全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$十二五(国家
(-%
计划"
!"#!22#""!"!)$
#&农业部国家大宗蔬菜现代产业体系细胞育种岗位专项"
3245)!*)2)"%
#
作者简介$周年英"
#&&"
#!女!在读硕士研究生!主要从事蔬菜遗传育种研究)
6)78/9
$
:1
;
#!!$
!
#!-,<=7
"
通信作者$冯
!
辉!教授!博士生导师!主要从事蔬菜遗传育种研究)
6)78/9
$
>?1
@
AB/888
!
!-%,1?C
基于小孢子培养创制的青梗菜四倍体鉴定与利用
周年英!章
!
云!牛瑞青!陈
!
颖!范洪华!刘
!
畅!冯
!
辉"
"沈阳农业大学 园艺学院!沈阳
##"(--
#
摘
!
要$以通过小孢子培养获得的青梗菜小孢子植株自交后代群体为试材!利用形态学鉴定*流式细胞仪鉴定和根
尖染色体计数法筛选四倍体!选择优良的四倍体株系配制杂交组合!通过品种比较试验*营养品质和耐抽薹性分析
筛选优良杂交组合)结果表明$"
#
#从
!%!
株青梗菜小孢子植株自交后代群体中共鉴定出
+-
个四倍体纯系!四倍
体比率达到
%!,+-D
!并以自交系间杂种(的四倍体频率最高&这些四倍体品系表现出生长健壮*主茎变粗*花器官
变大*自交结实率降低等特征)"
!
#利用
##
个自交结实率较高*园艺学性状优良的四倍体株系配制
#*
个杂交组
合!大部分杂交组合具有显著的杂种优势)"
%
#四倍体青梗菜植株的可溶性糖*可溶性蛋白含量均比二倍体显著增
加!而有机酸*粗纤维含量则明显降低!且大部分有较强的耐抽薹性)"
$
#四倍体杂交组合+
E##FE#"
,园艺学性状
优良*杂种优势强*营养成分含量高*耐抽薹!产量分别显著高于二倍体对照+青梗菜
*
号,和+青梗菜
&
号,
$",&%D
和
%!,%+D
!是一个商品性状优异的四倍体青梗菜杂交组合)
关键词$青梗菜&四倍体&杂种优势&营养品质&耐抽薹性
中图分类号$
G&$%,#
文献标志码$
2
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A1BCS/C/=189
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@
&
1BCS/C/=189
P
B89/C
;
&
Y=9C/1
@
C=9?S81!!
多倍化不仅能增强植物基因活性及酶的差异
性!而且还能提高植株的产量*营养品质和抗逆性
等)蔬菜多倍体育种具有重要的研究和应用价值!
是培育优质高产蔬菜品种的重要途径之一)目前蔬
菜多倍体育种取得了巨大成就!已在蔬菜作物上获
得了
!"
多个种的多倍体!成功培育出西瓜-#.*甜
瓜-!.*不结球白菜-%.*红菜薹-$.*青花菜-*.*大白菜*
生姜*黄瓜*菠菜*茄子*芜菁等蔬菜多倍体)青梗菜
是小白菜中一类叶片亮绿*束腰*品质优良的品种!
在中国各地广泛栽培!也是韩国和日本的主栽小白
菜品种类型!目前利用的青梗菜品种主要是二倍体
品种)中国自
!"
世纪
("
年代初开始小白菜多倍体
育种研究!刘惠吉等-%.选育出第一个同源四倍体白
菜品种南农矮脚黄(!它比相应二倍体的
]<
*氨基
酸*还原糖含量及产量都显著增加!抗逆性也明显增
强!粗纤维却大幅度减少)
小孢子培养方法获得的是单倍体*双单倍体和
多倍体的混合群体-.!目前关于小孢子培养获得的
青梗菜四倍体的杂种优势*营养成分*耐抽薹性等方
面的研究尚未见报道)本研究以经小孢子培养获得
小孢子植株后代群体为材料!通过形态学鉴定法*流
式细胞仪鉴定法和根尖染色体压片法鉴定倍性!筛
选出
+-
个四倍体株系)然后通过品种比较试验*营
养品质和耐抽薹性分析筛选出了
#
个园艺学性状优
良*产量高*杂种优势强*营养成分含量高和耐抽薹
的四倍体杂交组合+
E##FE#"
,!从而证明可以利用
小孢子培养方法选育新的四倍体青梗菜品种)
#
!
