全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４３(３): ２７４￣２８５(２０１３)
收稿日期: ２０１２￣０４￣１８ꎻ 修回日期: ２０１２￣０３￣１７
基金项目: 国家科技支撑计划(２０１２ＢＡＫ１１Ｂ０２)ꎻ 质检公益性行业科研专项(２０１０１０２５６)ꎻ 国家质检总局科研项目(２０１１ＩＫ１６９)ꎻ 浙江
省重点科技创新团队项目(２０１０Ｒ５００２８)ꎻ 宁波市社会发展科研项目(２０１２Ｃ５００４１)
通讯作者: 段维军ꎬ高级农艺师ꎬ主要从事有害生物识别与检测技术研究ꎻ Ｔｅｌ:０５７４￣８７０２２９５１ꎬ Ｆａｘ:０５７４￣８７１１３５８４ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｗｅｉｊｕｎｄｕａｎ
＠ｙａｈｏｏ. ｃｏｍ. ｃｎꎮ
检疫性轮枝菌及其近似种的鉴定
段维军１∗ꎬ 郭立新１ꎬ 张祥林２ꎬ 夏侯阳３ꎬ 张慧丽１ꎬ 陈先锋１
( １宁波出入境检验检疫局ꎬ 宁波 ３１５０１２ꎻ ２ 新疆出入境检验检疫局ꎬ 乌鲁木齐 ８３００６３ꎻ ３ 宁波大学ꎬ 宁波 ３１５２１２)
摘要:大丽轮枝菌(Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ)和黑白轮枝菌(Ｖ. ａｌｂｏ￣ａｔｒｕｍ)在世界范围内引起多种作物的黄萎病ꎬ属于我国重要
进境植物检疫对象ꎮ 本研究对采自我国部分地区和 ＣＢＳ 保存的多种植物病原性轮枝菌ꎬ包括黑白轮枝菌、大丽轮枝菌及
其变种大丽轮枝菌长孢变种(Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ｖａｒ. ｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｍ)、三体轮枝菌(Ｖ. ｔｒｉｃｏｒｐｕｓ)、变黑轮枝菌(Ｖ. ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ)和云状
轮枝菌(Ｖ. ｎｕｂｉｌｕｍ)ꎬ采用生物学特性观察ꎬ结合 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ序列分析的方法ꎬ进行了比较和分析ꎮ 结果表明:不同种类轮
枝菌在休眠结构形态上具有一定差异ꎬ部分菌株不产生任何休眠结构ꎮ 各供试菌株在 １５ ~ ２５℃范围内均可生长ꎬ但黑白轮
枝菌在 ３０℃下生长受到强烈抑制ꎬ而其他菌株受影响较小ꎮ 对供试菌株 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ 序列分析结果表明植物病原性轮枝菌
可聚为 ９ 个分支ꎬ包括三体轮枝菌、变黑轮枝菌、云状轮枝菌、Ｖ. ｔｈｅｏｂｒｏｍａｅ、大丽轮枝菌、大丽轮枝菌长孢变种和 ３ 个不同
的黑白轮枝菌分支ꎬ黑白轮枝菌、大丽轮枝菌及其长孢变种亲缘关系较近ꎮ 采用生物学性状结合 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ序列分析能够
更加有效地将两种检疫性轮枝菌从其他植物病原性轮枝菌中区分出来ꎮ
关键词:大丽轮枝菌ꎻ 黑白轮枝菌ꎻ 生物学特性ꎻ 分子鉴定
Ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ ａｎｄ Ｖ. ａｌｂｏ￣ａｔｒｕｍ ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ ａｌｌｉｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ
ＤＵＡＮ Ｗｅｉ￣ｊｕｎ１ꎬ ＧＵＯ Ｌｉ￣ｘｉｎ１ꎬ ＺＨＡＮＧ Ｘｉａｎｇ￣ｌｉｎ２ꎬ ＸＩＡ Ｈｏｕ￣ｙａｎｇ３ꎬ ＺＨＡＮＧ Ｈｕｉ￣ｌｉ１ꎬ ＣＨＥＮ Ｘｉａｎ￣ｆｅｎｇ１
( １ Ｎｉｎｇｂｏ Ｅｎｔｒｙ￣ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｂｕｒｅａｕꎬ Ｎｉｎｇｂｏ ３１５０１２ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｅｎｔｒｙ￣ｅｘｉｔ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ
Ｂｕｒｅａｕꎬ Ｗｕｌｕｍｕｑｉ ８３００６３ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ３ Ｎｉｎｇｂｏ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｎｉｎｇｂｏ ３１５２１２ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｈｅ ｆｕｎｇａｌ ｇｅｎｕｓ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｔｗｏ ｗｅｌｌ￣ｓｔｕｄｉｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ ａｎｄ ｃｏｍｍｏｎ ｓｏｉｌｂｏｒｎｅ
ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｓꎬ Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ａｎｄ Ｖ. ａｌｂｏ￣ａｔｒｕｍ. Ｔｈｏｓｅ ｔｗｏ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｒｅ ａｌｓｏ ｌｉｓｔｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ ｐｅｓｔｓ ｏｆ ｉｍ￣
ｐｏｒｔｅｄ ｐｌａｎｔｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ. Ｄｉｖｅｒｓｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐꎬ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｖ. ａｌｂｏ￣ａｔｒｕｍꎬ
Ｖ. ｄａｈｌｉａｅꎬ Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ｖａｒ. ｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｍꎬ Ｖ. ｔｒｉｃｏｒｐｕｓꎬ Ｖ. ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ ａｎｄ Ｖ. ｎｕｂｉｌｕｍ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｃｈｉｎａ
ａｎｄ ＣＢＳꎬ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｔｈｅ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ. ｆｒｏｍ
ｏｔｈｅｒｓ. Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａｌｔｈｏｕｇｈ ｔｈｅｒｅ ａｒｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｒｅｓｔｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｍｏｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ. ꎬ ｓｏｍｅ
ｉｓｏｌａｔｅｓ ｈａｖｅ ｌｏｓｔ ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ｔｈｅ ｒｅｓｔｉｎｇ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ. Ｉｎ ｔｈｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｔｅｓｔꎬ ａｌｌ ｔｈｅ Ｖ. ａｌｂｏ￣ａｔｒｕｍ ｄｉｄ
ｎｏｔ ｇｒｏｗ ａｔ ３０℃ꎬ ｗｈｉｌｅ ｏｔｈｅｒｓ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ. ｇｒｅｗ ｗｅｌｌ ｕｎｄｅｒ ３０℃. Ｔｈｅ ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ｆｒｏｍ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｖｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ. Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｒａｎｇｅｄ ｆｒｏｍ ５３９ ｔｏ ５５９ ｂｐ ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ.
Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｄｅｐｏｓｉｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ＮＣＢＩ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｓｉｘ ｉｎｖｅｓｔｉｇａ￣
ｔｅｄ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｅｃｉｅｓ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｉｎｔｏ ｎｉｎｅ ｃｌａｄｅｓ. Ｖ. ａｌｂｏ￣ａｔｒｕｍꎬ Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ａｎｄ Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ｖａｒ. ｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｍ
ｗｅｒｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｃｌｏｓｅ. Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｓｕｇｇｅｓｔｓ ｔｈａｔ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｒＤＮＡ￣
ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｔｈｅ ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ. ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ Ｖｅｒｔｉｃｉｌ￣
ｌｉｕｍ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｌｂｏ￣ａｔｒｕｍꎻ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅꎻ ｂｉｏｌｏｇｙ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓꎻ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
　
　 ３ 期 　 　 段维军ꎬ等:检疫性轮枝菌及其近似种的鉴定
中图分类号: Ｓ４３２. ４ ４　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１３)０３￣０２７４￣１２
　 　 轮枝菌属(Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ)由 Ｎｅｅｓ 在 １８１７ 年建
立[１]ꎬ能够腐生或寄生在昆虫、线虫、真菌和植物
上[２]ꎮ 其中危害植物的种类主要包括六个种ꎬ即
黑白轮枝菌 Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ａｌｂｏ￣ａｔｒｕｍ Ｒｅｉｎｋｅ ａｎｄ
Ｂｅｒｔｈｏｌｄ、大丽轮枝菌 Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ Ｋｌｅｂａｈｎ、三体轮
枝菌 Ｖ. ｔｒｉｃｏｒｐｕｓ Ｉｓａａｃ、变黑轮枝菌 Ｖ. ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ
Ｐｅｔｈｙｂｒｉｄｇｅ、云状轮枝菌 Ｖ. ｎｕｂｉｌｕｍ Ｐｅｔｈｙｂｒｉｄｇｅ和
Ｖ. ｔｈｅｏｂｒｏｍａｅ (Ｔｕｒｃｏｎｉ) Ｍａｓｏｎ ａｎｄ Ｈｕｇｈｅｓ [３ ~ ６]ꎮ
在这 ６ 种轮枝菌中ꎬ以同为土壤习居菌的大丽轮枝
菌和黑白轮枝菌危害为最ꎬ可引起植物维管束病
害ꎬ造成作物减产ꎬ甚至绝产[３]ꎬ属于我国重要植
物检疫对象ꎬ其余 ４ 种一般被认为是弱寄生菌或腐
生菌ꎮ
有害生物入侵的超前预警、快速检测、风险分
析和科学控制是防范外来物种的核心内容ꎬ有害生
物鉴定是其中的首要环节ꎮ 对大丽轮枝菌和黑白
轮枝菌及其近似种进行有效识别ꎬ对于控制其危
害ꎬ及时阻断其传播、扩散ꎬ起着至关重要的作用ꎮ
目前ꎬ我国进出境口岸对检疫性轮枝菌种类鉴定的
主要依据标准是根据其形态学特征进行ꎬ由于不同
植物病原性轮枝菌均可产生典型轮枝状分生孢子
梗ꎬ且存在一定的形态变异ꎬ故依据形态特征进行
种类区分具有一定难度ꎮ 通过系统比较植物病原
性轮枝菌的生物学特性和对其进行系统发育分析ꎬ
有助于植物病原性轮枝菌的准确划分ꎬ可为今后检
疫工作和病害治理等相关工作提供重要支持ꎮ
１　 材料与方法
１. １　 材料
１. １. １　 供试菌株的分离、收集与纯化　 采用常规
的组织块 ＰＤＡ平板分离法收集菌种ꎬ共得到植物
病原性轮枝菌 ２５ 株ꎬ进行单孢分离后得到单孢分
离株ꎬ保存在 ＰＤＡ 试管斜面(４℃)ꎬ备用ꎮ 分离株
编号、来源及寄主见表 １ꎮ
１. １. ２　 培养基 　 采用马铃薯葡萄糖琼脂(ＰＤＡ)
培养基进行分离、纯化、形态学观察和保存ꎮ
１. １. ３　 仪器和试剂　 显微镜为奥林巴斯有限公司
生产的 ＢＸ￣５１ 型、显微镜数码成像系统为徕卡仪
器有限公司生产的 Ｌｅｉｃａ ＤＦ３２０ 型、培养箱为德国
ＭＭＭ公司生产的 Ｆｒｉｏｃｅｌｌ ２２２ 型、核酸自动化提
取仪为美国 ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ 公司生产的 Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ
型、ＰＣＲ 仪为 Ｂｉｏｍｅｔｒａ 公司生产的 ＴＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ
Ｂａｓｉｃ型、生物分光光度计为日本日立公司生产的
Ｕ￣００８０Ｄ型、电泳设备和凝胶成像系统分别为伯乐
生命医学产品有限公司生产的 ＰｏｗｅｒＰａｃ Ｂａｓｉｃ 型
和 ＧｅｌＤｏｃＥＱ型ꎻ核酸提取试剂盒为台湾奈米技术
开发有限公司生产的 ＴＡＮＢｅａｄ Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ Ａｕｔｏ
Ｋｉｔ型ꎻＴａｑ ＤＮＡ 聚合酶、ＭｇＣｌ２、１０ × ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ、
ＤＬ２ ０００ Ｍａｒｋｅｒ、ＤＮＡ 片段纯化试剂盒、ｐＭＤ１８￣
Ｔ、ＤＨ５α感受态细胞均购自宝生物(大连)工程有
限公司ꎻ实验用引物由上海英俊生物技术有限公司
合成ꎻ其他试剂均为分析纯ꎮ
１. ２　 方法
１. ２. １ 　 生物学性状观察 　 将供试菌种接种于
ＰＤＡ平板上ꎬ在 ２０℃条件下连续暗培养 ３０ ｄꎬ观察
记录菌落正反面的颜色和气生菌丝的疏密程度ꎮ
菌丝长势浓密健壮用“ ＋ ＋ ＋ ”表示ꎬ生长较浓密
用“ ＋ ＋ ”表示ꎬ生长稀疏用“ ＋ ”表示ꎬ无气生菌丝
生长用“ － ”表示ꎮ 用解剖针挑取供试菌种ꎬ置于
加有水滴的玻片上ꎬ盖上盖玻片后ꎬ在显微镜下观
察分生孢子、微菌核、厚垣孢子和休眠菌丝的有无
及其形态特征ꎬ并利用显微数码测量系统进行测量
工作ꎬ采用 Ｅｘｃｅｌ自带软件计算平均值和标准差ꎮ
１. ２. ２　 温度适应性测定 　 将供试菌种接于 ＰＤＡ
平板中央ꎬ在 ２０℃条件下连续暗培养 ２０ ｄꎬ使其形
成可供试验的菌落ꎬ用无菌的打孔器从菌落边缘取
直径 ４ ｍｍ 的菌饼ꎬ置不同温度条件下 (１５℃、
２０℃、２５℃和 ３０℃)ＰＤＡ平板中央ꎬ每处理 ３ 皿ꎬ在
ＭＭＭ培养箱中连续暗培养 ７ ｄ 后ꎬ采用十字交叉
法测量菌落直径ꎮ
１. ２. ３　 基因组 ＤＮＡ提取　 用灭菌枪头刮取 ＰＤＡ
平板上培养菌株的菌丝体ꎬ根据试剂盒及仪器使用
