全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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基金项目$中国烟草总公司科技计划面上项目"中烟办
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号#&中国烟草总公司湖北省公司科技攻关项目"
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作者简介$王
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京"
#202&
#!男!在读硕士研究生!主要从事烟草品质生态学研究)
3(45-6
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通信作者$许自成!博士!教授!博士生导师!主要从事烟草质量评价研究)
3(45-6
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海拔对白肋烟质体色素含量及
相关基因表达的影响
王
!
京#!王艳丽#!杨永霞#!吴文昊!!王
!
瑞!!向必坤!!许自成#"
"
#
河南农业大学 烟草学院!郑州
)$"""!
&
!
湖北省烟草公司恩施州公司!湖北恩施
))$"""
#
摘
!
要$以*鄂烟
#
号+为供试品种!于湖北恩施选取高,中,低
%
个海拔"海拔高度分别为
#$+"4
,
#!""4
,
0""4
#
种植区!研究不同海拔白肋烟主要生育期"旺长期,成熟期#内烟叶质体色素含量及其合成代谢过程中相关基因表
达的差异!探讨白肋烟质体色素代谢对海拔高度的生理响应机制)结果表明$烟叶叶绿素
5
,叶绿素
@
和叶绿素总
量及旺长期类胡萝卜素总量均以中海拔地区最高!且显著或极显著高于其他海拔梯度&成熟期高海拔烟叶类胡萝
卜素总量最高!且较旺长期明显增加)叶绿素及旺长期类胡萝卜素合成有关的基因均为中海拔表达最强!成熟期
类胡萝卜素合成基因在高海拔表达最强)结果说明*鄂烟
#
号+更适宜种植在中海拔地区)
关键词$白肋烟&海拔&质体色素&基因表达
中图分类号$
A2)$*2
&
A02
文献标志码$
B
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V
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8
H/H.SH65TH9;5(
S7TH/7-9.
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XX
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56T-T>9H
&
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65.T-9
X
-
8
4H/T
&
8
H/HH=
X
SH..-7/
!!
绿色植物质体色素主要包括叶绿素和类胡萝卜
素!其作为光合色素参与的光合作用是绿色植物生
长发育及形态建成的基础#()烟草质体色素作为重
要的香气前体物质!对烟草特色香气风格的形成具
有重要影响)在烟叶调制过程中!叶绿素分解形成
的新植二烯是烟叶中含量最大的中性挥发物!其香
气阈值较高!具有一定的清香味!是烟叶重要的增香
剂&类胡萝卜素降解因双键断裂位置不同!形成多种
重要的香气物质!如巨豆三烯酮,
"
(
大马酮,螺岩兰
草酮等!(%()
生态环境因素决定了烟叶质量和风格的形
成)(!海拔高度作为一个重要的生态因子对烟草的
生长发育,物质代谢及品质有重要的影响)随着海
拔升高!大气温度,
PZ
!
浓度,大气压等随之降低!
光照强度增强!烟苗移栽期推迟!烟株生长速度逐渐
减慢!株高稍矮!茎围稍粗!叶片较窄!大田生育期和
成熟期逐渐增长$(()不同海拔地区烟叶化学成分
也存在差异)有研究表明随着海拔升高!烟叶还原
糖含量增加!烟碱含量则随海拔升高而降低0()曹
学鸿等2(也认为烟叶中总糖,还原糖含量与海拔高
度呈正相关关系!总氮,烟碱含量则与海拔高度呈负
相关关系!中海拔地区"
0""
#
#)""4
#烟叶化学成
分协调性好于其他海拔层次)海拔对烟叶中性致香
物质含量也有较大的影响!甄才宏等#"(对
+""
#
#""4
海拔区域烟叶中性致香物质含量比较发
现!
0""4
海拔地区烟叶中性致香物质总量及各组
分含量均最高!
#%""4
海拔地区最低)有关海拔
高度对绿色植物质体色素含量变化的研究多见于云
杉,莨菪等植物)前人对云杉,落叶松的研究表明!
植物叶片中叶绿素和类胡萝卜素含量均随海拔的升
高而降低##(#!()张波等#%(对青藏高原不同海拔唐
古特山莨菪叶片光合色素含量比较表明高海拔地区
质体色素含量明显高于低海拔地区)关于不同海拔
对白肋烟质体色素代谢的影响还鲜见报道)本试验
研究了白肋烟质体色素随海拔梯度的变化及相关合
成代谢基因的表达规律!旨在分析白肋烟质体色素
代谢对海拔高度的生理响应机制!为研究恩施烟区
特色白肋烟品种在不同海拔生态环境中烟叶品质的
形成过程提供参考)
#
!