材料和方法
@,@
!
材料培养
试验在辽宁省十字花科蔬菜遗传育种重点实验
室进行)供试材料是小孢子植株自交授粉后获得的
!%!
份青梗菜材料!分别来自+华王,*+华冠,*
+
2^""#
,*+早生华京,*+
\I
系杂交种,"由本课题组
之前获得的
\I
系+华王,
F
+夏帝,杂交而得#*+自
交系间杂交种,-利用本课题组之前获得的高代自交
系
+"*)#
"+华冠,#
F+"*)!
"+华冠,#杂交而得.*+维
多利亚,等)
!"#!
年
(
月
#
日种子催芽春化!
!"X
后芽播于
*"
孔穴盘中!
&
月
&
日移栽花盆!
#"
月中
旬开花!生育期内正常水肥管理)
@,A
!
青梗菜四倍体的筛选鉴定
@,A,@
!
植株形态学鉴定
!
!"#!
年
&
月
!(
日进行
植株苗期形态指标调查!形态指标有叶形*叶片大
小*叶色*生长势*叶厚等&自
#"
月
!"
日起盛花期及
种子成熟期进行花期形态指标调查!花期考察的形
态指标有花蕾大小*花瓣大小及颜色*花药发育状
况*角果大小*种子大小*自交结籽情况等)
@,A,A
!
流式细胞仪鉴定
!
植株幼苗时期!利用流式
细胞仪"美国
_?<[781
公司#测定青梗菜植株单细
胞的
\L2
含量)取面积约为
#<7
! 的新鲜嫩叶!
放在洁净的培养皿中!加入
#,*7R3A=
VV
/1
@
_B>>)
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缓冲液"
L8
!
6\E2! 7=9
%
R
!
ES/0#* 7=9
%
R
!
L839!" 7=9
%
R
!
3`9(" 7=9
%
R
!
ES/C=1 a)#""
",#D
!
)
巯基乙醇
#*7=9
%
R
!精胺
",*7=9
%
R
#!用
镊子剪碎叶片!
%""
目筛网过滤!
#"""S
%
7/1
下离
心
#"7/1
!弃上清液!加入
#7RbO
"碘化丙锭#染色
剂后避光放置
#*7/1
!
*""
目筛网进行过滤!滤液收
集在流式试管中!即可上机检测)以标准二倍体为
对照!根据分离峰的位置来确定样品倍性)
@,A,B
!
根尖染色体鉴定
!
将种子接种至培养基
"
U5
培养基
c%"
@
/
R
#蔗糖
c+,*"
@
/
R
#琼脂#
中!
V
I*,(
!约
#X
后种子生根!待根尖长到
",*
"
#,"<7
!取根尖!先后经
$d
饱和的对二氯苯预处理
!A
和卡诺固定液"冰醋酸
e
无水乙醇
f#e%
#固定
!$A
!然后用
#77=9
/
R
#
I39
在
-"d
水浴条件
下解离
#*7/1
!最后采用卡宝品红染色制作压片!
于
#""
倍显微镜"
LO` JL("/
#下进行染色体计数并
拍照!确定植株的倍性)
@,B
!
四倍体株系的评价
@,B,@
!
四倍体株系杂交组合的杂种优势测定
!
从
+-
株四倍体株系中筛选出
##
个结籽数接近二倍
体*综合性状优良的四倍体株系为亲本!随机配制杂
交组合)
!"#%
年
(
月下旬!将收获的自交种及杂交
种同时播种于穴盘!
&
月中旬定植!
#"
月末测产)品
种比较试验采用随机区组设计!
%
次重复!小区面积
#,!-7
!
!每小区种植
%"
株!株距
#*<7
!以二倍体
商业品种+青梗菜
*
号,和+青梗菜
&
号,为对照)每
小区随机取样
#"
株!测量株高*株幅*单株质量*叶
柄长*叶柄宽*叶片长*叶片宽*叶色*叶型和小区产
量)根据各杂交组合及其亲本的小区产量计算杂种
%&&#
#"
期
!!!!!!!!!!!
周年英!等$基于小孢子培养创制的青梗菜四倍体鉴定与利用
优势强度!计算公式为$
!f
"
"
#
#
$
#%
#
%
!
"
%
#
%
!
#
#
$
f#
%
!
"
%
#
c%
!
#
式中!
!
为杂种优势!
%
#
为平均值较大的亲本!
%
!
为平均值较小的亲本)
@,B,A
!
