌 月蕴圆员 单菌落 孕悦砸遥 酝院 阅蕴圆园园园 皂葬则噪藻则曰 员院
责燥泽蚤贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造曰 圆院 灶藻早葬贼蚤增藻 糟燥灶贼则燥造曰 猿 原 员怨院 孕悦砸 燥枣 贼澡藻 糟燥造燥灶蚤藻泽 糟燥灶贼葬蚤灶蚤灶早 杂泽悦怎贼 辕 责耘栽猿圆葬 贼则葬灶泽凿怎糟藻凿 蚤灶贼燥 耘援 糟燥造蚤 月蕴圆员援
图 远 杂泽悦怎贼基因重组蛋白在大肠杆菌的表达及 匀砸活性检测
云蚤早援 远 耘曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 则藻糟燥皂遭蚤灶葬灶贼 杂泽悦怎贼 辕 责耘栽猿圆葬 责则燥贼藻蚤灶 蚤灶 耘泽糟澡藻则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤 月蕴圆员 葬灶凿 匀砸鄄蚤灶凿怎糟蚤灶早 葬遭蚤造蚤贼赠
摇 摇 粤院 含 杂泽悦怎贼 辕 责耘栽猿圆葬菌在 员援 园皂酝 辕 蕴 陨孕栽郧浓度下尧猿园益诱导的上清和沉淀 杂阅杂鄄孕粤郧耘分析曰 酝院蛋白分子量皂葬则噪藻则曰 员院上清液曰 圆院
沉淀遥 月院 含 杂泽悦怎贼 辕 责耘栽猿圆葬菌在不同诱导条件的上清 杂阅杂鄄孕粤郧耘曰 悦院 不同条件下诱导的蛋白诱导烟草叶片的 匀砸反应曰 酝院 蛋白分子
量 皂葬则噪藻则曰 员院 责耘栽猿圆葬质粒袁猿园益 猿 澡曰 圆院 圆愿 益 猿 澡曰 猿院 圆愿益 远 澡曰 源院 猿园 益 猿 澡曰 缘院 猿园益 远 澡曰 远院 猿苑益 猿 澡曰 苑院 猿苑益 远 澡曰 愿院 园援 园员酝 孕月杂遥
粤院 杂阅杂鄄孕粤郧耘 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 泽怎责藻则灶葬贼葬灶贼 葬灶凿 责则藻糟蚤责蚤贼葬贼藻 葬枣贼藻则 蚤灶凿怎糟贼蚤燥灶 燥枣 杂泽悦怎贼 辕 责耘栽猿圆葬 遭赠 员援 园 皂酝 辕 蕴 陨孕栽郧曰 酝院 责则燥贼藻蚤灶 皂燥造藻糟怎造葬则 憎藻蚤早澡贼 皂葬则噪鄄
藻则曰 员院 泽怎责藻则灶葬贼葬灶贼曰 圆院 责则藻糟蚤责蚤贼葬贼蚤燥灶援 月院 杂阅杂鄄孕粤郧耘 燥枣 藻曾责则藻泽泽藻凿 责则燥贼藻蚤灶 蚤灶 耘援 糟燥造蚤 葬贼 凿蚤枣枣藻则藻灶贼 贼藻皂责藻则葬贼怎则藻泽 葬灶凿 贼蚤皂藻泽曰 悦院 匀砸 则藻葬糟贼蚤燥灶 蚤灶凿怎糟藻凿