说明ꎬ在核酸自动化提取仪上使用核酸提取试剂盒
(台湾奈米技术开发有限公司)进行 ＤＮＡ 提取ꎮ
提取后的 ＤＮＡ 经分光光度计检测 ＤＮＡ 浓度后ꎬ
冻存于 －２０℃冰箱中备用ꎮ
１. ２. ４　 核糖体 ＩＴＳ片段克隆　 采用 Ｗｈｉｔｅ 等[６]设
计的引物 ＩＴＳ１ 和 ＩＴＳ４ 进行 ＩＴＳ 片段扩增ꎮ 反应
程序为:９５℃ ３ ｍｉｎꎻ９５℃ ４０ ｓꎬ ５３℃ ４０ ｓꎬ７２℃ ６０
ｓꎬ３５个循环ꎻ７２℃ １０ｍｉｎꎮＰＣＲ扩增产物用电泳
５７２
　
植物病理学报 ４３ 卷６７２
　
　 ３ 期 　 　 段维军ꎬ等:检疫性轮枝菌及其近似种的鉴定
仪在 ２％琼脂糖凝胶上进行检测ꎬ确认扩增成功
后ꎬ使用凝胶成像系统进行拍照ꎬ并用 ＤＮＡ 片段
纯化试剂盒进行纯化ꎮ 纯化的 ＰＣＲ 产物连接至
ｐＭＤ１８￣Ｔ 载体后ꎬ转化到 ＤＨ５α 感受态细胞中ꎬ
经蓝白斑筛选以及菌落 ＰＣＲ检验后ꎬ３７℃摇菌培
养过夜ꎬ菌液送上海英俊生物技术有限公司测
序ꎮ
１. ２. ５　 序列分析 　 利用 ＮＣＢＩ 网站上的 ＢＬＡＳＴ
程序对所得的 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ序列进行比对分析ꎬ确认
序列的可靠性ꎮ 根据 ＮＣＢＩ 中已有轮枝属菌株的
ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ序列资料ꎬ确定 ＩＴＳ 序列的 ＩＴＳ１、５. ８Ｓ
和 ＩＴＳ２ 的序列范围ꎬ将序列提交到 ＮＣＢＩ 获得登
录号(表 １)ꎮ 将测得的序列与 ＧｅｎＢａｎｋ 中下载的
植物病原性轮枝菌 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ 序列 (表 ２ ) 用
ＣＬＵＳＴＡＬ Ｘ程序进行分析ꎬ使用 ＭＥＧＡ５. ０[２０]程
序进行比对ꎬ以 ＮＣＢＩ上下载的黑曲霉(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｇｅｒ) ＩＴＳ 序列[２１]为外群ꎬ按照 Ｓａｉｔｏｕ 等[２２]的方
法采用邻接法(ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄꎬ ＮＪ)构建
系统进化发育树ꎬ进行 １ ０００ 次重抽样计算系统树
中节点的置信度ꎮ
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｄｅｔａｉｌｓ ｏｆ ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ＧｅｎＢａｎｋ ａｎｄ
ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｓｐｅｃｉｅ Ｈｏｓｔ Ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ ｍａｔｅｒｉａｌ ａｎｄ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＩＴＳ ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ
Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ. ｄａｈｌｉａｅ Ｐｅｐｐｅｒ Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ Ｃｏｕｎｔｙꎬ ＣＡꎬ ＵＳＡ[７] ＨＱ２０６７５６
Ｃｏｔｔｏｎ Ｇｒｅｅｃｅ[８] ＡＦ１０４９２６
Ｅｇｇｐｌａｎｔ Ｉｔａｌｙ[９] ＡＪ９７０３０８
Ａｌｍｏｎｄ Ｘｉｎｊｉａｎｇ ｍｕｎｉｃｉｐａｌｉｔｙꎬ Ｃｈｉｎａ[１０] ＥＵ１０９５３２
Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ｖａｒ.
ｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｍ
Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ Ｇｅｒｍａｎｙ[１１] ＧＱ４９５７９２
Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ Ｇｅｒｍａｎｙ[１２] ＡＦ３６４００７
Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａꎬ ＵＳＡ[７] ＨＱ２０６７２５
Ｃａｂｂａｇｅ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａꎬ ＵＳＡ[７] ＨＱ２０６７２６
Ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ Ｓａｌｉｎａｓꎬ ＣＡꎬ ＵＳＡ[７] ＦＪ９００２２１
Ｖ. ａｌｂｏ￣ａｔｒｕｍ Ｔｒｅｅ￣ｏｆ￣ｈｅａｖｅｎ Ｓｏｕｔｈ￣ｃｅｎｔｒａｌ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａꎬ ＵＳＡ[１３] ＦＪ４２４０８２
Ｐｏｔａｔｏ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｄｏｍ[１４] ＪＮ１８７９９４
Ｐｏｔａｔｏ ＵＳＡ[１４] ＪＮ１８７９９０
Ｐｏｔａｔｏ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ[１２] ＡＦ３６４０１６
Ａｌｆａｌｆａ ＰＡꎬ ＵＳＡ[４] ＦＪ９００２１２
Ａｌｆａｌｆａ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａꎬ ＵＳＡ[４] ＧＵ２９１２５８
Ａｌｆａｌｆａ Ｃａｎａｄａ[１５] ＡＦ１０８４７６
Ａｌｆａｌｆａ Ｓｍｕｌｌｔｏｎꎬ ＰＡꎬ ＵＳＡ[７] ＨＱ２０６７４２
Ａｌｆａｌｆａ Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａꎬ ＵＳＡ[７] ＨＱ２０６７３３
Ｐｏｔａｔｏ Ｈｏｋｋａｉｄｏｕꎬ Ｊａｐａｎ[１４] ＪＮ１８７９７３
Ｈｏｐ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｄｏｍ[１４] ＪＮ１８７９８２
Ｖ. ｎｕｂｉｌｕｍ Ｐｏｔａｔｏ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｄｏｍ[１６] ＡＹ９３５９４８
ｎａ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｄｏｍ[７] ＨＱ２０６８５２
Ｖ. ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ Ｐｏｔａｔｏ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｄｏｍ[１７] ＡＪ２９２４４０
Ｗｒａｐｐｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ[１８] ＥＦ５４３８５１
Ｖ. ｔｈｅｏｂｒｏｍａｅ Ｂａｎａｎａ Ｃａｒｒｉｂｅａｎ[１９] ＡＪ２９２４２２
ｎａ Ｊａｐａｎ[１８] ＥＦ５４３８５８
Ｂａｎａｎａ Ｉｎｄｉａ[１６] ＡＹ９３５９４７
Ｖ. ｔｒｉｃｏｒｐｕｓ Ｐｏｔａｔｏ Ｊａｐａｎ[１４] ＪＮ１８７９７４
Ｔｏｍａｔｏ Ｊａｐａｎ[１４] ＪＮ１８７９７５
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ [２１] ＨＱ６０７９９３
ｎａ: Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｎｏｔ ａｖａｉａｂｌｅ.