材料与方法
@*@
!
试验地概况和试验设计
试验地点设在湖北省恩施市崔坝镇!设置低,
中,高
%
个海拔梯度!分别为滚龙坝"
0""4
#,水淌
"
#!""4
#,马跑山"
#$+"4
#)供试品种为当地白
肋烟主栽品种*鄂烟
#
号+)各试验地土壤理化性质
基本一致!基础肥力见表
#
)
%
个海拔试验地土壤均为黄棕壤!质地疏松!肥
力中等)各海拔高度设
%
次重复!小区面积
+$4
!
!
行株距
#!";4[+";4
!本试验采用的肥料分别为
烟草专用复合肥,重过磷酸钙,硫酸钾!
D\W
!
Z
$
]
!
Z #^\#\!
)结合当地施肥习惯!
"_
复合肥和
全部的重过磷酸钙于整地后移栽前条施!
%"_
复合
肥和
$"_
硫酸钾于移栽时穴施!余下的硫酸钾于移
栽后
%"9
做追肥施用)其他田间栽培管理措施及
病虫害防治均按照当地优质烟叶生产管理要求进
行)高,中,低海拔烟株移栽时间分别为
$
月
#!
日,
$
月

日和
$
月
%
日)于旺长期和成熟期选取各处
理长势均匀一致的烟株
%
株!取中部叶
+
至
#"
支脉
之间的叶片!迅速置于液氮中低温保存)
@*A
!
测定内容和方法
@*A*@
!
质体色素代谢基因表达检测
!
取适量冷冻
烟叶叶片!用
OS-<76
法提取总
IDB

#)
(
!随机引物法
反转 录 合 成
;` DB
)以
;` DB
为 模 板!
WS-4HS
WSH4-HS$
软件设计扩增引物"表
!
#!以
!!$
"烟草核
糖体蛋白基因#为内参#$(!采用
IO(WPI
法检测质
体色素代谢途径关键基因的表达状况)各基因对应
的合成代谢关键酶名称及功能见表
%
)
WPI
体系为$
;` DB
为
#
$
a
!
9-R
!
Z
"去离子
水#为
##
$
a
!上游引物和下游引物均为
#*$
$
a
!含
染料的
O5
b
4-=
为
#$
$
a
!整个
WPI
体系共
%"
$
a
)
反应程序为
2)c
预变性
$4-/
&
2)c
变性
%".
&退
火温度依各引物
"
4
值变化而变化"
)c
#
+"c
#&
!c
延伸
#4-/
&
%$
个循环&
!c
延伸
#"4-/
!于
)
表
@
!
不同海拔高度土壤基础肥力状况
O5@6H#
!
O?H.7-6QHST-6-T-H.7QH=
X
HS-4H/T56Q-H69.-/9-QQHSH/T56T-T>9H.
海拔高度
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%
4
X
R
有机质
ZY
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-
M
8
&#
#
全氮
OD
%
_
速效磷
BW
%"
4
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-
M
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&#
#
速效钾
B]
%"
4
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-
M
8
&#
#
碱解氮
BD
%"
4
8
-
M
8
&#
#
低海拔
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中海拔
Y-996H56T-T>9H $*0" !)*!! "*%) !)*#" !#"*"" ##2*!$
高海拔
R-
8
?56T-T>9H $*+" !)*0 "*!0 !$*$0 !#!*$" #%2*20
!%#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
表
A
!
引物序列及
216
扩增基因片段
O5@6H!
!
O?H
X
S-4HS.H
b
>H/;H.5/9
8
H/HQS5
8
4H/T.54
X
6-Q-H9@
V
WPI
基因
EH/H
登录号
B;;H..-7/D7*
引物序列
WS-4HS.H
b
>H/;H
"
$d(%d
#
正向
e7S:5S9
反向
IHUHS.H
!!$ a#02"0 EPOOOPOOPEOPPPBOPB PPPPBBEOBPPPOPEOBO
#$% B1!#20$%*# BPOBOEEOOEEEBPBPOEPO BPPOPPOEEEOBBBOPOOEO
&( BF+#+)!*# PPPOEBPEBEPOOOPEBOEP OOBOPBPBEEBBPOPPPBPO
&() RY%)$$0!*# BOEEEBPBEEBOOPOOEEBO OOEPEEBEOOBOEOEEEBOE
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*( Fe2$$++*# OOEOOEBOBEBPEOEEBBBP BPBPPEBEPBPOEBOBOOEO
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表
B
!