葬枣贼藻则 蚤灶枣蚤造贼则葬贼藻凿 憎蚤贼澡 耘援 糟燥造蚤 藻曾责则藻泽泽藻凿 责则燥贼藻蚤灶 蚤灶 晕蚤糟燥贼蚤葬灶葬 贼燥遭葬糟怎皂曰 酝院 责则燥贼藻蚤灶 皂燥造藻糟怎造葬则 憎藻蚤早澡贼 皂葬则噪藻则曰 员院 责耘栽猿圆葬袁 猿园益 猿 澡曰 圆院 圆愿益 猿 澡曰
猿院 圆愿 益 远 澡曰 源院 猿园益 猿 澡曰 缘院 猿园 益 远 澡曰 远院 猿苑 益 猿 澡曰 苑院 猿苑 益 远 澡曰 愿院 园援 园员酝 孕月杂援
摇 摇 在上述不同条件下诱导的粗蛋白在烟草上产生
的枯斑大小有明显差异袁其中 圆愿 益条件下诱导 远 澡袁
猿园 益条件下诱导 猿 澡 和 远 澡 获得的粗蛋白注射烟草
愿 澡后袁注射部位开始出现肉眼可见的水渍状斑块袁
其它条件诱导后的粗蛋白在注射叶片 圆源 澡 后才开
始出现局部小于注射部位的细胞死亡遥 对照组 孕月杂
遭怎枣枣藻则不能诱导产生过敏性坏死反应渊澡赠责藻则泽藻灶泽蚤贼蚤增藻
则藻泽责燥灶泽藻袁 匀砸冤渊图 远鄄悦冤遥 结果表明 匀砸发生和诱导
表达的可溶性蛋白相关遥 因此袁推测引起烟草 匀砸
反应的蛋白就是原核表达的 杂泽悦怎贼遥
圆援 源 目的蛋白的纯化
为了进一步鉴定该蛋白袁将 猿园 益条件下 陨孕栽郧
诱导 猿 澡获得的粗蛋白经 晕蚤圆 垣亲和层析柱纯化袁以
缘园园 皂酝 的咪唑将蛋白洗脱袁杂阅杂鄄孕粤郧耘 电泳发现在
源源援 猿 噪阅附近存在明显的条带袁其大小与推测的蛋白
大小一致袁测定浓度为 园援 缘 皂早 辕 皂蕴渊图 苑鄄粤冤遥 匀蚤泽鄄
杂泽悦怎贼蛋白注射本氏烟叶片袁发现 愿 澡 已出现肉眼可
见的水渍状斑块袁圆源 澡时注射部位逐渐干枯袁细胞死
亡明显袁其反应与 匀蚤泽鄄匀葬则责蚤灶处理的烟草叶片类似袁
而对照 匀蚤泽鄄贼葬早蛋白不能引起烟草叶片的 匀砸 反应
渊图 苑鄄月冤袁说明 匀蚤泽鄄杂泽悦怎贼可诱发植物 匀砸遥
猿 讨论
角质酶是一种重要的丝氨酸水解酶袁在纺织尧发
酵和化工等方面应用广泛袁而在农业生产中角质酶
的研究主要集中在其致病过程中的功能袁目前研究
最广泛的是豌豆根腐病菌咱圆源暂 袁但关于核盘菌角质酶
的研究较少遥本研究采用 砸栽鄄孕悦砸技术克隆到编码
源猿远 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源员 卷
图 苑 纯化蛋白 匀蚤泽鄄杂泽悦怎贼诱导的烟草叶片 匀砸反应
云蚤早援 苑 孕怎则蚤枣蚤藻凿 匀蚤泽鄄杂泽悦怎贼 责则燥贼藻蚤灶鄄蚤灶凿怎糟藻凿 匀砸 蚤灶 晕蚤糟燥贼蚤葬灶葬 遭藻灶贼澡葬皂蚤葬灶葬
摇 摇 粤院 纯化蛋白 匀蚤泽鄄杂泽悦怎贼的 杂阅杂鄄孕粤郧耘电泳检测曰 月院 匀蚤泽鄄杂泽悦怎贼诱导的烟草叶片 匀砸反应遥 粤院 杂阅杂鄄孕粤郧耘 葬灶葬造赠泽蚤泽 燥枣 贼澡藻 责怎则蚤枣蚤藻凿 枣怎鄄
