全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(2): 120-125(2012)
收稿日期: 2011-02-02; 修回日期: 2011-12-23
通讯作者: 高必达, 教授, 博士生导师, 主要从事分子植物病理学方面研究; E-mail:bdgao@yahoo. com. cn
第一作者: 夏 花(182 - ), 女, 湖南人, 主要从事分子植物病理学研究。
湖南芷江辣椒上一种新炭疽病的病原鉴定
夏 花, 朱宏建, 周 倩, 高必达*
(湖南农业大学生物安全科学技术学院与湖南省植物病虫害生物学与防控重点实验室,
植物疾病控制与利用湖南省高校重点实验室, 长沙 410128)
摘要:2009 年 8 月湖南省芷江县线果型辣椒品种红秀 2003 未成熟果实上发生了一种新炭疽病。 典型病斑长椭圆状,其中
央呈成片黄褐色粉末,外围粉红色小点呈同心圆排列,边缘水渍状。 8 个分离菌株(HNZJ001-HNZJ008)培养时菌落初呈白
色,渐变为浅红色,后期加深, 具明显灰黑色同心轮纹。 分生孢子盘无刚毛, 分生孢子单胞,大小为 15. 8 μm × 4. 1 μm,
含 2 ~ 7 个油球,一端稍尖。 分离菌株 HNZJ001 针刺接种,在离体的成熟果和未成熟果上均产生病斑,而作为对照的胶孢炭
疽菌 Collectotrichum gloeosporioides菌株 LSQ1 不能侵染未成熟果。 核糖体 RNA 基因内转录间隔区( ITS)的 PCR 产物经
测序后做 BLAST 分析,结果表明该菌与尖孢炭疽菌 C. acutatum(有性阶段为尖孢小丛壳 Glomerella acutata)的 ITS 序列
100% 相同,系统进化分析显示置信度高达 100% ,据此确定该病原为尖孢炭疽菌。 这是国内辣椒上尖孢炭疽菌的首次报道。
关键词:Collectotrichum acutatum; 炭疽病; 病原菌; ITS 序列分析
Pathogen identification of a new anthracnose of pepper in Zhijiang, Hunan 　 XIA
Hua, ZHU Hong-jian, ZHOU qian, GAO Bi-da　 (Hunan Provincial Key Laboratory for Biology and Control of Plant
Diseases and Insect Pests, Hunan University Key Laboratory for Control and Utilization of Plant Diseases and College of Bio -
Safety Science & Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)
Abstract: A new anthracnose disease was found on immature fruits of chili pepper (Cayenne pepper cv.
Hongxiu 2003, line fruited) in Zhijiang county, Hunan, in August of 2009. Typical lesion was long oval in
shape with tawny powder at the center, concentric pink dot periphery and outer water soaked zone. All 8 iso-
lates(HNZJ001-HNZJ008) showed the colonies white at the early stage, then pink, finally dark with obvious
grey black concentric rings. No seta was observed on acervuli. Conidia were single-celled, 15. 8 μm ×4. 1
μm in size, with a subacute end and 2 -7 oil droplets in each cell. After needle prick inoculation with spore
suspension,HNZJ001 caused lesions on both mature and immature pepper fruits while the control Collectotri-
chum gloeosporioides strain LSQ1 did not infect immature ones. PCR product was sequenced . After BLAST
analysis, rDNA ITS ( internal transcribed spacer) of HNZJ001 revealed 100% nucleotide identity to that of C.
acutatum (sexual stage Glomerella acutata) . Phylogenetic analysis showed a high bootstrap value of 100% . It
comes into conclusion that the pathogen causing anthracnose of immature pepper in Zhijiang be identified as C.
acutatum. This is the first report of C. acutatum on chili pepper in China.