营养品质测定
!
植株采收期!随机选取
%
株
测定营养品质含量!包括可溶性糖*可溶性蛋白*有
机酸和粗纤维含量)其中!可溶性糖含量采用蒽酮
比色法-+.测定&可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝
M)!*"
染色法-+.&有机酸含量测定采用酸碱中和滴定
法-+.&粗纤维含量测定采用酸碱洗涤法-(.)
@,B,B
!
耐抽薹性调查
!
将收获的自交种子及杂交
种子于
!"#%
年
$
月中旬播种于穴盘中!
*
月中旬定
植于田间!
%
次重复!小区面积
#,#$7
!
!每小区种植
!"
株!株距
!"<7
!以二倍体品种+青梗菜
*
号,和
+青梗菜
&
号,为对照!调查耐抽薹性)
抽薹指数参照苏小俊等-&.分级方法!略有改动)
其中!
%
级改为有蕾!短缩茎长
!
"
*<7
&
*
级改为抽
薹!薹长
*
"
#"<7
&
+
级改为抽薹!薹长
#
#"<7
&
&
级改为开花!薹长
#
#"<7
&其他条件不变)开花时
间是指植株从播种到主薹第一朵花完全开放时的天
数&薹长是指子叶着生点至生长顶点的距离)耐抽
薹指数公式为$
耐抽薹指数"
D
#
f
$
级数
F
各级株数
&F
调查株数 F#""D
@,C
!
数据分析
用
5b55#-,"
软件进行数据邓肯氏新复极差显
著性分析)
!
!
结果与分析
A,@
!
青梗菜四倍体植株的筛选鉴定结果
A,@,@
!
植株形态学鉴定
!
不同倍性的青梗菜植株
在形态上表现出一定的差异"图版
#
!
#
"
$
#)与双
单倍体植株相比!四倍体植株高大!主茎变粗&花器
官也表现出巨大性!花蕾长*宽显著增加&但是大部
分自交结实率较双单倍体降低"表
#
#)
A,@,A
!
流式细胞仪鉴定
!
图
#
中纵坐标代表测定
细胞数的相对值!横坐标代表荧光通道值!分离峰的
位置表示的是植株倍性!已知二倍体对照的峰值在
!""
附近)因此!测定植株峰值在
!""
附近的是双
单倍体"图
#
!
2
#&测定植株峰值在
$""
附近的是四
倍体"图
#
!
_
#)
用流式细胞仪对
!%!
株青梗菜群体进行单细胞
\L2
含量分析!并采用
U=XQOE
软件分析数据!结
果表明"表
!
#!流式细胞仪检测的
!%!
株青梗菜植
株中!
+-
个是四倍体株系!比率为
%!,+-D
&不同基
因型材料植株的四倍体发生率有明显差别!其中自
交系杂交种(的四倍体百分比最高"
$*,*+D
#!其次
为+华王,和+
2^""#
,"
%%,%%D
#!最低为+维多利亚,
和+华冠,!均没有发现四倍体)
A,@,B
!
根尖染色体压片鉴定
!
通过根尖染色体数
目观察发现!青梗菜双单倍体植株的根尖细胞染色
体数为
!"
条"
!1f!Zf!"
#"图版
#
!
*
#!而四倍体
植株的根尖细胞染色体数为
$"
条"
$1f$Zf$"
#
"图版
#
!
-
#)进一步比较流式细胞仪鉴定法和染
色体计数法鉴定青梗菜植株染色体倍性的结果发
现!流式细胞仪鉴定结果和染色体制片鉴定结果一
致!而且流式细胞仪可以更加快速*准确地鉴定植株
染色体倍性)
A,A
!
青梗菜四倍体株系杂交组合的杂种优势
根据获得的
+-
个青梗菜四倍体株系自交结籽
情况和园艺学性状的综合表现!从中选取
##
个优异
株系)其中!
E"-
*
E##
源自+早生华京,&
E"!
源自
+华王,&
E#"
源自+
2^""#
,&
E#-
*
E!(
*
E!&
*
E%*
源
自+
\I
系杂交种,&
E*(
*
E-#
*
E-!
源自+自交系间
杂交种,)
表
@
!
青梗菜不同倍性植株形态特征比较
E8Y9?#
!
3=7
V
8S/0=1=>7=S
V
A=9=
@
/<89@
X/>>?S?1C
V
9=/X
;V
981C0/1
V
8[倍性
b9=/X
;
编号
3=X?