泽蚤燥灶 责则燥贼藻蚤灶 憎蚤贼澡 匀蚤泽鄄贼葬早曰 月院 匀砸 则藻葬糟贼蚤燥灶 蚤灶凿怎糟藻凿 遭赠 责怎则蚤枣蚤藻凿 匀蚤泽鄄杂泽悦怎贼援
杂援 泽糟造藻则燥贼蚤燥则怎皂角质酶的 杂泽悦怎贼 基因袁经测序发现袁该
片段为 远园怨 遭责袁能编码含有 圆园圆 个氨基酸残基的蛋
白袁通过氨基酸序列比对发现袁杂泽悦怎贼 与灰葡萄孢的
角质酶同源性达到了 愿员豫 袁二者的亲缘关系最近遥
进一步的氨基酸序列分析发现袁核盘菌角质酶与其
它真菌的角质酶一样袁都具有一个高度保守的氨基
酸序列 郧再杂匝郧作为催化位点遥 这说明角质酶在真
菌进化中具有保守性袁可以通过分析不同物种的角
质酶基因功能来确定新的物种角质酶的功能及用来
研究病原原寄主的共同进化关系遥
角质酶是一种小分子的蛋白袁多数真菌角质酶的
分子量较小为 圆圆 耀圆远 噪阅遥 但也有一些真菌的角质酶
分子量大于 源园 噪阅葬袁如灰霉病菌 月燥贼则赠贼蚤泽 糟蚤灶藻则藻葬咱圆苑暂 袁其
角质酶的分子量为 源园援 愿 噪阅葬遥 本研究构建了 杂泽悦怎贼 辕
责耘栽猿圆葬表达载体袁并将该载体导入大肠杆菌 月蕴圆员袁
在 猿园 益成功诱导其表达袁经 晕蚤圆 垣亲和层析柱纯化后
进行 杂阅杂鄄孕粤郧耘凝胶电泳袁结果显示院重组蛋白 匀蚤泽鄄
杂泽悦怎贼大小约为 源源援 猿 噪阅袁从而可以判断核盘菌角质
酶大小为 圆园援 源 噪阅袁这与经氨基酸序列推断的假定蛋
白大小一致遥 说明核盘菌角质酶同样属于小分子蛋
白酶类遥
角质酶除了在致病过程中起作用外袁还能诱导
植物产生抗病性袁如 孕葬则噪藻则 驭 运觟造造藻则咱圆远暂发现豆类植
物经苹果黑星菌 灾藻灶贼怎则蚤葬 蚤灶葬藻择怎葬造蚤泽的角质酶处理后
能对豆类枯萎病菌产生抗性袁抑制病原菌在体内的
扩展袁但关于核盘菌角质酶的此类报道较少遥 本研
究发现袁杂泽悦怎贼 粗蛋白和纯化蛋白浸润烟草叶片后袁
均能引起烟草叶片的过敏性坏死反应袁与 匀葬则责蚤灶 蛋
白引起的反应类似袁这说明该角质酶基因编码一个
蛋白类激发子袁核盘菌角质酶同样能够诱导植物产
生抗病性遥 同时还发现袁重组蛋白 匀蚤泽鄄杂泽悦怎贼的异源
表达受温度和时间的影响袁该蛋白在 猿园 益诱导 猿 澡
得到的粗蛋白最多遥 角质酶是一种诱导酶袁只有在
角质存在的条件下才能诱导微生物角质酶基因的表
达咱圆愿暂 袁冉琴琴等咱圆愿暂优化了棉花枯萎病菌角质酶的
诱导条件并得到了高浓度角质酶曰此外袁阅藻灶蚤泽藻 等咱圆怨暂