Key words: chili pepper; Collectotrichum acutatum; anthracnose; pathogen; ITS sequence analysis
中图分类号: S432. 44　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2012)02-0120-06
　 　 2009 年,芷江线果型辣椒品种红秀 2003 未成
熟果实上发生了一种炭疽病,多菌灵、甲基托布津、
百菌清,代森锌、代森锰锌和咪鲜胺等传统用于防
治辣椒炭疽病的药物均没有达到预期效果。 对该
病病原菌进行了分离和柯赫氏法则验证,依据分离
菌株的形态特征和 rDNA ITS 序列分析进行了鉴
定,并将分离菌与胶孢炭疽菌进行了致病性和多菌
灵敏感性的比较。
　
　 2 期 　 　 夏 花,等:湖南芷江辣椒上一种新炭疽病的病原鉴定
1　 材料与方法
1. 1　 病原菌的分离与培养
病果采自湖南省怀化市芷江县。 采用常规分
离法,从病果病健交界处组织进行分离,纯培养物
斜面培养后 4℃冰箱保存备用。
从湖南农业大学灵丝泉实验基地采集发生炭
疽病的红椒,分离到 1 株炭疽病菌株 LSQ1,ITS序
列分析结果为胶孢炭疽菌 Collectotrichum gloeos-
porioides(HQ607386),用作致病力试验的对照菌。
1. 2　 病原菌形态学观察
将病椒切薄片,光学显微镜下观察菌丝特点,
病菌分生孢子、分生孢子梗和分生孢子盘形态,并
测量其大小。
1. 3　 离体接种试验
在菜市场买到健康的线果型青辣椒,用 75%
的酒精表面消毒处理,细针蘸取分离菌孢子悬浮液
后刺扎辣椒,以灭菌水处理作对照,在 28℃培养箱
中按 12 h光照和 12 h 黑暗交替的条件保湿培养,
定期观察病害发生发展情况,并对接种后发病果实
进行病菌再分离。
为比较此菌与胶孢炭疽菌的致病性差异,在菜
市场买到羊角椒、簇生椒、柿椒和线椒 4 种类型的
辣椒,进行接种试验,定期观察其发病情况。
1. 4　 rDNA ITS 的 PCR扩增与序列分析
1. 4. 1　 病原菌 DNA 的提取　 将分离菌株接种到
PDA平板上进行活化,于 28℃培养箱中黑暗培养
6 d后,用灭菌的药匙将菌丝刮下,称取 0. 5 g 于研
钵中,加入 1 mL裂解液,3 / 10 体积石英砂,研磨充
分后转入 1. 5 mL EP管中,65℃水浴 10 min,然后
加入 600 μL 7. 5 mol / L NaCl 溶液,冰浴 8 min 后
13 000 r / min离心 5 min;取 600 μL上清液到一个
新的 EP管中,加 400 μL 氯仿∶异戊醇(24∶ 1),混
匀;静置分层后取 500 μL 上清至另一新 EP 管,加
入 0. 1 倍体积 NaAc和 2 倍体积的无水乙醇,离心
8 min后收集 DNA,用 70%乙醇洗 DNA 2 次;待乙
醇挥发后,用 0. 1 × TE溶解 DNA, -20℃保存。
1. 4. 2　 rDNA ITS 的 PCR扩增　 PCR引物为真菌
核糖体 RNA 基因( rDNA) ITS 通用引物 ITS4 和
ITS5。 PCR反应体系总体积为 50 μL,反应液为:
10 × PCR buffer 5 μL,dNTP(10 mmol / L) 1 μL,
Taq DNA聚合酶(2. 5 U / μL)1 μL,引物 ITS4 和
ITS5 各 2 μL (25 μmol / L),模板 DNA (100 ng /
μL)1 μL,ddH2O 38 μL,在 PCR 扩增仪上进行扩
增。 PCR扩增条件:95℃预变性 5 min;95℃变性
30 s,56℃退火 30 s,72℃延伸 45 s,共 30 个循环;
最后 72℃延伸 10 min,4℃保存。 扩增产物用 1%
琼脂糖凝胶电泳,用凝胶成像仪进行观察并拍照。
PCR产物委托上海生物工程有限公司进行测序。
1. 4. 3　 序列分析与数据处理　 rDNA ITS 的 PCR
产物核苷酸序列经 BLAST 从 GenBank 数据库找
到相近序列,用 MEGA4. 0 软件建立系统发育树。
2　 结果与分析
2. 1　 症状特征
田间辣椒果实未成熟时,只发现由该病菌引起
的辣椒果实上的炭疽病,发病初期,病斑呈水浸状,
后期病斑凹陷,长椭圆状或不规则形,中央呈成片
黄褐色粉末,外围为粉红色轮状排列小点,边缘水
渍状,个别病斑有开裂现象 (图 1)。 茎叶未被
侵染。
Fig. 1　 Symptoms of anthracnose disease on chili pepper fruits under natural condition
121
　
植物病理学报 42 卷
Fig. 2　 Morphology of the pathogen causing the anthracnose
on Cayenne pepper cv. Hongxiu 2003
A: Colony on PDA; B: Reverse colony on PDA; C: Acervulus; D: Conidia.
