全 文 ：第 源员 卷摇 第 圆 期
圆园员源 年 源 月
植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报
粤悦栽粤 孕匀再栽韵孕匀再蕴粤悦陨悦粤 杂陨晕陨悦粤
灾燥造援 源员摇 晕燥援 圆
粤责则援 摇 圆园员源
摇
基金项目院 国家自然科学基金渊猿园苑苑员源猿缘袁猿园怨苑员怨缘圆袁猿员圆园园园远怨冤
作者简介院 黄秋斌袁男袁员怨愿愿年生袁硕士研究生袁研究方向为资源与应用微生物袁 耘鄄皂葬蚤造院 澡藻灶怎澡择遭岳 员圆远援 糟燥皂
鄢通讯作者渊粤怎贼澡燥则 枣燥则 糟燥则则藻泽责燥灶凿藻灶糟藻冤袁 耘鄄皂葬蚤造院 憎葬灶早早岳 澡藻灶怎援 藻凿怎援 糟灶袁 栽藻造院 园猿苑员 原 圆猿愿愿缘园圆远
收稿日期院 圆园员猿 原 园苑 原 园苑
责泽藻孕基因对蜡样芽胞杆菌 园鄄怨菌株生物薄膜
形成和防治小麦纹枯病的影响
黄秋斌员 摇 许玉彬员 摇 童摇 琰员 摇 王摇 淼员 摇 张摇 颖圆 摇 王摇 刚员袁圆鄢
渊员援河南大学生命科学学院袁 开封 源苑缘园园源曰 圆援河南大学生物工程研究所袁 开封 源苑缘园园源冤
摘要院 为了阐明芽胞杆菌 园鄄怨 菌株的生防机制袁通过敲除 园鄄怨 菌株的多糖外运蛋白编码基因 责泽藻孕
构建基因敲除菌株 园鄄怨渊驻责泽藻孕冤和基因敲除菌株的互补菌株 园鄄怨渊驻责泽藻孕宜责泽藻孕冤袁并比较野生型 园鄄怨
菌株及其衍生菌株形成生物薄膜的能力及其对小麦纹枯病的生防效果遥 结果显示袁责泽藻孕 基因敲除
后袁菌株生物薄膜形成能力和对小麦纹枯病的生防作用降低袁生防效果较野生型 园鄄怨 菌株降低
源猿援 远豫 遥 基因互补后袁互补菌株生物薄膜的形成能力和对小麦纹枯病的生防作用得到恢复袁生防效
果较敲除菌株提高 圆怨援 圆豫 遥 研究表明蜡样芽胞杆菌 园鄄怨 菌株的 责泽藻孕基因参与了生防菌株 园鄄怨 生物
薄膜的形成和对小麦纹枯病的生物防治遥
关键词院 生物防治曰 生物薄膜曰 蜡样芽胞杆菌曰 小麦纹枯病
耘枣枣藻糟贼泽 燥枣 责泽藻孕 早藻灶藻 燥灶 月葬糟蚤造造怎泽 糟藻则藻怎泽 园鄄怨 遭蚤燥枣蚤造皂 枣燥则皂葬贼蚤燥灶 葬灶凿
蚤贼泽 糟燥灶贼则燥造 贼燥 憎澡藻葬贼 泽澡葬则责 藻赠藻泽责燥贼
匀怎葬灶早 匝蚤怎遭蚤灶员 摇 载怎 再怎遭蚤灶员 摇 栽燥灶早 再葬灶员 摇 宰葬灶早 酝蚤葬燥员 摇 在澡葬灶早 再蚤灶早圆 摇 宰葬灶早 郧葬灶早员袁 圆鄢
渊员援 悦燥造造藻早藻 燥枣 蕴蚤枣藻 杂糟蚤藻灶糟藻泽袁 匀藻灶葬灶 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 运葬蚤枣藻灶早 源苑缘园园源袁 匀藻灶葬灶 孕则燥增蚤灶糟藻袁 悦澡蚤灶葬曰 圆援 陨灶泽贼蚤贼怎贼藻 燥枣
月蚤燥藻灶早蚤灶藻藻则蚤灶早袁 匀藻灶葬灶 哉灶蚤增藻则泽蚤贼赠袁 运葬蚤枣藻灶早 源苑缘园园源袁 匀藻灶葬灶 孕则燥增蚤灶糟藻袁 悦澡蚤灶葬冤
粤遭泽贼则葬糟贼院 栽燥 藻造怎糟蚤凿葬贼藻 遭蚤燥造燥早蚤糟葬造 糟燥灶贼则燥造 皂藻糟澡葬灶蚤泽皂 燥枣 月葬糟蚤造造怎泽 糟藻则藻怎泽 园鄄怨 贼燥 憎澡藻葬贼 泽澡葬则责 藻赠藻泽责燥贼袁
责燥造赠泽葬糟糟澡葬则蚤凿藻 藻曾责燥则贼 责则燥贼藻蚤灶 藻灶糟燥凿蚤灶早 早藻灶藻 责泽藻孕 憎葬泽 噪灶燥糟噪藻凿 燥怎贼 枣则燥皂 早藻灶燥皂藻 燥枣 园鄄怨 泽贼则葬蚤灶 葬灶凿 责泽藻孕