发现橄榄油可以诱导构巢曲霉角质酶基因的表达袁
但关于核盘菌菌株中角质酶产生条件的报道较少袁
还有待进一步研究遥 有研究发现角质酶的降解产物
几丁质单体具有激发拟南芥 粤则葬遭蚤凿燥责泽蚤泽 贼澡葬造蚤葬灶葬 抗
性反应的能力咱猿园暂 袁类似的反应在水稻 韵则赠扎葬 泽葬贼蚤增葬咱猿员暂
上也被发现袁说明角质酶可能通过其酶活来激发植
物的抗性遥 而对于 匀蚤泽鄄杂泽悦怎贼 究竟是如何引起植物
的防卫反应袁及其理化性质还需要进一步的研究遥
参 考 文 献 渊砸藻枣藻则藻灶糟藻泽冤
咱员暂 孕怎则凿赠 蕴 匀援 杂糟造藻则燥贼蚤灶蚤葬 泽糟造藻则燥贼蚤燥则怎皂院 澡蚤泽贼燥则赠袁 凿蚤泽藻葬泽藻 葬灶凿 泽赠皂责鄄
贼燥皂葬贼燥造燥早赠袁 澡燥泽贼 则葬灶早藻袁 早藻燥早则葬责澡蚤糟 凿蚤泽贼则蚤遭怎贼蚤燥灶 葬灶凿 蚤皂责葬糟贼援
孕澡赠贼燥责葬贼澡燥造燥早赠袁 员怨苑怨袁 远怨院 愿苑缘 原 愿愿园
咱圆暂 陈桂华援 油菜病害的发生与防治援 农药袁 员怨怨远袁 猿缘 渊怨冤院
圆员 原 圆猿
咱猿暂 郭学兰袁 江木兰袁 胡小加援 油菜菌核病分子诊断的初步研
究援 中国油料作物学报袁 圆园园猿袁 圆缘渊猿冤院 远源 原 远远
咱源暂 蕴怎 郧 匀援 耘灶早蚤灶藻藻则蚤灶早 杂糟造藻则燥贼蚤灶蚤葬 泽糟造藻则燥贼蚤燥则怎皂 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 蚤灶 燥蚤造鄄
泽藻藻凿 糟则燥责泽援 粤枣则蚤糟葬灶 允燥怎则灶葬造 燥枣 月蚤燥贼藻糟澡灶燥造燥早赠袁 圆园园猿袁 圆渊员圆冤院
缘园怨 原 缘员远
咱缘暂 齐永霞袁 陈方新袁 苏贤岩袁 等援 安徽省油菜菌核病菌对多菌
灵的抗药性监测援 中国农学通报袁 圆园园远袁 圆圆渊怨冤院 猿苑员 原 猿苑猿
缘猿远缘 期 吴摇 群等院 核盘菌激发子基因 杂泽悦怎贼克隆尧原核表达及纯化
咱远暂 秦虎强袁 高小宁袁 左叶信袁 等援 不同药剂和农业措施对油菜
菌核病的防治研究援 西北农业学报袁 圆园员员袁 圆园渊源冤院 员苑猿 原
员苑愿
咱苑暂 郑露袁 丁颜敏袁 姜道宏袁 等援 生防菌盾壳霉 在杂鄄员 菌株对油
菜菌核病的田间防治效果援 植物保护学报袁 圆园员圆袁 猿怨渊圆冤院
怨苑 原 怨愿
咱愿暂 悦澡藻灶早 允袁 允蚤葬灶早 阅袁 再蚤 载袁 藻贼 葬造援 孕则燥凿怎糟贼蚤燥灶袁 泽怎则增蚤增葬造 葬灶凿 藻枣枣蚤糟葬糟赠
燥枣 悦燥灶蚤燥贼澡赠则蚤怎皂 皂蚤灶蚤贼葬灶泽 糟燥灶蚤凿蚤葬 责则燥凿怎糟藻凿 蚤灶 泽澡葬噪藻灶 造蚤择怎蚤凿 糟怎造鄄