株高
b981CA?/
@
AC
%
<7
主茎粗
5C?7X/87?C?S
%
<7
花冠大小
3=S=980/:?
%
<7
花蕾长
_BX9?1
@
CA
%
<7
花蕾宽
_BXX/87?C?S
%
<7
平均每荚结实数
L=,0??X0=>
?8V
0B9?
四倍体
E?CS8
V
9=/X
HE!( -&,%%g!,%!(8 #,&#!g","+%8 #,(**g",#!#8 ",-&%g","%%8 ",%(#g","%"8 !,!&
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HE-! *+,&"g$,%"&< #,&#&g",("%8 #,(*$g","+-8 ",-*"g","!"Y ",%(&g",###8 !,$$
双单倍体
\=BY9?X
A8
V
9=/X
H\!- $-,+(g!,%(#X #,$#%g","(!Y #,%*&g",#-(Y ",-""g","%%< ",%"-g","##Y $,-*
H\$$ $+,$$g#,"%#X #,!*$g","*-< #,$%*g","-(Y ",*&(g","!#< ",%"!g","#*Y *,!!
!!
注$差异显著性比较采用邓肯氏新复极差测验!同列不同小写字母表示材料间在
","*
水平存在显著性差异&下同)
L=C?
$
O1\B<81
,
0C?0C
!
CA?X/>>?S?1C07899?CC?S0/1CA?087?<=9B71/1X/<8C?X0/
@
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78C?S/8908C","*9?T?9
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EA?087?80Y?9=W,
$&&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
#
!
青梗菜植株叶片单细胞
\L2
相对含量曲线
2,
双单倍体&
_,
四倍体
Q/
@
,#
!
\L2<=1C?1CX/0CS/YBC/=1/19?8T?0=>
V
981C/1
V
8[2,\=BY9?XA8
V
9=/X
&
_,E?CS8
V
9=/X
表
A
!
青梗菜小孢子植株自交授粉后代中四倍体的发生比率
E8Y9?!
!
48C?=>C?CS8
V
9=/X
V
981C0>S=70?9>)8BC=
V
=9
;V
9=/X
V
981C0/1
V
8[品种
]8S/?C
;
鉴定植株数
L=,=>
/X?1C/>/<8C/=1
四倍体
E?CS8
V
9=/X
株数
LB7Y?S
百分比
b?S@
?
%
D
双单倍体
\=BY9?XA8
V
9=/X
株数
LB7Y?S
百分比
b?S@
?
%
D
华王
IB8W81
@
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2^""# #! $ %%,%% ( --,-+
维多利亚
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68S9
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华冠
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自交系间杂交种
O1YS?X9/1?0A
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系杂交种
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总计
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!!
以上述
##
个四倍体株系为亲本配制
#*
个杂交
组合!进行品种比较试验!调查各杂交组合及其亲本
的小区产量)从表
%
可看出!
#*
个杂交组合大部分
都具有明显的杂种优势!其中+
E##FE#"
,的杂种优
势高达
!-,!(D
!+
E-#FE##
,次之!为
!%,%(D
&大
部分杂交组合的小区产量大于两个对照品种!其中
+
E##FE#"
,的小区平均产量最高"
#!,$%[
@
#且高
于其它四倍体杂交组合!分别高于对照+青梗菜
*
号,和+青梗菜
&
号,
$",&%D
和
%!,%+D
)
A,B
!
青梗菜四倍体植株的营养品质
由表
$
可知!与二倍体植株相比!四倍体青梗菜
植株的可溶性糖*可溶性蛋白含量均显著增加!而有
机酸*粗纤维含量则明显降低)其中!
$
个杂交组合
植株的可溶性糖*可溶性蛋白含量均显著高于相应
的亲本及对照!而其有机酸和粗纤维含量均明显低
于亲本及对照品种!并以杂交组合+
E##FE#"
,的植
株的可溶性糖*可溶性蛋白含量最高"分别为
!,#-D
和
#-,%+7
@
/
@
#
#!而粗纤维含量*有机酸含量较
低)因此!所有四倍体青梗菜杂交组合中+
E##F
E#"
,的营养品质综合表现较优)
A,C
!