凿藻造藻贼蚤燥灶 皂怎贼葬灶贼 园鄄怨 渊驻责泽藻孕冤 葬灶凿 葬 责泽藻孕 糟燥皂责造藻皂藻灶贼葬贼蚤燥灶 泽贼则葬蚤灶 园鄄怨 渊驻责泽藻孕宜责泽藻孕冤 憎藻则藻 糟燥灶泽贼则怎糟贼藻凿援
月蚤燥枣蚤造皂 枣燥则皂葬贼蚤燥灶 憎藻则藻 葬泽泽葬赠藻凿 憎蚤贼澡 园鄄怨 葬灶凿 蚤贼泽 凿藻则蚤增葬贼蚤增藻 泽贼则葬蚤灶泽 葬灶凿 贼澡藻 则藻泽怎造贼泽 泽澡燥憎藻凿 遭蚤燥枣蚤造皂 枣燥则皂葬贼蚤燥灶
皂葬泽泽 燥枣 责泽藻孕 早藻灶藻 凿藻造藻贼蚤燥灶 皂怎贼葬灶贼 园鄄怨 渊驻责泽藻孕冤 则藻凿怎糟藻凿 泽蚤早灶蚤枣蚤糟葬灶贼造赠 贼澡葬灶 贼澡葬贼 燥枣 憎蚤造凿 贼赠责藻 园鄄怨援 月蚤燥枣蚤造皂
枣燥则皂葬贼蚤燥灶 蚤灶 糟燥皂责造藻皂藻灶贼葬贼蚤燥灶 泽贼则葬蚤灶 园鄄怨 渊驻责泽藻孕宜责泽藻孕冤 则藻糟燥增藻则藻凿 贼燥 贼澡葬贼 燥枣 憎蚤造凿 贼赠责藻 造藻增藻造援 月蚤燥造燥早蚤糟葬造
糟燥灶贼则燥造 贼燥 憎澡藻葬贼 泽澡葬则责 藻赠藻泽责燥贼 憎蚤贼澡 园鄄怨 葬灶凿 蚤贼泽 凿藻则蚤增葬贼蚤增藻泽 泽澡燥憎藻凿 贼澡葬贼 贼澡藻 糟燥灶贼则燥造 藻枣枣蚤糟蚤藻灶糟赠 燥枣 园鄄怨
渊驻责泽藻孕冤 则藻凿怎糟藻凿 源猿援 远豫 糟燥皂责葬则藻凿 贼燥 贼澡葬贼 燥枣 蚤贼泽 憎蚤造凿 贼赠责藻 园鄄怨 葬灶凿 糟燥灶贼则燥造 藻枣枣蚤糟蚤藻灶糟赠 蚤灶糟则藻葬泽藻凿 圆怨援 圆豫
葬枣贼藻则 早藻灶藻 糟燥皂责造藻皂藻灶贼葬贼蚤燥灶援 栽澡藻 则藻泽怎造贼泽 蚤灶凿蚤糟葬贼藻凿 早藻灶藻 责泽藻孕 蚤灶增燥造增藻凿 蚤灶 遭蚤燥枣蚤造皂 枣燥则皂葬贼蚤燥灶 蚤灶 泽贼则葬蚤灶 园鄄怨
葬灶凿 遭蚤燥造燥早蚤糟葬造 糟燥灶贼则燥造 葬早葬蚤灶泽贼 憎澡藻葬贼 泽澡葬则责 藻赠藻泽责燥贼援
运藻赠 憎燥则凿泽院 遭蚤燥造燥早蚤糟葬造 糟燥灶贼则燥造曰 遭蚤燥枣蚤造皂曰 月葬糟蚤造造怎泽 糟藻则藻怎泽曰 憎澡藻葬贼 泽澡葬则责 藻赠藻泽责燥贼
摇 摇 小麦纹枯病渊憎澡藻葬贼 泽澡葬则责 藻赠藻泽责燥贼冤是一种严重
危害小麦生长的土传病害袁广泛分布于中国各小麦
产区咱员暂 遥 纹枯病菌具有抗逆性强尧寄主范围广等特
点袁生产上尚缺乏有效的抗病品种袁病害的防治主要
施用井冈霉素等杀菌剂袁但防治效果不理想且容易
出现抗药性菌株咱圆暂 遥 利用植物根际或者植物内生
细菌防治土传病害具有潜在的应用价值袁已受到国
内外广泛关注咱猿暂 遥
生物薄膜是微生物在自然状态下的一种存在方
式咱源暂 遥 生物薄膜的形成有利于提高微生物对于生
物胁迫或者非生物胁迫的抗性袁从而提高其生存能
力咱缘暂 遥 有研究表明袁构成细菌生物薄膜的胞外多聚
物包含胞外多糖和蛋白等多种成分咱远 原 苑暂 遥 胞外多糖
在细菌生物薄膜的形成中发挥了重要作用遥 在枯草
芽胞杆菌 月葬糟蚤造造怎泽 泽怎遭贼蚤造蚤泽 中袁已经发现多个多糖合
成基因如编码磷酸己糖变位酶基因 赠澡曾月尧编码糖基
转移酶基因 赠增藻匝 和荚膜多糖合成基因 赠增藻砸 等参与
生物薄膜的形成咱愿 原 怨暂 遥 在蜡样芽胞杆菌 月援 糟藻则藻怎泽
中袁发现含有 员苑 个结构基因的操纵子参与胞外多糖
的生物合成袁该操纵子突变后袁细菌生物薄膜缺
失咱员园暂 遥 虽然多项研究证明了芽胞杆菌中多个功能
基因参与胞外多糖的合成袁但是多糖合成后的转运
是否参与生物薄膜的形成尚未见报道遥 因此袁研究