贼怎则藻援 云耘酝杂 酝蚤糟则燥遭蚤燥造燥早赠 蕴藻贼贼藻则泽袁 圆园园猿袁 圆圆苑渊员冤院 员圆苑 原 员猿员
咱怨暂 韩立荣袁 张华姣袁 高保卫袁 等援 放线菌 员员鄄猿鄄员对油菜菌核病
的防治作用与菌株鉴定援 植物保护学报袁 圆园员圆袁 猿怨渊圆冤院
怨苑 原 员园圆
咱员园暂 赵继红袁 孙淑君袁 李建中援 植物诱导抗病性与诱抗剂研究
进展援 植物保护袁 圆园园猿袁 圆怨渊源冤院 苑 原 员园
咱员员暂 运造葬则扎赠灶泽噪蚤 韵袁 孕造藻泽泽藻 月袁 允燥怎遭藻则贼 允 酝袁 藻贼 葬造援 蕴蚤灶藻葬则 茁鄄员袁猿 早造怎鄄
糟葬灶泽 葬则藻 藻造蚤糟蚤贼燥则泽 燥枣 凿藻枣藻灶泽藻 则藻泽责燥灶泽藻泽 蚤灶 贼燥遭葬糟糟燥援 孕造葬灶贼 孕澡赠泽蚤鄄
燥造燥早赠袁 圆园园园袁 员圆源渊猿冤院 员园圆苑 原 员园猿愿
咱员圆暂 晕藻憎皂葬灶 酝 粤袁 增燥灶 砸燥藻责藻灶葬糟噪鄄蕴葬澡葬赠藻 耘袁 孕葬则则 粤袁 藻贼 葬造援 孕则蚤燥则
藻曾责燥泽怎则藻 贼燥 造蚤责燥责燥造赠泽葬糟糟澡葬则蚤凿藻 责燥贼藻灶贼蚤葬贼藻泽 藻曾责藻泽泽蚤燥灶 燥枣 责造葬灶贼
凿藻枣藻灶泽藻泽 蚤灶 则藻泽责燥灶泽藻 贼燥 遭葬糟贼藻则蚤葬援 栽澡藻 孕造葬灶贼 允燥怎则灶葬造袁 圆园园圆袁 圆怨
渊源冤院 源愿苑 原 源怨缘
咱员猿暂 悦则怎蚤糟噪泽澡葬灶噪 陨 粤 酝袁 孕藻则则蚤灶 阅 砸援 栽澡藻 蚤泽燥造葬贼蚤燥灶 葬灶凿 责葬则贼蚤葬造 糟澡葬鄄
则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 皂燥灶蚤造蚤糟燥造蚤灶 粤院 葬 责燥造赠责藻责贼蚤凿藻 憎蚤贼澡 责葬泽藻燥造造蚤灶鄄
蚤灶凿怎糟蚤灶早 葬糟贼蚤增蚤贼赠 枣则燥皂 酝燥灶蚤造蚤灶蚤葬 枣则怎糟贼蚤糟燥造葬援 蕴蚤枣藻 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁
员怨远愿袁 苑院 源源怨 原 源缘远
咱员源暂 郭泽建袁 蒋冬花援 植物病原菌激发子与信号识别机理援 浙
江师范大学学报渊自然科学版冤袁 圆园园猿袁 圆远渊员冤院 员 原 苑
咱员缘暂 酝怎噪澡藻则躁藻藻 粤袁 悦怎蚤 再袁 蕴蚤怎 再袁 藻贼 葬造援 酝燥造藻糟怎造葬则 糟澡葬则葬糟贼藻则蚤扎葬贼蚤燥灶
葬灶凿 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 耘则憎蚤灶蚤葬 糟葬则燥贼燥增燥则葬 澡则责晕耘糟糟 早藻灶藻袁 憎澡蚤糟澡
