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WANGQiqi1,LIYuhong1,HULiangliang1,QINYaguang1,ZHAOZiyao1,CHENPeng2
(1ColegeofHorticulture,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,China;2ColegeofLifeScience,North
westA&FUniversity,Yangling,Shaanxi,712100,China)
犃犫狊狋狉犪犮狋:犈犚犈犆犜犃geneencodesaleucinerichrepeatreceptorlikeSer/Thrkinase.Itparticipatesinregu
latingmorphogenesisofplantorgansandplaysanimportantroleinthechangeofplanttypeandresistance
toadversity.Inthepresentstudy,pET21aCsERECTA,aprokaryoticexpressionvectorwithmaltose
bindingproteintagswasconstructedandsuccessfulyexpressedin犈.犮狅犾犻BL21(DE3).Expressioncondi
tionswereoptimizedintheoptimaltemperature,inductionduration,andIPTGconcentration.Thefusion
proteinMBPCsERECTAwaspurifiedbynickelchelatingchromatographyandenzymedigestionwascon
ductedbyrTEVprotease.TheCsERECTAproteinwasobtainedanditwasusedtopreparepolyclonalan
tibody.TheresultsshowedthatCsERECTAwasexpressedintheformofsolubleandinclusionbodiesin
犈.犮狅犾犻BL21(DE3),andalargenumberofproteinsweresolubleatlowtemperature.Theoptimaltemper
ature,inductiondurationandIPTGconcentrationwere23℃,6hand0.5mmol·L-1,respectively.West
ernblotshowedthatthepolyclonalantibodyofCsERECTAhasgoodspecificity,becauseendogenous
CsERECTAwasdetected.Thesuccessfulypreparedpolyclonalantibodycanbeusedforfurtherinvestiga
tion,whichestablishthefoundationforinvestigatingthefunctionofthe犆狊犈犚犈犆犜犃geneincucumber.
犓犲狔狑狅狉犱狊:cucumber;犆狊犈犚犈犆犜犃gene;prokaryoticexpression;polyclonalantibodies
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M.DL2000;1:AmplifiedbyPCRof犆狊犈犚犈犆犜犃gene;2:ColonyPCRofrecombinantvectorofpET21aHMTCsERECTA;
3:RecombinantplasmidofpET21aHMTCsERECTAidentifiedbyPCRamplification
Fig.2 Identificationof犆狊犈犚犈犆犜犃genewithrecombinantvectorofpET21aHMTCsERECTA
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d3 犆狊犈犚犈犆犜犃,is*TSDSPAGEd
M.Proteinmarker;1and2.Thesedimentandthesupernatantoftherecombinantsamplefor6hwith1mmol·L-1IPTGinduced
in37℃,respectively;3.ThetotalproteinofthecontrolwithoutIPTGinduced;4and5.Thesedimentandthesupernatantofthe
recombinantsamplefor6hwith1mmol·L-1IPTGinducedin28℃,respectively;6and7.Thesedimentandthesupernatant
oftherecombinantsamplefor6hwith1mmol·L-1IPTGinducedin23℃,respectively;Thearrowindicated65kD
Fig.3 SDSPAGEoffusionproteinexpressionof犆狊犈犚犈犆犜犃gene
M.~marker;1~5ñÄØ0、0.25、0.5、0.75±1.0mmol·L-1IPTG«¬T¦};6~10ñÄØ0、4、6、8±10h«¬T¦}
d4 ;öIPTG²®«¬¯°ªCsERECTA=~TNO
M.Proteinmarker;1-5.CelscontainingpET21aHMT犆狊犈犚犈犆犜犃inducedwith0,0.25,0.5,0.75and1.0mmol·L-1IPTG,
respectively;6-10:CelscontainingpET21aHMT犆狊犈犚犈犆犜犃inducedfor0,4,6,8and10hours,respectively
Fig.4 EffectoftimeandIPTGconcentrationonthcexpressionofrecombinantCsERECTA
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ofthecontrol;2and3.RecombinantCsERECTApurifiedby
nickelresin;4.Theproductafterenzymedigestion
Fig.5 SDSPAGEanalysisofrecombinantCsERECTA
purifiedbynickelresinandenzymedigestionof
fusionprotein
M.ÆT~ Marker;1.opET21aHMTCsERECTAT
BL21(DE3)¦ß~;2.+y¹sjCÞTÏ~;3.Qr
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M.Prestainedproteinmarker;1.ThetotalproteinofBL21(DE3)
bacterialcelscontainedpET21aHMTCsERECTA;2.Extraction
ofmembraneproteinbyultracentrifugationmethod;3.Extraction
oftotalproteinbysodiumacetateprecipitationmethod;
4.ExtractionofmembraneproteinbymethodsofTriton
X100decontaminant
Fig.6 Westernblotanalysisofpolyclonalantiserum
oftheCsERECTAprotein
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