胞外多糖转运在生物薄膜形成中的作用袁不仅有助
于进一步解析生物薄膜的形成机制袁而且对于研究
生防细菌的定殖机制以及生防细菌对于植物病害的
作用机制具有重要意义遥
蜡样芽胞杆菌 园鄄怨 菌株是本课题组在前期研究
中分离得到的一株小麦内生细菌袁该菌株对于小麦
纹枯病具有较好的防治效果袁已获得国家发明专利遥
为了进一步解析 园鄄怨 菌株的生防机制袁本课题组通
过构建转座子 栽灶再蕴月鄄员 插入突变体库袁筛选出一系
列生物薄膜产生变异的突变株咱员员暂 袁其中一个突变株
的生物薄膜形成量较野生型 园鄄怨 菌株显著降低袁通
过分析转座子插入位点的侧翼序列袁发现转座子插
入到多糖外运蛋白的编码基因 责泽藻孕袁因此袁推测多糖
外运蛋白基因可能参与 园鄄怨 菌株生物薄膜的形成遥
为了明确多糖外运蛋白基因 责泽藻孕 与生物薄膜的关
系袁本研究通过构建 责泽藻孕基因缺失突变株及其互补
菌株袁比较不同菌株生物薄膜形成的差别袁以及不同
菌株防治小麦纹枯病的效果遥
员 材料与方法
员援 员 材料
小麦品种中国春来自河南省农业科学院植物保
护研究所袁由本实验室扩繁保存遥 小麦纹枯病菌
砸澡蚤扎燥糟贼燥灶蚤葬 糟藻则藻葬造蚤泽由本实验室分离保存曰蜡样芽胞
杆菌 月援 糟藻则藻怎泽 园鄄怨 及其衍生菌株尧大肠杆菌 耘泽糟澡藻鄄
则蚤糟澡蚤葬 糟燥造蚤 阅匀缘琢和 郧酝圆员远猿 在含有 猿园豫甘油的 蕴月
培养基中于 原 愿园益 条件下长期保存遥 穿梭质粒
责酝粤阅咱员圆暂由日本 栽泽怎噪怎遭葬 大学的 运葬扎怎赠葬 酝燥则蚤噪葬憎葬
先生惠赠袁 用于基因敲除载体的构建曰 质粒
责粤阅员圆猿咱员猿暂来自美国俄亥俄州立大学芽胞杆菌遗传
保藏中心渊月葬糟蚤造造怎泽 郧藻灶藻贼蚤糟 杂贼燥糟噪 悦藻灶贼藻则袁 月郧杂悦冤袁用
于基因互补载体的构建遥 试验用抗生素为 员园园 滋早 辕 皂蕴
氨苄青霉素渊葬皂责蚤糟蚤造造蚤灶冤尧员园 滋早 辕 皂蕴 红霉素渊藻则赠贼澡则燥鄄
皂赠糟蚤灶冤尧圆缘 滋早 辕 皂蕴 氯霉素渊 糟澡造燥则葬皂责澡藻灶蚤糟燥造冤遥 琼脂
糖凝胶 阅晕粤 回收试剂盒尧内切酶尧栽源 阅晕粤 连接酶尧
栽葬择酶尧载鄄郧葬造购自立陶宛 云藻则皂藻灶贼葬泽公司曰十二烷基
硫酸钠渊泽燥凿蚤怎皂 凿燥凿藻糟赠造 泽怎造枣葬贼藻袁 杂阅杂冤和羧甲基纤维
素购自美国 粤皂则藻泽糟燥公司遥 蜡样芽胞杆菌和大肠杆
菌常规培养采用 蕴月 培养基曰生物薄膜测定采用
杂杂酝培养基咱员源暂 曰小麦纹枯病菌培养采用 孕阅粤 和麦
粒沙培养基咱员员暂 遥
员援 圆 方法
员援 圆援 员 责泽藻孕基因敲除载体的构建
抽提细菌 园鄄怨 的基因组 阅晕粤袁以 阅晕粤 为模板袁
扩增出 责泽藻孕 基因的上游侧翼序列渊上游引物 哉杂院
悦悦粤粤郧郧粤栽悦悦郧郧栽栽栽粤郧郧粤粤栽郧郧粤粤郧郧粤栽悦袁 月葬皂匀玉
位 点曰 下 游 引 物 哉粤院 粤郧悦悦郧粤粤栽栽悦郧悦郧悦栽栽粤鄄
粤栽粤悦栽栽栽栽郧栽粤粤悦郧袁耘糟燥砸玉位点冤和 责泽藻孕 基因的下
游侧翼序列渊上游引物 阅杂院粤粤郧郧郧粤粤栽栽悦郧郧粤粤悦鄄
悦郧栽栽粤栽郧粤粤粤悦粤粤郧粤郧袁 耘糟燥砸 玉 位点曰 下游引物
阅粤院粤粤悦悦郧栽悦郧粤悦粤栽栽栽郧悦粤粤栽悦粤悦栽栽悦粤栽悦粤郧袁杂葬造玉
位点冤遥 分别利用 耘糟燥砸玉酶切上游侧翼序列和下游
侧翼序列袁将两个片段用 栽源 阅晕粤 连接酶连接袁以连
接产物为模板袁利用上游序列的正向引物 哉杂 和下
游序列的反向引物 阅粤 扩增出上下游片段袁将此片