藻灶糟燥凿藻泽 葬灶 藻造蚤糟蚤贼燥则 燥枣 贼澡藻 澡赠责藻则泽藻灶泽蚤贼蚤增藻 则藻葬糟贼蚤燥灶援 酝燥造藻糟怎造葬则
孕造葬灶贼鄄酝蚤糟则燥遭藻 陨灶贼藻则葬糟贼蚤燥灶泽袁 员怨怨苑袁 员园渊源冤院 源远圆 原 源苑员
咱员远暂 宰藻蚤 在 酝袁 蕴葬遭赠 砸 允袁 在怎皂燥枣枣 悦 匀袁 藻贼 葬造援 匀葬则责蚤灶袁 藻造蚤糟蚤贼燥则 燥枣
贼澡藻 澡赠责藻则泽藻灶泽蚤贼蚤增藻 则藻泽责燥灶泽藻 责则燥凿怎糟藻凿 遭赠 贼澡藻 责造葬灶贼 责葬贼澡燥早藻灶 耘则鄄
憎蚤灶蚤葬 葬皂赠造燥增燥则葬援 杂糟蚤藻灶糟藻袁 员怨怨圆袁 圆缘苑院 愿缘 原 愿愿
咱员苑暂 李云峰袁 王振中袁 贾显禄援 稻瘟病菌 远远 噪阅葬糖蛋白激发子
的纯化及性质研究援 植物病理学报袁 圆园园源袁 猿圆 渊圆 冤院
员圆苑 原 员猿圆
咱员愿暂 在澡葬灶早 匀 允袁 云葬灶早 匝袁 在澡葬灶早 在 郧袁 藻贼 葬造援 栽澡藻 则燥造藻 燥枣 则藻泽责蚤则葬贼燥则赠
遭怎则泽贼 燥曾蚤凿葬泽藻 澡燥皂燥造燥早泽 蚤灶 藻造蚤糟蚤贼燥则鄄蚤灶凿怎糟藻凿 泽贼燥皂葬贼葬造 糟造燥泽怎则藻 葬灶凿
澡赠责藻则泽藻灶泽蚤贼蚤增藻 则藻泽责燥灶泽藻 蚤灶 晕蚤糟燥贼蚤葬灶葬 遭藻灶贼澡葬皂蚤葬灶葬援 允燥怎则灶葬造 燥枣
耘曾责藻则蚤皂藻灶贼葬造 月燥贼葬灶赠袁 圆园园怨袁 远园院 猿员园怨 原 猿员圆圆
咱员怨暂 在澡葬灶早 匀 允袁 阅燥灶早 杂 酝袁 宰葬灶早 酝 云袁 藻贼 葬造援 栽澡藻 则燥造藻 燥枣 增葬糟怎燥造葬则
责则燥糟藻泽泽蚤灶早 藻灶扎赠皂藻 渊灾孕耘冤 枣则燥皂 晕蚤糟燥贼蚤葬灶葬 遭藻灶贼澡葬皂蚤葬灶葬 蚤灶 藻造蚤糟鄄
蚤贼燥则鄄贼则蚤早早藻则藻凿 澡赠责藻则泽藻灶泽蚤贼蚤增藻 则藻泽责燥灶泽藻 葬灶凿 泽贼燥皂葬贼葬造 糟造燥泽怎则藻援
允燥怎则灶葬造 燥枣 耘曾责藻则蚤皂藻灶贼葬造 月燥贼葬灶赠袁 圆园员园袁 远员院 猿苑怨怨 原 猿愿员圆
咱圆园暂 在澡葬灶早 匀 允袁 蕴蚤 阅 匝袁 宰葬灶早 酝 云袁 藻贼 葬造援 栽澡藻 晕蚤糟燥贼蚤葬灶葬 遭藻灶贼澡葬鄄
皂蚤葬灶葬 皂蚤贼燥早藻灶鄄葬糟贼蚤增葬贼藻凿 责则燥贼藻蚤灶 噪蚤灶葬泽藻 糟葬泽糟葬凿藻 葬灶凿 宰砸运再
贼则葬灶泽糟则蚤责贼蚤燥灶 枣葬糟贼燥则 责葬则贼蚤糟蚤责葬贼藻 蚤灶 晕藻责员酝燥 鄄贼则蚤早早藻则藻凿 责造葬灶贼 则藻鄄
泽责燥灶泽藻泽援 酝燥造藻糟怎造葬则 孕造葬灶贼 原 酝蚤糟则燥遭藻 陨灶贼藻则葬糟贼蚤燥灶泽袁 圆园员圆袁 圆缘院
员远猿怨 原 员远缘猿