四倍体青梗菜杂交组合耐抽薹性
从四倍体青梗菜杂交组合的耐抽薹性调查结果
"表
*
#可知!大部分四倍体植株具有良好的耐抽薹
性!其中极耐抽薹*耐抽薹*中等耐抽薹和不耐抽薹
分别占
#%,%%D
*
$",""D
*
$",""D
和
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!亲本
植株分别占
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和
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杂交组合中+
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,和+
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,的耐抽薹指
数分别为
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和
*,*-D
!都是极耐抽薹类型!亲
本中+
E#"
,和+
E!&
,的耐抽薹指数分别为
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和
*,*-D
!也都是极耐抽薹类型)
综合上述!四倍体杂交组合+
E##FE#"
,不仅产
量显著高于亲本以及两个二倍体对照品种+青梗菜
*
号,和+青梗菜
&
号,!以及其他四倍体杂交组合!
而且具有良好的营养品质和耐抽薹特性!同时叶片
亮绿*束腰性好*园艺学性状优良"图版
#
!
+
"
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#!是
一个商品性状十分优异的四倍体青梗菜杂交组合)
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#"
期
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周年英!等$基于小孢子培养创制的青梗菜四倍体鉴定与利用
表
B
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四倍体青梗菜杂交组合的小区产量及其杂种优势强度
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3=7Y/18C/=181X
CA?/S
V
8S?1C0
小区产量
b9=C
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[
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重复
#
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V
9/<8C/=1
#
重复
$
4?
V
9/<8C/=1
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重复
%
4?
V
9/<8C/=1
%
平均
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青梗菜
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V
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编号
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来源
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D
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V
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粗纤维含量
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二倍体
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V
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自交系间杂交种
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自交系间杂交种
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V
8[材料
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耐抽薹指数
_=9C/1
@
C=9?S81/1X?Z
%
D
耐抽薹性
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@
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,
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,
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@
C=9?S81%
!
讨
!
论
多倍体的一般巨大性(*营养成分含量高及抗
逆性增强等特性!对于以叶片为食用部位的青梗菜
具有重要的利用价值)秋水仙素人工诱导是获得多
倍体蔬菜常用的方法!目前培育四倍体的一条新途
径是利用能产生
!1
配子的亲本与四倍体杂交-#".!
但是
!1
配子发生频率较低)本研究利用小孢子培
养获得
!%!
株青梗菜株系!其中
+-
株是同源四倍
体!同时本试验获得的青梗菜四倍体株系整齐一致!
性状没有发生分离!说明其属于纯系!可作为选育青
梗菜四倍体杂交种的理想亲本材料!这也表明小孢
子培养方法为创制青梗菜四倍体品种提供了一条新
的途径)
近年来!利用流式细胞仪鉴定植物染色体倍性
成为一种快速*可靠的倍性鉴定方法!其最突出的特
点是测量速度快*操作简单而且不受植物取材部位
和细胞所处时期的限制-##)#!.!已成功应用于十字花
科蔬菜的倍性鉴定-#%)#+.)参考前人的研究以及结合
本实验结果!笔者认为流式细胞仪鉴定法快速*可
靠!可用于青梗菜多倍体植株的倍性鉴定&形态学鉴
定法可初步鉴定植株的倍性&根尖染色体数目观察
法虽是最准确的倍性鉴定方法!但是制片操作比较
繁琐以及对细胞学操作技术的要求较高!费工费时!
难以在生产实践中广泛推广)
多倍体蔬菜的营养成分含量可明显提高!而提
高青梗菜品种的可溶性糖*可溶性蛋白质含量和适
当降低有机酸*粗纤维含量!是其品质育种的主要目
标)刘惠吉等-#(.对四倍体不结球白菜的营养品质
进行研究发现!四倍体白菜的
]<
*氨基酸*还原糖及
粗蛋白含量均比二倍体明显增加)本试验同样发
现!四倍体青梗菜的可溶性糖*可溶性蛋白含量均显
著高于二倍体!粗纤维*有机酸含量则明显降低!说
明四倍体青梗菜的营养品质要优于二倍体)同时!
本实验利用结实率接近正常的四倍体纯系配制了
#*
个杂交种!结果发现大部分四倍体青梗菜有显著
的杂种优势)在生产栽培中!先期抽薹问题一直困
扰着中国白菜类生产!解决办法之一就是培育耐抽
薹新品种)本试验结果表明!四倍体植株具有良好
的耐抽薹性!这就为解决白菜类先期抽薹问题和培
育耐抽薹性四倍体青梗菜品种提供了亲本材料)
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二倍体植株蕾期自交结籽良好&
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植株蕾期自交结籽少&
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