段分别用 月葬皂匀玉和 杂葬造玉双酶切袁回收后插入到含
有热敏感复制子的穿梭质粒 责酝粤阅 多克隆位点的
月葬皂匀玉和 杂葬造玉之间袁电击转化大肠杆菌 郧酝圆员远猿
感受态细胞袁构建 责泽藻孕 的基因敲除载体 责酝粤阅鄄
驻责泽藻孕遥
员援 圆援 圆 责泽藻孕基因敲除
参考 粤则灶葬怎凿等咱员圆暂的方法进行基因敲除遥 由于
基因敲除载体 责酝粤阅鄄驻责泽藻孕 为穿梭质粒袁能够同时
在大肠杆菌和蜡样芽胞杆菌中复制渊温度敏感复制
子 燥则蚤耘员怨源贼泽冤遥 温度敏感复制子的存在袁导致该质
粒在超过 源园益的条件下不能复制遥 基因敲除时袁首
先将基因敲除载体 责酝粤阅鄄驻责泽藻孕 电击转化导入 园鄄怨
感受态细胞袁涂布含有 员园园 滋早 辕 皂蕴 载鄄郧葬造和 猿 滋早 辕 皂蕴
红霉素的 蕴月平板袁猿园 益培养 圆源 澡后袁挑取蓝色菌落
渊成功转化后获得的转化子冤遥 此时袁敲除载体
责酝粤阅鄄驻责泽藻孕 游离于细胞中遥 然后袁挑取蓝色菌落
接入含有红霉素的 蕴月 液体培养基中袁猿园 益振荡培
养至 韵阅远园园 越 园援 员袁置于 源圆 益继续振荡培养 远 澡袁涂布
苑猿圆圆 期 黄秋斌等院责泽藻孕基因对蜡样芽胞杆菌 园鄄怨 菌株生物薄膜形成和防治小麦纹枯病的影响
含有 载鄄早葬造和红霉素的 蕴月平板袁源圆 益培养过夜获得
菌落渊敲除载体自杀后整合到基因组后的单交换菌
株冤遥 最后袁挑取菌落袁接入不含抗生素的 蕴月 液体
培养基中袁猿园 益振荡培养 员圆 澡袁涂布仅含有 载鄄早葬造 的
蕴月平板袁猿园 益培养过夜遥 由于部分二倍体的存在袁
出现第 圆 次交换遥 筛选出的白色菌落袁即为预期的
双交换基因缺失菌株遥
抽提基因敲除菌株的基因组 阅晕粤袁以该 阅晕粤
为模板袁利用上游序列的正向引物 哉杂 和下游序列
的反向引物 阅粤进行扩增袁扩增出的片段经测序后袁
利用 晕悦月陨中的 月蕴粤杂栽同源性分析蜡样芽胞杆菌基
因组袁确认目的基因的敲除情况袁获得 责泽藻孕 基因缺
失菌株遥
员援 圆援 猿 责泽藻孕基因互补载体的构建与基因反向互补
利用 匀蚤灶凿 芋 和 月葬皂匀 玉 双酶切穿梭载体
责粤阅员圆猿袁去除绿色荧光蛋白渊郧云孕冤的编码序列袁然
后合成含有 匀蚤灶凿芋和 月葬皂匀玉的接头袁将该接头用
上述两种内切酶酶切后袁连接到去除 早枣责 基因的
责粤阅员圆猿 中袁构建新的穿梭载体 责粤阅员圆猿鄄员遥 以野生
型 园鄄怨 菌株基因组 阅晕粤为模板袁扩增出 责泽藻孕基因及
其上游调控序列渊上游引物 糟燥皂鄄杂院悦悦郧粤郧郧粤栽悦悦
郧郧郧栽粤栽粤栽栽郧粤栽栽栽栽粤郧粤粤郧袁月葬皂匀玉位点曰下游引
物 糟燥皂鄄粤院 粤粤粤粤郧粤粤栽栽悦粤粤悦悦粤郧栽悦粤悦悦栽悦栽粤栽悦悦
粤悦袁耘糟燥砸玉位点冤袁将此片段利用 月葬皂匀玉和 耘糟燥砸
玉双酶切后袁插入到穿梭载体 责粤阅员圆猿鄄员 的对应位
点袁转化大肠杆菌 郧酝圆员远猿 感受态细胞袁构建 责泽藻孕
基因的反向互补载体 责粤阅员圆猿鄄员鄄责泽藻孕遥 将互补载体
电击转化 责泽藻孕敲除菌株袁构建 责泽藻孕基因敲除菌株的
互补菌株遥
员援 圆援 源 园鄄怨 及其衍生菌株的生物薄膜测定
分别挑取野生型 园鄄怨 菌株尧责泽藻孕 基因缺失菌株
和 责泽藻孕基因缺失菌株的互补菌株单菌落袁接种于
缘 皂蕴 蕴月液体培养基中袁猿园 益尧圆园园 则 辕 皂蚤灶摇床中培养