咱圆员暂 在澡葬灶早 匀 允袁 宰葬灶早 酝 云袁 宰葬灶早 宰袁 藻贼 葬造援 杂蚤造藻灶糟蚤灶早 燥枣 郧 责则燥鄄
贼藻蚤灶泽 怎灶糟燥增藻则泽 凿蚤增藻则泽蚤枣蚤藻凿 责造葬灶贼 则藻泽责燥灶泽藻泽 憎澡藻灶 糟澡葬造造藻灶早藻凿 遭赠
贼澡则藻藻 藻造蚤糟蚤贼燥则泽 蚤灶 晕蚤糟燥贼蚤葬灶葬 遭藻灶贼澡葬皂蚤葬灶葬援 孕造葬灶贼袁 悦藻造造 驭 耘灶增蚤鄄
则燥灶皂藻灶贼袁 圆园员圆袁 猿缘渊员冤院 苑圆 原 愿缘
咱圆圆暂 张宏明袁 蔡以滢袁 陈珈援 孕澡赠贼燥责澡贼澡燥则葬 责葬造皂蚤分泌的 员园郾 远 噪阅
蛋白激发烟草的过敏反应援 植物学报袁 员怨怨怨袁 源员渊员员冤院
员员愿猿 原 员员愿远
咱圆猿暂 孕蚤燥 栽 云袁 酝葬糟藻凿燥 郧 粤援 悦怎贼蚤灶葬泽藻泽院 责则燥责藻则贼蚤藻泽 葬灶凿 蚤灶凿怎泽贼则蚤葬造
葬责责造蚤糟葬贼蚤燥灶泽援 粤凿增葬灶糟藻泽 蚤灶 粤责责造蚤藻凿 酝蚤糟则燥遭蚤燥造燥早赠袁 圆园园怨袁 远远院
苑苑 原 怨缘
咱圆源暂 杂葬则噪蚤泽泽蚤葬灶 晕袁 阅葬则遭蚤灶赠葬灶 粤袁 韵贼贼藻 允袁 藻贼 葬造援 责圆苑杂允袁 葬 灶燥增藻造 责则燥鄄
贼藻蚤灶 蚤灶 杂贼 允燥澡灶爷 泽 宰燥则贼袁 贼澡葬贼 泽怎责责则藻泽泽藻泽 藻曾责则藻泽泽蚤燥灶 燥枣 匀陨灾鄄员
早藻灶燥皂藻援 郧藻灶藻 栽澡藻则葬责赠袁 圆园园远袁 员猿院 圆愿愿 原 圆怨缘
咱圆缘暂 蕴蚤 阅袁 粤泽澡遭赠 粤 酝袁 允燥澡灶泽贼燥灶藻 运援 酝燥造藻糟怎造葬则 藻增蚤凿藻灶糟藻 贼澡葬贼 贼澡藻
藻曾贼则葬糟藻造造怎造葬则 糟怎贼蚤灶葬泽藻 孕遭糟员 蚤泽 则藻择怎蚤则藻凿 枣燥则 责葬贼澡燥早藻灶蚤糟蚤贼赠 燥枣
孕赠则藻灶燥责藻扎蚤扎葬 遭则葬泽泽蚤糟葬藻 燥灶 燥蚤造泽藻藻凿 则葬责藻援 酝燥造藻糟怎造葬则 孕造葬灶贼 酝蚤鄄
糟则燥遭藻 陨灶贼藻则葬糟贼蚤燥灶泽袁 圆园园猿袁 员远渊远冤院 缘源缘 原 缘缘圆
咱圆远暂 孕葬则噪藻则 阅 酝袁 运觟造造藻则 宰援 悦怎贼蚤灶葬泽藻 葬灶凿 燥贼澡藻则 造蚤责燥造赠贼蚤糟 藻泽贼藻则葬泽藻泽
责则燥贼藻糟贼 遭藻葬灶 造藻葬增藻泽 枣则燥皂 蚤灶枣藻糟贼蚤燥灶 遭赠 砸澡蚤扎燥糟贼燥灶蚤葬 泽燥造葬灶蚤援 酝燥鄄
造藻糟怎造葬则 孕造葬灶贼 酝蚤糟则燥遭藻 陨灶贼藻则葬糟贼蚤燥灶泽袁 员怨怨愿袁 员员院 缘员源 原 缘圆圆
咱圆苑暂 李江华袁 刘龙袁 陈晟袁 等援 角质酶的研究进展援 生物工程
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