７７２
　
植物病理学报 ４３ 卷
２　 结果与分析
２. １　 生物学性状观察
供试菌株的生物学性状观察结果见表 １ 和表
３ꎮ 所有供试菌株均可产生典型的轮枝状分生孢子
梗和分生孢子ꎬ但是不同种类轮枝菌所产生的休眠
结构(微菌核、厚垣孢子或休眠菌丝)有所不同ꎮ
供试 ６ 株黑白轮枝菌除 ＶＡＡ４１ 外均不产生微菌核
和厚垣孢子ꎬ菌株 ＶＡＡ４０、ＶＡＡ４２、ＶＡＡ４３ 均可产
生褐色休眠菌丝ꎬ菌株ＶＡＡ４１产生束状休眠菌丝
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ.
Ｉｓｏｌａｔｅｓ
Ｃｏｎｉｄｉａ Ｍｉｃｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉａ Ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｅ
Ｌｅｎｇｔｈ / μｍ Ｗｉｄｔｈ / μｍ Ｌｅｎｇｔｈ / μｍ Ｗｉｄｔｈ / μｍ Ｌｅｎｇｔｈ / μｍ Ｗｉｄｔｈ / μｍ
Ｒｅｓｔｉｎｇ
ｍｙｃｅｌｉｕｍ
Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ. ａｌｂｏ￣ａｔｒｕｍ
ＶＡＡ２ ５. ３ ± １. ０ ２. １ ± ０. ４ － － － － －
ＶＡＡ２７ ４. ８ ± １. １ ２. ５ ± ０. ９ － － － － －
ＶＡＡ３９ ５. ４ ± ０. ９ ２. １ ± ０. ３ － － － － －
ＶＡＡ４０ ５. ２ ± １. ５ ２. ４ ± ０. ５ － － － － ＋
ＶＡＡ４１ ５. ９ ± １. ４ ２. ２ ± ０. ４ ３８. ９ ± １. ０ １９. ６ ± ７. ０ － － ＋ (ｂｕｎｄｌｅｓ)
ＶＡＡ４２ ５. ６ ± １. ３ ２. １ ± ０. ３ － － － － ＋
ＶＡＡ４３ ５. ９ ± １. ０ ２. ３ ± ０. ３ － － － － ＋
Ｍｅａｎ ５. ４ ２. ２
Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ
ＶＤ１ ４. ３ ± ０. ７ １. ９ ± ０. ４ ７４. ８ ± ２７. ７ ４０. ２ ± １１. １ － － －
ＶＤ２ ４. ６ ± ０. ８ ２. ０ ± ０. ３ ９７. ９ ± ３０. ９ ６３. ２ ± ２４. ０ － － －
ＶＤ５ ６. １ ± ０. ８ ２. ７ ± ０. ４ ５１. １ ± １１. １ ３９. １ ± ８. ８ － － －
ＶＤ６ ４. ９ ± １. ３ ２. １ ± ０. ５ ６１. １ ± ２２. ７ ３８. ３ ± １０. １ － － －
ＶＤ７ ４. ８ ± １. ２ ２. ８ ± ０. ６ ６７. ４ ± １６. ６ ４５. １ ± １３. ４ － － －
ＶＤ１１ ４. ４ ± ０. ８ ２. ３ ± ０. ４ － － － － －
ＶＤ１２ ４. ３ ± １. ０ ２. ０ ± ０. ５ ７０. ８ ± ２２. ７ ４８. ４ ± １４. ９ － － －
ＶＤ１３ ４. ９ ± １. ０６ ２. ５ ± ０. ５ ４９. ２ ± １３. ２ ３５. ０ ± ６. ８ － － －
ＶＤ３０ ４. ３ ± ０. ６ ２. １ ± ０. ４ ５４. ９ ± １７. １ ４０. ３ ± １２. ４ － － －
ＶＤ３１ ４. ２ ± ０. ８ ２. ３ ± ０. ４ ６２. ４ ± ２３. ３ ３８. ０ ± １４. ２ － － －
ＶＤ３２ ４. ３ ± ０. ８ ２. ２ ± ０. ５ ４７. ９ ± １３. ３ ３４. ２ ± ６. ８ － － －
Ｍｅａｎ ４. ６ ２. ３ ６３. ７ ４２. ２
Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ｖａｒ. ｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｍ
ＶＤＬ４４ ７. ５ ± ０. ８ ２. ８ ± １. ２ ７２. ９ ± ３０. ８ ３１. ６ ± ８. ５ － － －
ＶＤＬ４５ ７. ７ ± １. ２ ２. ６ ± ０. ５ ８７. ９ ± ４２. ５ ３７. ０ ± １７. ２ － － －
ＶＤＬ４６ ７. ８ ± １. ０ ３. ４ ± ０. ７ １０７. ５ ± ４３. ７ ２４. ４ ± ９. ８ － － －
Ｍｅａｎ ７. ７ ３. ０ ８９. ４ ３１. ０
Ｖ. ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ
ＶＮＩ１ ３. ８ ± １. ３ １. ８ ± ０. ５ － － ５. ２ ± ０. ９ ４. １ ± ０. ７ －
ＶＮＩ２ ３. ４ ± ０. ５ １. ７ ± ０. ３ － － ５. ９ ± １. １ ５. ２ ± ０. ９ －
Ｍｅａｎ ３. ６ １. ７ ５. ５ ４. ６
Ｖ. ｎｕｂｉｌｕｍ
ＶＮＵ１ ６. ２ ± ２. ０ ２. ０ ± ０. ４ － － １０. ３ ± ２. ２ ６. ８ ± １. ６ －
Ｖ. ｔｒｉｃｏｒｐｕｓ
ＶＴＲ１ ５. ２ ± ０. ９ ２. ４ ± ０. ４ ５４. ３ ± ２０. １ ３１. ７ ± １２. ３ ７. ４ ± １. ３ ６. １ ± ０. ９ ＋
Ｎｏｔｅ: Ｔｈｅ ｓｙｍｂｏｌｓ “ ＋ ” ａｎｄ “ － ” ｉｎ ｔｈｅ ｔａｂｌｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｎｏｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓｃｌｅｒｏｔｉａꎬ ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｅｓ
ｏｒ ｒｅｓｔｉｎｇ ｍｙｃｅｌｉａꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
８７２
　
　 ３ 期 　 　 段维军ꎬ等:检疫性轮枝菌及其近似种的鉴定
和微菌核ꎬ但来自于 ＣＢＳ的 ＶＡＡ３９ 和自我国新疆
采集的菌株 ＶＡＡ２ 和 ＶＡＡ２７ 均未观察到休眠菌
丝ꎻ供试大丽轮枝菌除 ＶＤ１１ 外均可产生大量黑色
微菌核ꎬ 大丽轮枝菌长孢变种菌株 ＶＤＬ４４、
ＶＤＬ４５、ＶＤＬ４６ 所产微菌核较大丽轮枝菌所产微
菌核更加细长ꎬ其平均长宽比均大于 ２ꎻ供试变黑
轮枝菌 ＶＮＩ１、ＶＮＩ２、云状轮枝菌 ＶＮＵ１ 和三体轮
枝菌 ＶＴＲ１ 均可产生厚垣孢子ꎬ但 ＶＮＵ１ 和 ＶＴＲ１
厚垣孢子较大ꎬ此外 ＶＴＲ１ 可同时产生微菌核和休
眠菌丝ꎬ而变黑轮枝菌与云状轮枝菌不能产生微菌
核和休眠菌丝ꎮ
从形态学测量数据来看(表 ３)ꎬ供试菌株中分
生孢子最大的是菌株 ＶＤＬ４６ꎬ其平均长宽分别达
７. ８ μｍ和 ３. ４ μｍꎬ菌株 ＶＤＬ４５ 和 ＶＤＬ４４ 次之ꎻ
分生孢子最小的是 ＶＮＩ２ꎬ其平均长宽分别为 ３. ４
μｍ和 １. ７ μｍꎮ 供试产微菌核的菌株中ꎬ以大丽
轮枝菌长孢变种菌株所产微菌核最大ꎬ其平均长宽
分别为 ８９. ４ μｍ 和 ３１. ０ μｍꎬ平均长宽比为 ３. ０ꎬ
大丽轮枝菌所产微菌核较小ꎬ平均长宽比为 １. ５ꎬ
菌株 ＶＡＡ４１ 所产微菌核最小ꎮ 供试产厚垣孢子
菌株中ꎬ以云状轮枝菌所产厚垣孢子最大ꎬ其平均
长宽分别达 １０. ３ μｍ 和 ６. ８ μｍꎬ２ 株变黑轮枝菌
菌株所产生厚垣孢子平均长宽分别为 ５. ５ μｍ 和
４. ６ μｍꎮ 供试产休眠菌丝菌株中ꎬ菌株 ＶＡＡ４１ 所
产休眠菌丝呈束状ꎬ而菌株 ＶＡＡ４０、 ＶＡＡ４２、
ＶＡＡ４３ 和 ＶＴＲ１ 均产生单根非束状的休眠菌丝ꎮ
２. ２　 温度适应性研究
供试所有菌株在 １５ ~ ２５℃范围内均可正常生
长ꎬ但供试 ６ 株黑白轮枝菌ꎬ在 ３０℃下生长停止或
极为缓慢ꎬ其余所有菌株在 ３０℃条件下均可生长ꎬ
但有不同程度的抑制ꎮ 供试黑白轮枝菌 ６ 株菌株
中有 ４ 株在 ２０℃条件下生长最快ꎬ最高生长速度
达 ３. ３ ｍｍ / ｄꎮ 供试 １１ 株大丽轮枝菌菌株中ꎬ有 ８
株在 ２５℃下生长速度最快ꎬ最高生长速度达 ３. ４
ｍｍ / ｄꎮ ３ 株大丽轮枝菌长孢变种中有 ２ 株在 ２０℃
条件下生长最快ꎬ在 ３０℃条件下生长受到不同程
度抑制ꎮ 供试 ２ 株变黑轮枝菌生长速度差异较大ꎬ
其最高生长速度相差近 ２ 倍ꎮ 云状轮枝菌菌株
ＶＮＵ１ 在 ２０℃下生长最快ꎬ达 ３. ３ ｍｍ / ｄꎬ而三体
轮枝菌菌株 ＶＴＲ１ 在 ２５℃下生长最快ꎬ达到 ３. ３
ｍｍ / ｄ(表 ４)ꎮ
２. ３　 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ片段的扩增和克隆
供试不同菌株 ＩＴＳ 序列长度 ５３９ ~ ５５９ ｂｐ 不
等ꎬ其中 ７ 株黑白轮枝菌菌株为 ５３９ ~ ５４１ ｂｐꎬ １１
株大丽轮枝菌菌株和 ３ 株大丽轮枝菌长孢变种为
５４１ ~ ５４２ ｂｐꎬ１ 株云状轮枝菌为 ５４１ ｂｐꎬ１ 株三体
轮枝菌为 ５４０ ｂｐ ꎬ２ 株变黑轮枝菌均为 ５５９ ｂｐꎮ 所
测定序列 ＩＴＳ１ 的序列长度为 １２６ ~ １４１ ｂｐꎬ ＩＴＳ２
的序列长度为 １６５ ~ １７０ ｂｐꎬ５. ８Ｓ 的序列很保守ꎬ
长度均为 １５６ ｂｐꎮ 将比对分析正确的序列提交美
国生物信息中心(ＮＣＢＩ)公共数据库 ＧｅｎＢａｎｋꎬ登
录号见表 １ꎮ
２. ４　 系统发育分析
系统发育分析结果见图 １ꎮ 植物病原性轮枝
菌可划分为 ９ 个不同的分支ꎬ即:Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ 分支
(ｂｏｏｔｓｔｒａｐ值为 ９９)、Ｖ. ｎｕｂｉｌｕｍ 分支(ｂｏｏｔｓｔｒａｐ 值
为 ９７)、Ｖ. ｔｒｉｃｏｒｐｕｓ 分支( ｂｏｏｔｓｔｒａｐ 值为 ９７)、Ｖ.
ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ分支( ｂｏｏｔｓｔｒａｐ 值为 １００)、Ｖ. ｔｈｅｏｂｒｏ￣
ｍａｅ 分支 ( ｂｏｏｔｓｔｒａｐ 值为 １００ )、 Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ｖａｒ.
ｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｍ分支(ｂｏｏｔｓｔｒａｐ值为 ６４)和 ３ 个不同的
Ｖ. ａｌｂｏ￣ａｔｒｕｍ分支ꎮ 其中 Ｖ. ｔｈｅｏｂｒｏｍａｅ和 Ｖ. ｎｉ￣
ｇｒｅｓｃｅｎｓ与其他植物病原性轮枝菌亲缘关系较远ꎬ
Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ、 Ｖ. ｎｕｂｉｌｕｍ、Ｖ. ａｌｂｏ￣ａｔｒｕｍ、 Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ
ｖａｒ. ｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｍ、Ｖ. ｔｒｉｃｏｒｐｕｓ亲缘关系较近ꎬ获得
了 １００ 的 ｂｏｏｔｓｔｒａｐ 值支持ꎬ其中又以 Ｖ. ａｌｂｏ￣ａｔ￣
ｒｕｍ分支 １、Ｖ. ａｌｂｏ￣ａｔｒｕｍ 分支 ２、Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ｖａｒ.
ｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｍ分支和 Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ 分支亲缘关系最为
接近ꎬ而 Ｖ. ａｌｂｏ￣ａｔｒｕｍ分支 ３ 与 Ｖ. ｔｒｉｃｏｒｐｕｓ分支
亲缘关系较近(图 １)ꎮ 分析各序列分离物寄主来
源可知ꎬＶ. ａｌｂｏ￣ａｔｒｕｍ 分支 １ 寄主为非苜蓿类寄
主ꎬＶ. ａｌｂｏ￣ａｔｒｕｍ 分支 ２ 的寄主均为苜蓿ꎬＶ. ａｌ￣
ｂｏ￣ａｔｒｕｍ分支 ３ 的寄主主要为马铃薯及其土壤ꎬ其
他分支与寄主及其地理来源无关ꎮ Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ 分
支中包含有 Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ｖａｒ. ｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｍ 分离物
ＶＤＬ４４ 的序列和 ＡＦ３６４００７ꎮ
３　 讨论
黑白轮枝菌和大丽轮枝菌能够在全球各地
(特别是温带和冷凉地区)ꎬ造成多种植物的黄萎
病害ꎬ是轮枝菌属内最重要的植物病原真菌ꎮ 在早
期研究中ꎬ对这两种的种类划分存在较大分歧ꎮ
Ｒｅｉｎｋｅ等[２３]于１８７９年描述了一种造成马铃薯黄
９７２
　
植物病理学报 ４３ 卷
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｅｓｔｅｄ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ. ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ.
Ｉｓｏｌａｔｅｓ Ｓｐｅｃｉｅ
Ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ / ｍｍ􀅰ｄ －１
１５℃ ２０℃ ２５℃ ３０℃
ＶＡＡ２ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ. ａｌｂｏ￣ａｔｒｕｍ ２. １ ± ０. ２ ３. ０ ± ０. １ ３. １ ± ０. ３ ０. ２ ± ０. １
ＶＡＡ２７ Ｖ. ａｌｂｏ￣ａｔｒｕｍ １. ７ ± ０. １ ２. ７ ± ０ ３. １ ± ０. １ ０
ＶＡＡ３９ Ｖ. ａｌｂｏ￣ａｔｒｕｍ ２. ２ ± ０. １ ３. ３ ± ０. １ ２. ３ ± ０ ０. １ ± ０. １
ＶＡＡ４０ Ｖ. ａｌｂｏ￣ａｔｒｕｍ ２. ８ ± ０. １ ３. ２ ± ０. ２ ２. ５ ± ０. １ ０
ＶＡＡ４１ Ｖ. ａｌｂｏ￣ａｔｒｕｍ １. ８ ± ０. １ ２. ２ ± ０. ３ １. ７ ± ０. ２ ０
ＶＡＡ４２ Ｖ. ａｌｂｏ￣ａｔｒｕｍ ２. ０ ± ０. ２ ３. ３ ± ０. ６ ２. ４ ± ０. ２ ０
ＶＡＡ４３ Ｖ. ａｌｂｏ￣ａｔｒｕｍ ２. ２ ± ０. ３ ２. ６ ± ０. ２ ２. １ ± ０. １ ０
ＶＤ１ Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ １. ５ ± ０. １ ２. ５ ± ０. １ ２. ９ ± ０. １ １. １ ± ０. １
ＶＤ２ Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ １. ６ ± ０. １ ２. １ ± ０. １ ２. ６ ± ０. １ ０. ７ ± ０. ５
ＶＤ５ Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ １. ６ ± ０. ２ ２. ３ ± ０ ３. １ ± ０. ２ １. ５ ± ０. １
ＶＤ６ Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ １. ７ ± ０. ４ ２. ８ ± ０. １ ２. ９ ± ０. ２ ０. ８ ± ０. １
ＶＤ７ Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ １. ５ ± ０. ３ ２. ５ ± ０. １ ２. ３ ± ０ ０. ６ ± ０
ＶＤ１１ Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ２. １ ± ０. １ ２. ９ ± ０. ２ ２. ２ ± ０. ６ １. ２ ± ０. ２
ＶＤ１２ Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ２. ５ ± ０. １ ３. ２ ± ０. １ ３. ４ ± ０. １ ２. ０ ± ０. １
ＶＤ１３ Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ １. ３ ± ０. １ ２. ４ ± ０. １ ３. １ ± ０. １ ０. ９ ± ０. ２
ＶＤ３０ Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ２. ３ ± ０. ３ ２. ７ ± ０. ３ ３. １ ± ０. ２ ０. ７ ± ０. ２
ＶＤ３１ Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ １. ９ ± ０. １ ３. ０ ± ０. ３ ３. １ ± ０. １ ０. ８ ± ０. １
ＶＤ３２ Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ２. ２ ± ０. ３ ２. ６ ± ０. ２ ３. ４ ± ０. ２ ０. ８ ± ０. １
ＶＤＬ４６ Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ｖａｒ. ｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｍ １. ２ ± ０. １ １. ６ ± ０. １ １. ８ ± ０. １ ０. ９ ± ０. １
ＶＤＬ４４ Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ｖａｒ. ｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｍ １. ６ ± ０. １ ２. ５ ± ０. １ ２. ５ ± ０. １ ０. ４ ± ０. １
ＶＤＬ４５ Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ｖａｒ. ｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｍ １. ７ ± ０ ２. ５ ± ０. １ ２. ２ ± ０. １ ０. ３ ± ０. １
ＶＮＩ１ Ｖ. ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ １. ２ ± ０. ２ ２. ０ ± ０. ２ １. ８ ± ０. ２ ０. ９ ± ０. １
ＶＮＩ２ Ｖ. ｎｉｇｒｅｓｃｅｎｓ １. ７ ± ０. １ ２. ９ ± ０. ２ ４. ０ ± ０. １ ３. ０ ± ０. １
ＶＮＵ１ Ｖ. ｎｕｂｉｌｕｍ ２. ５ ± ０. １ ３. ３ ± ０. １ ２. ３ ± ０. ４ １. ９ ± １. ４
ＶＴＲ１ Ｖ. ｔｒｉｃｏｒｐｕｓ ２. ０ ± ０. ２ ３. ２ ± ０. ２ ３. ３ ± ０. ４ ０. ６ ± ０. ２
Ｎｏｔｅ: Ｔｈｅ ｄａｔａ ａｒｅ ｍｅａｎｓ ａｎｄ ｓｔａｎｄａｒｄ ｄｅｖｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｒｅｐｅａｔｓ (７ ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ｃｕｌｔｕｒｉｎｇ ｏｎ ＰＤＡ ｐｌａｔｅｓ ａｔ ｐＨ ６. ０) .