至对数期袁用 杂杂酝 培养基分别稀释菌液至 韵阅远园园 越园援 员袁取 圆园 滋蕴菌液加入含有 圆 皂蕴 杂杂酝 培养基的玻
璃管中渊直径 园援 愿 糟皂冤袁轻轻混匀后于 圆圆益静置培养
缘 凿袁观察不同菌株在玻璃管内壁生物薄膜的形成情
况遥 之后袁轻轻吸去每个管中的菌液袁注意不要触碰
管壁遥 然后向玻璃管中加入 员援 缘 皂蕴的蒸馏水袁轻轻
晃动袁再用枪头将蒸馏水吸出袁反复清洗 猿 次袁去除
管底菌体袁加入 圆援 缘 皂蕴 园援 员豫 渊憎 辕 增冤的结晶紫溶液袁
室温染色 圆园 皂蚤灶袁吸去染色液袁加入蒸馏水轻轻冲洗
猿 次袁直到水变为无色遥 加入 圆援 缘皂蕴 员园豫 杂阅杂袁反复
晃动试管溶解生物薄膜袁用 员园豫 杂阅杂 稀释 缘 倍袁吸
取 圆援 缘 皂蕴至比色皿中袁以 圆援 缘 皂蕴 员园豫 杂阅杂作对照袁
测定 韵阅缘怨园的光吸收值遥 每处理 愿 个重复袁试验重复猿 次遥
员援 圆援 缘 园鄄怨 及其衍生菌株对小麦纹枯病的生防作用
配制 孕阅粤培养基袁将 孕阅粤加热融化后取 猿园 皂蕴
加入到 员园园 皂蕴小烧杯中袁然后竖直放入木质牙签袁
封口灭菌遥 将斜面保存的小麦纹枯病菌接种 孕阅粤
平板袁置于 圆圆 益培养 苑 凿袁打菌饼渊直径 园援 缘 糟皂冤袁把
菌饼放入含有 孕阅粤 和牙签的烧杯中袁圆圆 益培养约
员园 凿袁直到病菌菌丝均匀扩散到每个牙签上袁置于
源 益冰箱备用遥
利用 蕴月液体培养基培养 园鄄怨 及其衍生菌株袁离
心去除上清后袁加入 员豫的羧甲基纤维素钠袁调整浓
度至 韵阅远园园 越 员援 缘袁将已经催芽的小麦种子浸入菌液
中 员 澡袁播种至盛有无菌土的一次性塑料杯中袁每个
杯子中央播种 猿 粒种子袁种子周围插入 猿 根含有菌
丝的牙签袁同时设置插入无菌牙签渊阴性对照冤和不
用细菌处理的种子渊阳性对照冤遥 将各处理随机放
入 圆圆 益培养室内培养袁每隔 苑 凿 浇水 员 次遥 圆员 凿 后
取出麦苗袁参考 悦造葬则噪泽燥灶 驭 悦燥燥噪咱员缘暂的方法进行调
查袁统计病害的严重度遥 每处理 员缘 个重复袁试验重
复 猿 次遥 计算不同菌株处理后的防治效果遥 防治效
果渊豫 冤 越 渊对照的严重度 原处理的严重度冤 辕对照的
严重度 伊员园园遥
员援 猿 数据分析
数据采用 酝蚤糟则燥泽燥枣贼 耘曾糟藻造 圆园园猿 进行统计袁杂粤杂
愿援 园 进行方差分析袁并用 阅怎灶糟葬灶 氏新复极差法进行
差异显著性检验遥
圆 结果与分析
圆援 员摇 责泽藻孕基因敲除载体的构建与基因敲除
以野生型 园鄄怨 菌株基因组 阅晕粤 为模板袁分别扩
增出 责泽藻孕上游 员员猿远 遭责的片段和下游 员员园远 遭责的片段遥
测序后袁通过 月蕴粤杂栽 与蜡样芽胞杆菌 粤栽悦悦员源缘苑怨
全基因组序列渊晕悦赃园园源苑圆圆援 员冤进行同源性比对袁发
现上游序列位于 责泽藻孕 基因起始密码 粤栽郧渊垣 员冤的
原员园缘猿 耀 垣 愿猿 处袁下游序列位于 责泽藻孕基因起始密码
粤栽郧渊 垣员冤的 垣 员缘源员 耀 垣 圆远源苑 处袁表明 责泽藻孕 上下游
片段克隆成功遥 在此基础上袁利用 耘糟燥砸玉分别酶切
上下游片段袁经 栽源 连接酶连接后袁由 孕悦砸 扩增出圆援 圆 噪遭片段袁该片段经 月葬皂匀玉和 杂葬造玉双酶切袁连
接到 责酝粤阅袁成功构建 责泽藻孕 基因敲除载体 责酝粤阅鄄
驻责泽藻孕渊图 员冤遥 载体大小为 员员 怨园愿 遭责袁具有氨苄青霉
素和红霉素的抗性基因以及耐热 茁鄄半乳糖苷酶编