参与质体色素合成代谢的酶及编码基因
O5@6H%
!
O?H
8
H/HH/;79-/
8
H/<
V
4H.5/9T?HH/<
V
4H.-/U76UH9-/
X
65.T-9
X
-
8
4H/T5/5@76-.4
基因
EH/H
酶
3/<
V
4H
功能
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#$%
捕光叶绿素
5
%
@
结合蛋白
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X
?
V
65
%
@(
@-/9-/
8X
S7TH-/
编码叶绿素结合蛋白
5
%
@
!
3/;79-/
8
;?67S7
X
?
V
6(@-/9-/
8X
S7TH-/5
%
@
&(
八氢番茄红素脱氢酶
W?
V
T7H/H9H.5T>S5.H
催化八氢番茄红素向
%
(
胡萝卜素的转化
P5T56
V
<-/
8
T?HTS5/.Q7S45T-7/QS74
X
?
V
T7H/HT7
%
(;5S7TH/H
&()
八氢番茄红素合成酶
W?
V
T7H/H.
V
/T?5.H
类胡萝卜素合成途径重要的限速酶
O?H-4
X
7ST5/TS5TH(6-4-T-/
8
H/<
V
4HQ7S;5S7TH/7-9.
V
/T?H.-.
*+&
玉米黄素环氧化酶
NH5=5/T?-/H
X
7=-95.H
催化来源于
P
"
)"
#类类胡萝卜素的玉米黄素经过两次环氧化形成紫黄质
P5T56
V
<-/
8
T?HH
X
7=-95(
T-7/7Q"
)"
#
Q7S47Q;5S7TH/7-95/9T>S/-/
8
-/T7U-765=5/T?-/
*(
%
(
胡萝卜素脱氢酶
%
(;5S7TH/H9H.5T>S5.H
催化
%
(
胡萝卜素向番茄红素的转化
P5T56
V
<-/
8
T?HTS5/.Q7S45T-7/QS74
%
(;5S7TH/HT76
V
;7
X
H/H
!#),
番茄红素
(
&
(
环化酶
a
V
;7
X
H/H(
&
(;
V
;65.H
催化番茄红素形成
&
(
环!从而合成

(
胡萝卜素
P5T56
V
<-/
8
6
V
;7
X
H/HTS5/.Q7S45T-7/5/9
&
(;
V
;6HQ7S(
45T-7/
!
5/9T?H.
V
/T?H.-.7Q

(;5S7TH/H
!#)-
番茄红素
(
"
(
环化酶
a
V
;7
X
H/H(
"
(;
V
;65.H
催化番茄红素形成
"
(
环!从而合成
"
(
胡萝卜素
P5T56
V
<-/
8
6
V
;7
X
H/HTS5/.Q7S45T-7/5/9
"
(;
V
;6HQ7S(
45T-7/
!
5/9T?H.
V
/T?H.-.7Q
"
(;5S7TH/H
&$.
脱镁叶绿酸
5
加氧酶
W?H7
X
?7S@-9H547(
/77=
V8
H/5.H
叶绿素分解代谢过程中的关键限速酶
O?HMH
V
S5TH(6-4-T-/
8
H/<
V
4HQ7S;?67S7
X
?
V
6;5T5@76-.4
#!/
叶绿素酶
P?67S7
X
?
V
65.H
将叶绿素水解成为羧酸的脱植基叶绿素和高级一价醇叶绿素"植醇#
R
V
9S76
V
<-/
8
;?67S7
X
?
V
6T7
;?67S7
X
?
V
6-977Q;5S@7=
V
6-;5;-9.5/9
X
?
V
T76
###
类胡萝卜素裂解双氧合酶
P5S7TH/7-9;6H5U(
5
8
H9-7=
V8
H/5.H.
可催化很多类胡萝卜素底物生成许多天然活性化合物
P5T56
V
<-/
8
45/
V
;5S7TH/7-9.>@.TS5TH.