萎病的病菌ꎬ由于该病菌菌丝体颜色的加深(形成
休眠菌丝)ꎬ会造成马铃薯受侵染部颜色变黑或变
为深褐色ꎬ故将其命名为黑白轮枝菌ꎮ Ｋｌｅｂａｈｎ[２４]
于 １９１３ 年从萎蔫大丽花上分离获得了另一株轮枝
菌属分离物ꎬ该分离物与黑白轮枝菌具有显著的不
同ꎬ特别是能够产生微菌核ꎬ因而将其命名为大丽
轮枝菌ꎮ 此后ꎬ大丽轮枝菌和黑白轮枝菌种类划分
问题在相关研究者中引起了极大的争论ꎮ 一些研
究者ꎬ如 Ｐｒｅｓｌｅｙ [２５]和 Ｗｉｌｈｅｌｍ 等[２６]ꎬ认为产微菌
核和休眠菌丝的真菌应该属于同一种ꎬ即黑白轮枝
菌ꎮ 其他研究者ꎬ如 Ｋｌｅｂａｈｎ[２４]和 Ｉｓａａｃ 等[２７]ꎬ更
倾向于将它们分为不同种ꎮ 此后ꎬ Ｉｓｓａｃ[２７ꎬ ２８]ꎬ
Ｈｅａｌｅ等[２９]以及 Ｓｍｉｔｈ[３０]对不同寄主上轮枝菌的
形态、培养性状、生理特性等方面进行了大量研究ꎬ
发现黑白轮枝菌和大丽轮枝菌在形态、生理学、地
理分布等各方面均有明显差异ꎬ并显示出较远的亲
缘关系ꎮ 特别是在休眠结构上ꎬ大丽轮枝菌产生黑
色或深褐色的微菌核ꎬ而黑白轮枝菌产生褐色或深
褐色的休眠菌丝[５ꎬ２８]ꎬ该形态特征也是目前全国各
口岸对这两种检疫性真菌进行检疫鉴定所使用的
最重要的种类形态划分依据ꎮ 然而ꎬ供试黑白轮枝
菌菌株 ＶＡＡ４１ 可同时产生微菌核和束状休眠菌
丝ꎬ这与最近 Ｉｎｄｅｒｂｉｔｚｉｎ 等[１４]对该独特分支的研
究结果相一致ꎬ前人研究矛盾之处很可能是由于该
类群真菌独特休眠结构所造成的ꎮ 部分菌株存在
丧失产微菌核或休眠菌丝能力的现象ꎬ如供试大丽
０８２
　
　 ３ 期 　 　 段维军ꎬ等:检疫性轮枝菌及其近似种的鉴定
Ｆｉｇ. １　 Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ｔｈｅ ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇ (ＮＪ) ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎｆｅｒｒｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅａｒ
ｅｎｃｏｄｅｄ ＩＴＳ ｒｅｇｉｏｎｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ＩＴＳ１ꎬ ５. ８Ｓ ｒＤＮＡ ａｎｄ ＩＴＳ２ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐｐ.
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｏｕｔｇｒｏｕｐ. Ｎｕｍｅｒａｌｓ ａｔ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｎｏｄｅｓ ａｒｅ ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｖａｌｕｅｓ ｆｏｒ
１ ０００ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ ｇｒｅａｔｅｒ ｔｈａｎ ５０％ . Ｂｒａｎｃｈ ｌｅｎｇｔｈｓ ａｒｅ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌ ｔｏ ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｈａｎｇｅꎬ ｗｈｉｃｈ ｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｓｃａｌｅ ｂａｒ ｂｅｌｏｗ ｔｈｅ ｔｒｅｅ.
１８２
　
植物病理学报 ４３ 卷
轮枝菌 ＶＤ１１ 不产生微菌核ꎬ黑白轮枝菌 ＶＡＡ２、
ＶＡＡ２７ 和标准菌株 ＶＡＡ３９ 不产生休眠菌丝ꎬ这可
能是由于继代培养过程中产休眠结构能力丧失所
造成ꎮ 实验过程中观察到部分菌株存在菌落角变
现象ꎬ角变菌落在形态上分化很大ꎬ这也有可能是
产休眠结构能力丧失原因之一ꎬ但其发生机理有待
进一步研究ꎮ 温度梯度实验表明ꎬ大丽轮枝菌普遍
具有较强高温耐受力ꎬ３０℃下仍然能够生长ꎬ而黑
白轮枝菌在 ３０℃下生长受到强烈抑制ꎮ 大丽轮枝
菌在温度高于 ３０℃时仍会造成植物发病ꎬ黑白轮
枝菌在高于 ２５℃ ~２８℃时不会引起植物病害症状
的发生[５ꎬ ３０ꎬ ３１]ꎬ这与本研究中两种病菌的温度适
应性相一致ꎬ可能是温度对病菌抑制作用不同所造
成ꎮ 系统发育分析表明ꎬ供试大丽轮枝菌聚为一个
分支ꎬ与其寄主或地理来源没有关系ꎬ其中包括大
丽轮枝菌长孢变种 ＶＤＬ４４ 以及序列 ＡＦ３６４００７ꎬ其
余长孢变种序列聚为另一个分支ꎬ这与 Ｉｎｄｅｒｂｉｔｚｉｎ
等[７]的研究相一致ꎬ可能与大丽轮枝菌长孢变种
起源有关ꎮ 有研究表明[７ꎬ １２ꎬ ３２]大丽轮枝菌长孢变
种可能是轮枝菌种间杂交所致ꎬ其中一个亲本是大
丽轮枝菌ꎮ 供试黑白轮枝菌聚为三个不同分支ꎬ分
支 １ 和 ２ 亲缘关系较为密切ꎬ这两个分支的划分与
寄主有关而与地理来源无关ꎬ侵染苜蓿的菌株聚在
了黑白轮枝菌分支 ２ꎬ其他寄主则聚在黑白轮枝菌
分支 １ꎮ 黑白轮枝菌分支 ３ 中分离物的寄主均为
马铃薯及其土壤ꎬ与三体轮枝菌具有更为密切的亲
缘关系ꎬ 与其他黑白轮枝菌亲缘关系较远ꎮ
Ｍａｈｕｋｕ等[３３]研究发现ꎬ黑白轮枝菌 Ｇｒｐ ２ 类群产
生呈束状的休眠菌丝ꎬ其寄主来源主要为马铃薯及
其土壤ꎬ具有与其他黑白轮枝菌和三体轮枝菌不同
的序列特征ꎬ黑白轮枝菌 Ｇｒｐ ２ 类群可能是不同于
黑白轮枝菌与三体轮枝菌的另外一种轮枝菌ꎬ本研