码基因袁同时具有能够在大肠杆菌中复制的复制子
愿猿圆 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源员 卷
和在蜡样芽胞杆菌中进行条件复制的温敏性复
制子遥
图 员 敲除载体 责酝粤阅鄄驻责泽藻孕质粒图谱
云蚤早援 员 孕澡赠泽蚤糟葬造 皂葬责 燥枣 早藻灶藻 噪灶燥糟噪鄄燥怎贼 增藻糟贼燥则 责酝粤阅鄄责泽藻孕
摇 摇 遭造葬院氨苄青霉素抗性编码基因曰藻则皂悦院红霉素抗性编码基因曰
燥则蚤耘员怨源贼泽院温度敏感型复制起点曰遭早葬月院耐热 茁鄄半乳糖苷酶编码
基因曰怎责泽藻孕和 凿责泽藻孕院基因组中 责泽藻孕基因上游和下游片段遥 遭造葬院
砸藻泽蚤泽贼葬灶贼 早藻灶藻 贼燥 葬皂责蚤糟蚤造造蚤灶曰 藻则皂悦院 则藻泽蚤泽贼葬灶糟藻 早藻灶藻 贼燥 藻则赠贼澡则燥皂赠糟蚤灶曰
燥则蚤耘员怨源贼泽院 贼澡藻则皂燥泽藻灶泽蚤贼蚤增藻 则藻责造蚤糟葬贼蚤燥灶 燥则蚤早蚤灶曰 遭早葬月院 早藻灶藻 藻灶糟燥凿蚤灶早
贼澡藻则皂燥泽贼葬遭造藻 茁鄄早葬造葬糟贼燥泽蚤凿葬泽藻曰 怎责泽藻孕 葬灶凿 凿责泽藻孕院 怎责 枣则葬早皂藻灶贼 燥枣 责泽藻孕
葬灶凿 凿燥憎灶 枣则葬早皂藻灶贼 燥枣 责泽藻孕 蚤灶 早藻灶燥皂藻援
摇 摇 抽提白色菌落基因组 阅晕粤袁利用 哉杂 和 阅粤 引
物扩增袁对 责泽藻孕基因敲除情况进行验证遥 同时以野
生型基因组 阅晕粤模板扩增作为对照遥 结果显示袁将
白色菌落扩增出的片段测序并进行 月蕴粤杂栽 比对袁敲
除菌株 责泽藻孕基因的开放阅读框渊韵砸云冤中 垣愿猿 耀 垣员缘源员
区域缺失袁缺失片段长度为 员 源缘怨 遭责渊责泽藻孕 韵砸云 长度
为 员 远园圆 遭责冤袁成功实现了对 园鄄怨 菌株 责泽藻孕 基因的敲
除渊图 圆冤遥
图 圆 蜡样芽胞杆菌 园鄄怨 菌株 责泽藻孕基因敲除的验证
云蚤早援 圆 陨凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 责泽藻孕 噪灶燥糟噪鄄燥怎贼 泽贼则葬蚤灶 枣则燥皂
月葬糟蚤造造怎泽 糟藻则藻怎泽 园鄄怨
摇 摇 酝院阅晕粤 皂葬则噪藻则曰员院园鄄怨 菌株基因组 责泽藻孕 基因连同其上下游
片段扩增片段曰圆院敲除菌株 园鄄怨渊驻责泽藻孕冤上下游扩增片段遥 酝院
阅晕粤 皂葬则噪藻则曰 员院 孕悦砸 葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 枣则葬早皂藻灶贼 燥枣 责泽藻孕 憎蚤贼澡 蚤贼泽 怎责 葬灶凿
凿燥憎灶 泽贼则藻葬皂 蚤灶 园鄄怨 泽贼则葬蚤灶曰 圆院 孕悦砸 葬皂责造蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 枣则葬早皂藻灶贼 燥枣 责泽藻孕 怎责
葬灶凿 凿燥憎灶 泽贼则藻葬皂 蚤灶 噪灶燥糟噪鄄燥怎贼 泽贼则葬蚤灶 园鄄怨渊驻责泽藻孕冤援
圆援 圆 责泽藻孕基因互补载体的构建与基因互补
从野生型菌株 园鄄怨 基因组 阅晕粤 中扩增出 责泽藻孕
基因的 韵砸云及其上游启动子 员援 愿 噪遭的片段袁对其进
行测序和 月蕴粤杂栽同源性比对袁该扩增序列与蜡样芽
胞杆菌 粤栽悦悦员源缘苑怨 全基因组序列渊晕悦赃园园源苑圆圆援 员冤
多糖外运蛋白编码基因 责泽藻孕 及其上游调控序列一
致遥 将此片段利用 月葬皂匀玉和 载澡燥玉双酶切袁连接到