T>S/-/
8
-/T75/>4@HS7Q/5T>S56@-75;T-UH;74
X
7>/9.
#/!0
镁离子螯合酶
Y
8
(;?H65T5.H
四吡咯化合物生物合成途径中合成叶绿素分支"镁分支#的第一个酶!该酶不仅控制着叶绿素的合
成!其不同亚基还参与叶绿体到细胞核的反向信号传导
KT-.T?HQ-S.TH/<
V
4H7QT?H;?67S7
X
?
V
6
@S5/;?H.
"
@S5/;?7Q45
8
/H.->4
#
7QTHTS5
XV
SS76H;74
X
7>/9.@-7.
V
/T?H.-.;7/TS76-/
8
T?H.
V
/T?H.-.
7Q;?67S7
X
?
V
6
!
5/9-T.9-QQHSH/T.>@>/-T.-.-/U76UH9-/5SHUHS.H.-
8
/56TS5/.9>;T-7/QS74;?67S7
X
65.T
T7T?H/>;6H>.
c
保存)
@*A*A
!
质体色素含量的测定
!
采用低温冷冻干燥
机将烟叶样品冻干!粉碎机粉碎后!准确称取
"*!
8
粉碎烟样置于
$"4a
棕色瓶中!准确加入
!$4a
2"_
丙酮溶液!轻微震荡后低温条件下超声波萃取
!"4-/
!用移液管取适量萃取液后用有机膜"
*)$
$
4
#过滤!移入
#*$4a
棕色色谱瓶"液相色谱分
析仪#)
工作条件为
f
V
44HTS
V
P
#0
反相色谱柱"
%*2
44-*9*[#$"44
!
$
$
4
!美国
C5THS.
公司#!流动
相
B
为甲醇的异丙醇溶液"体积比为
#\#
#!流动相
L
为超纯水)流速
"*$4a
%
4-/
)梯度洗脱$
"
#
#"
4-/
"
"_Bg%"_L
#!
#"
#
#4-/
"
#""_B
#!
#
#
%"4-/
"
2"_ Bg#"_ L
#)以梯度洗脱线性递增
"减#的梯度条件!平衡
#"4-/
后手动进样)进样量
#"
$
a
)检测波长
)$"/4
)柱温为室温)
@*B
!
数据处理
采用
3=;H6!""%
,
fWff#2*"
等统计软件进行
%%#
#
期
!!!!!!!!!!!
王
!
京!等$海拔对白肋烟质体色素含量及相关基因表达的影响
数据分析)并用
a5>/;?h-.-7/C7SM.af
软件对
IO(WPI
检测所得半定量图片进行量化!提取各个
基因表达的亮度相对值进行对比!每个基因均以旺
长期高海拔处理为基准)
!
!
结果与分析
A*@
!
不同海拔白肋烟质体色素代谢关键基因的表
达分析
A*@*@
!
叶绿素代谢关键基因的表达差异
!
对叶绿
素代谢关键基因
#$%
,
#/!0
,
&$.
,
#!/
进行
IO(WPI
检测分析"图
#
,表
)
#!结果表明!旺长期叶
绿素合成关键基因
#$%
和
#/!0
的表达量均高于
成熟期!而参与编码叶绿素分解基因
&$.
和
#!/
图
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不同海拔白肋烟叶绿素代谢关键酶基因的检测结果
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和
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表达在旺长期以中
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和
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均随海拔的升高
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类胡萝卜素代谢关键基因的表达差异
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则随海拔升高表达逐渐增强)成熟期
&(
和
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均在低海拔表达最强!中海拔最弱&
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,
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,
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随海拔升高表达逐渐增强&
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图
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不同海拔白肋烟类胡萝卜素代谢
关键酶基因的检测结果
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不同海拔白肋烟类胡萝卜素代谢关键酶基因相对表达量的多重比较
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叶绿素
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在中海拔表达最强!低海拔次之!高海拔最弱)高海
拔烟叶成熟期除
&(
外各基因表达量均高于旺长
期!表明高海拔成熟期烟叶中类胡萝卜素合成分解
旺盛)
A*A
!