究进一步确认了这一结果ꎮ 最近ꎬＩｎｄｅｒｂｉｔｚｉｎ 等[１４]
已经对轮枝菌属进行了重新划分ꎬ将这一类群与其
他类群黑白轮枝菌划分为 ３ 个新种ꎮ
Ｂａｒｂａｒａ 等[３]于 １９６１ 年描述了来自于山葵的
大丽轮枝菌长孢变种ꎬ该病菌在北美和欧洲地区的
甘蓝、油菜、山葵和多种植物上已有发生危害报
道[５ꎬ １２ꎬ ３４ꎬ ３５]ꎬ但我国迄今未见相关报道ꎮ 该变种
与大丽轮枝菌主要区别在于ꎬ由其所产生分生孢子
长度可达 ７ ~ ９ μｍꎬ几乎为大丽轮枝菌的 ２ 倍[３２]ꎮ
本研究中三株大丽轮枝菌长孢变种的分生孢子长
度平均值为 ７. ７ μｍꎬ远大于供试大丽轮枝菌菌株
(４. ６ μｍ)ꎮ Ｓｔｅｖｅｎｔｏｎ 等[３６]研究发现大丽轮枝菌
长孢变种微菌核更加细长ꎬ我们的研究进一步证实
了这一结果ꎬ本研究中大丽轮枝菌长孢变种微菌核
长宽比均大于 ２ꎬ而供试大丽轮枝菌所有菌株的微
菌核平均长宽比均小于 ２ꎮ 此外ꎬ大丽轮枝菌长孢
变种分生孢子中 ＤＮＡ 含量接近大丽轮枝菌的
１􀆰 ７５ 倍[３ꎬ ３２ꎬ３６]ꎮ 基于该变种与大丽轮枝菌在形态
学和分子生物学性状上的差异ꎬＫａｒａｐａｐａ 等[３２]认
为应将欧洲油菜上分离的大丽轮枝菌长孢变种上
升到新种高度ꎬ即 Ｖ. ｌｏｎｇｉｓｐｏｒｕｍꎮ 然而ꎬ也有一
些与此不一致的报道ꎮ 如来自于英国球芽甘蓝
(Ｂｒｕｓｓｅｌｓ ｓｐｒｏｕｔｓ)的一株分离物具有较高的 ＤＮＡ
含量ꎬ但是分生孢子却较短[３２]ꎮ 分离物 Ｖ３３ 具有
较长分生孢子ꎬ但是 ＤＮＡ 含量却比较低[３６]ꎮ 因
此ꎬ对该种的划分仍然存在较大争议ꎬＣｏｌｌｉｎｓ等[１２]
建议将所有只产生微菌核作为休眠结构的轮枝菌
属分离物均归为大丽轮枝菌ꎬ故本文仍将其列为大
丽轮枝菌长孢变种ꎮ
Ｐｅｔｈｙｂｒｉｄｇｅ[３７]于 １９１９ 年报道了另外两种轮枝
菌ꎬ均可产生单个或串生的厚垣孢子ꎬ腐生在马铃
薯块茎上ꎬ区别在于其中一种轮枝菌产生的厚垣孢
子通常小于另一种ꎬＰｅｔｈｙｂｒｉｄｇｅ命名产较小厚垣孢
子的为变黑轮枝菌ꎬ较大的为云状轮枝菌ꎮ 本研究
中菌株 ＶＮＩ１ 和 ＶＮＩ２ 的厚垣孢子平均长宽分别为
５. ２ ~ ４. １ μｍ 和 ５. ９ ~ ５. ２ μｍꎬ而 ＶＮＵ１ 为 １０. ３
~ ６. ８ μｍꎬ这与 Ｐｅｔｈｙｂｒｉｄｇｅ 研究结果一致ꎮ 作为
番茄病原菌的另一种轮枝菌三体轮枝孢由 Ｉｓｓａｃ 于
１９５３ 年命名报道[２８]ꎬ该菌能够寄生于金鱼草、马
铃薯、薄荷、甜瓜、棉花和多种杂草[３８ꎬ ３９]ꎬ近年来在
莴苣和洋蓟上也有发生危害报道[３９ꎬ ４０]ꎬ由于该病
菌可同时产生三种休眠结构(微菌核、暗色休眠菌
丝和厚垣孢子)而被命名为三体轮枝孢ꎬ这与本研
究观察结果相一致ꎮ 系统发育分析表明ꎬ变黑轮枝
菌、云状轮枝菌、三体轮枝菌和 Ｖ. ｔｈｅｏｂｒｏｍａｅ 均
形成了 Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ 支持值较高的单一分支ꎬ说明这
些菌株的遗传结构相对比较简单ꎮ
传统上ꎬ轮枝菌种类鉴定的主要依据是微菌
核、厚垣孢子、休眠菌丝的有无等ꎮ 一般认为黑白
轮枝菌仅能产生黑色的休眠菌丝ꎬ大丽轮枝菌能产
生微菌核却不产生休眠菌丝ꎬ三体轮枝菌可以同时
产生黑色的休眠菌丝、微菌核及厚垣孢子ꎬ变黑轮
２８２
　
　 ３ 期 　 　 段维军ꎬ等:检疫性轮枝菌及其近似种的鉴定
枝菌和云状轮枝菌只产生厚垣孢子等[３]ꎮ 然而ꎬ
不同轮枝菌常因环境条件的影响而发生变异ꎬ如培
养基不同和培养时间不同等ꎬ其形态变异主要表现
为菌落形态的改变和产休眠结构能力的丧失
等[４１]ꎬ这对于借助形态进行不同轮枝菌的准确鉴
定带来了很大困难ꎮ 真菌的核糖体 ＲＮＡ 基因簇
同时存在于细胞核内与线粒体中ꎬ由高度保守区和
可变区组成ꎮ 以核糖体为代表的核基因标记已被
广泛用于构建系统发育树、预测种群结构、评估种
群进化过程ꎬ生态学研究以及确定物种分类地位
等ꎮ 本研究在生物学性状观察基础上ꎬ探讨了检疫
性轮枝菌与其他植物病原性轮枝菌形态和温度适
应性差异ꎬ利用植物病原性轮枝菌的 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ 序
列成功构建了其系统发育树ꎬ将供试菌株划分成 ９
个分支ꎬ结果较好地显示了植物病原性轮枝菌的系
统进化关系ꎬ这为检疫性轮枝菌的准确划分提供了
重要依据ꎮ
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植物病理学报 ４３ 卷
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[４１] Ｇｏｕｄ Ｊ Ｋ Ｃꎬ Ｔｅｒｍｏｒｓｈｕｉｚｅｎ Ａ Ｊꎬ Ｇａｍｓ Ｗ. Ｍｏｒｐｈｏｌ￣
ｏｇｙ ｏｆ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ ａｎｄ Ｖ. ｔｒｉｃｏｒｐｕｓ ｏｎ ｓｅｍｉ￣
ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍｅｄｉａ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｖ. ｄａｈｌｉａｅ ｉｎ
ｓｏｉｌ [ Ｊ ] . Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈꎬ ２００３ꎬ １０７ ( ７ ):
８２２ －８３０.
责任编辑:曾晓葳
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