责粤阅员圆猿鄄员 的对应位点袁构建互补载体 责粤阅员圆猿鄄员鄄
责泽藻孕渊图 猿冤遥 将互补载体电击转化 责泽藻孕基因敲除突
变体 园鄄怨渊驻责泽藻孕冤袁获得突变体 园鄄怨渊驻责泽藻孕冤的 责泽藻孕基
因反向互补菌株 园鄄怨渊驻责泽藻孕宜责泽藻孕冤遥
图 猿 互补载体 责粤阅员圆猿鄄员鄄责泽藻孕图谱
云蚤早援 猿 孕澡赠泽蚤糟葬造 皂葬责 燥枣 糟燥皂责造藻皂藻灶贼葬贼蚤燥灶 增藻糟贼燥则 责粤阅员圆猿鄄员鄄责泽藻孕
摇 摇 遭造葬院氨苄青霉素抗性编码基因曰糟葬贼院氯霉素抗性编码基因曰
则藻责院质粒复制起点曰责泽藻孕院基因 责泽藻孕 编码区曰责院基因 责泽藻孕 的启动
子遥 遭造葬院 砸藻泽蚤泽贼葬灶贼 早藻灶藻 贼燥 葬皂责蚤糟蚤造造蚤灶曰 糟葬贼院 则藻泽蚤泽贼葬灶贼 早藻灶藻 贼燥 糟澡造燥则鄄
葬皂责澡藻灶蚤糟燥造曰 则藻责院 燥则蚤早蚤灶葬贼藻 泽蚤贼藻 燥枣 责造葬泽皂蚤凿 则藻责造蚤糟葬贼蚤燥灶曰 责泽藻孕院 糟燥凿蚤灶早
则藻早蚤燥灶 燥枣 早藻灶藻 责泽藻孕曰 责院 责则燥皂燥贼藻则 燥枣 早藻灶藻 责泽藻孕援
圆援 猿 园鄄怨 及其衍生菌株的生物薄膜形成
定性和定量测定蜡样芽胞杆菌 园鄄怨 菌株尧基因
责泽藻孕缺失突变株 园鄄怨渊驻责泽藻孕冤及其基因互补菌株 园鄄怨
渊驻责泽藻孕宜责泽藻孕冤生物薄膜的形成遥 野生型菌株 责泽藻孕
缺失后袁其生物薄膜形成量显著降低遥 对 责泽藻孕 缺失
突变株反向互补后袁互补菌株的生物薄膜形成恢复
到野生型水平渊图 源袁图 缘冤遥 结果表明 责泽藻孕 基因参
与 园鄄怨 菌株生物薄膜的形成遥
圆援 源 园鄄怨 及其衍生菌株对小麦纹枯病的防治效果
野生型 园鄄怨 菌株处理后能够显著降低小麦纹枯
病的严重度袁防治效果达 苑源援 猿豫 曰园鄄怨渊驻责泽藻孕冤菌株
对病害的防治效果显著低于野生型 园鄄怨 菌株袁降低
了 源猿援 远豫 曰而 园鄄怨渊驻责泽藻孕宜责泽藻孕冤菌株的生防效果高
于 园鄄怨渊驻责泽藻孕冤袁提高了 圆怨援 圆豫 遥 结果表明 责泽藻孕基因
参与了对小麦纹枯病的生物防治渊表 员冤遥
怨猿圆圆 期 黄秋斌等院责泽藻孕基因对蜡样芽胞杆菌 园鄄怨 菌株生物薄膜形成和防治小麦纹枯病的影响
图 源 蜡样芽胞杆菌 园鄄怨 及其衍生菌株形成生物
薄膜的定性测定
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摇 摇 箭头指示附着在玻璃管内壁的生物薄膜遥 粤尧月尧悦分别为 园鄄
怨尧园鄄怨渊驻责泽藻孕冤和 园鄄怨渊驻责泽藻孕宜责泽藻孕冤菌株遥 粤则则燥憎 蚤灶凿蚤糟葬贼藻泽 遭蚤燥枣蚤造皂
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图 缘 蜡样芽胞杆菌 园鄄怨 及其衍生菌株形成生物
薄膜的定量测定
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猿 讨论
蜡样芽胞杆菌 园鄄怨 能够有效防治小麦纹枯病和
小麦全蚀病袁并已经获得发明专利渊专利号院扎蕴 圆园园怨
员 园园远源愿远苑援 圆冤遥 本研究测定了 园鄄怨 菌株及其不同衍
生物的生物薄膜形成能力和生防细菌对于小麦纹枯
病的生防效果袁证明生物薄膜的形成有助于 园鄄怨 菌
株发挥生防作用遥 月葬蚤泽 等咱员远暂研究了枯草芽胞杆菌
对由丁香假单胞菌番茄变种 孕泽藻怎凿燥皂燥灶葬泽 泽赠则蚤灶早葬藻