不同海拔白肋烟质体色素含量变化的差异
白肋烟各生育期不同海拔间烟叶质体色素含量
差异如表
+
所示)烟叶中叶绿素
5
,叶绿素
@
含量
及叶绿素总量随海拔升高呈现出先升高后降低的趋
势!具体表现为$中海拔
$
高海拔
$
低海拔!且中海
拔极显著高于高海拔和低海拔!高海拔和低海拔差
异不显著)旺长期类胡萝卜素总量及各组分含量的
变化规律与叶绿素相似!也表现为先升高后降低)
!
(
胡萝卜素,新黄质,紫黄质含量及类胡萝卜素总量
在各海拔间差异均显著!叶黄素含量在中海拔和高
海拔间差异达到极显著水平)成熟期除叶黄素含量
为中海拔产区最高外!类胡萝卜素总量及其他各组
分含量均随海拔升高而逐渐升高)
!
(
胡萝卜素,新
黄质含量及类胡萝卜素总量在高海拔和中海拔间差
异不显著!但极显著高于低海拔产区!叶黄素和紫黄
质含量在各海拔间呈极显著差异)各海拔烟叶叶绿
$%#
#
期
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王
!
京!等$海拔对白肋烟质体色素含量及相关基因表达的影响
素
5
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@
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!
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推进叶绿素
5
%
@
有下降的趋势!说明叶绿素
5
的降
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@
!烟叶对光能的利用减弱)旺
长期低海拔烟叶类胡萝卜素%叶绿素最高!显著高于
高海拔烟叶&而成熟期高海拔烟叶该比值最高!不同
海拔烟叶类胡萝卜素%叶绿素在
"*"$
水平差异
显著)
%
!
讨
!
论
在旺长期!烟株生长迅速!叶面积迅速扩大!光
合速率上升!质体色素含量增加!但随着烟叶成熟!
叶片在生育后期感知衰老信号!各项生理代谢减弱!
光合速率下降!质体色素加速降解#()本研究表明!
烟叶中质体色素含量在旺长期处于较高水平!随着
烟叶成熟!质体色素含量降低!这与已有研究一
致#+()烟叶叶绿素
5
,叶绿素
@
和叶绿素总量及旺
长期类胡萝卜素总量均以中海拔地区最高!且显著
或极显著高于其他海拔梯度!这与曹艳玲等#(研究
结果一致)也有研究认为叶绿素含量随着海拔升高
而降低#0()这种代谢差异可能是由于烟株生长的
其他生态环境不同引起的!尚需进一步验证)叶绿
素
5
%
@
是衡量植物利用光能能力大小的指标)通常
认为!随着海拔升高!叶绿素
5
%
@
比值呈上升趋
势#!!#2()但本研究结果表明叶绿素
5
%
@
比值在各
海拔间差异不显著!可能是由于本试验选取的海拔
梯度尚未引起烟叶对不同波长光照的选择性吸收所
致)成熟期烟叶类胡萝卜素含量随海拔的升高而逐
渐升高!类胡萝卜素%叶绿素比值在高海拔显著高于
中海拔和低海拔!这可能是由于在烟株生育后期高
海拔地区的紫外线强度过高!烟株为适应这种逆境
胁迫!与类胡萝卜素合成相关的关键酶基因表达量
增加!进而调控合成大量类胡萝卜素来调节类囊体
膜的物理活性!保护叶绿素不受光氧化伤害#!!"()
这种类胡萝卜素含量的增加是烟叶为应对环境变化
而采取的一种保护性机制!与韩锦峰等!#(的研究结
果一致)
从相关代谢基因
IO(WPI
检测结果可以看出!
与质体色素合成相关的基因在旺长期表达活跃!但
此时与质体色素降解相关的基因的表达量却维持在
较低水平&成熟期相关合成基因的表达量略有下降
或维持原有水平!而相关降解基因的表达明显加强!
这与质体色素含量随烟叶成熟逐渐下降的趋势一
致)表明基因对代谢关键酶的调控是影响烟叶质体
色素含量变化的原因之一)
恩施中海拔烟叶质体色素最高!相关基因表达
活跃!更有利于烟叶进行光合作用!进而促进烟株物
质代谢!为提高烟叶产质量和彰显香气风格提供了
物质基础)*鄂烟
#
号+更适宜在恩施中海拔地区种
植)然而!烟叶品质的形成是烟草品种基因型和生
态环境综合作用的结果)(!不同烟草品种在相同生
态环境下烟叶化学成分也存在较大差异!!(!鉴于当
地白肋烟种植品种较多!恩施白肋烟整体种植区划
还需进一步研究)
参考文献!

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