责增援 贼燥皂葬贼燥 引起的拟南芥根部病害的生防机制袁发现
枯草芽胞杆菌形成生物薄膜后袁提高了防治效果曰
表 员 蜡样芽胞杆菌 园鄄怨 及其衍生菌株对小麦纹枯病
的防治效果
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菌株
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严重度
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防治效果 渊豫冤
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酝燥则则蚤泽 驭 酝燥灶蚤藻则咱员苑暂分析了生防细菌生物薄膜形成与
生防作用的关系袁认为细菌形成生物薄膜后能够提
高其在自然界的生存能力袁加速其在植物根际定殖袁
促进生防菌发挥作用遥 上述报道均与本研究结果
一致遥
生物薄膜是一种胞外多聚物袁包括蛋白质尧多糖
和核酸等多种成分遥 有研究表明袁不同细菌产生的
生物薄膜成分存在差别遥 传统定量测定生物薄膜的
方法是首先利用结晶紫染色袁然后经乙醇尧丙酮等有
机溶剂溶解袁测定其吸光度袁比较不同菌株生物薄膜
的形成量咱员愿 原 员怨暂 遥 本研究中采用的生防菌 园鄄怨 菌株
虽然可以产生大量的生物薄膜袁但是该生物薄膜在
乙醇尧丙酮尧甲醇尧乙酸乙酯中均不溶解遥 为此袁本研
究根据结晶紫的碱稳定性袁采用 杂阅杂 溶液溶解生物
薄膜袁成功实现了定量测定遥
研究表明袁多糖的合成在生物薄膜形成中具有
重要作用咱圆园 原 圆员暂 遥 编码多糖转运蛋白的相关基因是
否参与生物薄膜的形成尚未见报道遥 本研究利用反
向遗传学方法袁通过构建推定的多糖外运蛋白编码
基因 责泽藻孕缺失突变株及其互补菌株袁测定了不同菌
株生物薄膜的产生状况袁证明 责泽藻孕 基因在生物薄膜
形成中具有重要作用袁同时发现该基因突变后袁细菌
的菌落形态发生明显变异袁由粗糙型变成光滑型袁暗
示 责泽藻孕直接参与多糖的合成或者外运过程遥 通过
比较野生型 园鄄怨 菌株及其衍生菌株对小麦纹枯病的
生防效果袁发现 责泽藻孕 参与对小麦纹枯病的生物防
治遥 究其原因可能是 责泽藻孕缺失后袁生物薄膜形成量
减少袁降低了细菌对于环境胁迫的抗性袁导致其定殖
能力下降所致遥 本研究仅在室内进行袁大田条件下
不同菌株的生防能力还有待进一步探讨遥
园源圆 植摇 物摇 保摇 护摇 学摇 报 源员 卷
参 考 文 献渊砸藻枣藻则藻灶糟藻泽冤
咱员暂 张会云袁 陈荣振袁 冯国华袁 等援 中国小麦纹枯病的研究现状
与展望援 麦类作物学报袁 圆园园苑袁 圆苑渊远冤院 员员缘园 原 员员缘猿
咱圆暂 文才艺袁 王凯旋袁 汪敏袁 等援 内生细菌 耘月杂园缘在小麦体内的
定殖动态及其对小麦纹枯病的防治作用援 植物保护学报袁
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咱员员暂 王刚袁 刘凤英袁 王淼袁 等援 内生细菌 月猿鄄苑的运动性参与其
在小麦根系的内生定殖和对小麦全蚀病的生物防治援 植
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渊责任编辑院吴竟一冤
员源圆圆 期 黄秋斌等院责泽藻孕基因对蜡样芽胞杆菌 园鄄怨 菌株生物薄膜形成和防治小麦纹枯病的影响