2. 2　 分离菌株的菌落及形态特征
8 个分离菌株(编号为 HNZJ001 ~ HNZJ008)
的菌落特征无明显差异。 菌株 HNZJ001 在 PDA
培养基上 28℃培养 7 d 后菌落直径达 63. 2 mm ~
67. 4 mm,边缘较平滑,基内菌丝和气生菌丝都很
发达,气生菌丝初期为白色,渐变为浅红色粉状菌
丝,后期颜色加深,具明显灰黑色的同心轮纹(图
2),显微镜下可见菌丝为有隔菌丝,具分枝;分生
孢子梗单生,褐色;分生孢子单生,无色,长椭圆形,
一端尖(图 2),每个分生孢子含几个油球,分生孢
子大小为 15. 8 μm × 4. 1 μm,分生孢子盘无刚毛
(图 2)。
2. 3　 致病性测定
自然条件下发病的辣椒果实病斑直径为 17
mm ~21 mm,室内接种的辣椒初期产生水渍状,慢
慢扩展为圆形或椭圆形,直径 19 mm ~ 23 mm,产
生橙黄色粘液状孢子团(图 3),孢子团干后变黄褐
色粉末,并可见黑色分生孢子盘排列呈环状。 6 d
后接种果实发病率达到 100% ,其发病症状与自然
情况下的基本一致,对照均不发病。 对接种后的病
斑再次进行病菌分离,得到与原分离菌株一致的病
原菌。 根据柯赫氏法则,证明 HNZJ001 为辣椒青
果炭疽病的病原菌。
Fig. 3 　 Symptoms of chili fruit anthracnose
in vitro inoculation(28℃,8 days)
221
　
　 2 期 　 　 夏 花,等:湖南芷江辣椒上一种新炭疽病的病原鉴定
Fig. 4　 Determination of the pathogenicity of different pepper
A: Claw law; B: Tufted pepper; C,D: Pimiento; E,F,G: Cayenne.
　 　 在 HNZJ001 与胶孢炭疽菌 LSQ1 的致病性对
比试验中,LSQ1 接种的未成熟果无明显症状,而
HNZJ001 无论接种未成熟果还是成熟果都表现出
更强的致病力。 另外,LSQ1 不能使成熟柿椒发
病,虽能使成熟海椒发病,但是症状较轻(图 4)。
2. 4　 多菌灵敏感性测定
用 1 mg / mL 多菌灵和清水分别浸泡辣椒 5
min,接种 HNZJ001 菌株后,用多菌灵处理和清水
处理的辣椒都产生如图 3 所示的病斑,没有明显的
差异。 但 LSQ1 对多菌灵较敏感,1 mg / mL处理的
辣椒不发病(图 5)。
2. 5　 rDNA ITS序列分析
经 rDNA ITS4 和 ITS5 引物对 HNZJ001 菌株
进行 PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测,获得了 1
条 600 bp左右的清晰条带(图 6-A),经测序后得
到的 rDNA ITS 序列 (GU059863 ) 提交至 Gen-
Bank,BLAST结果表明与几种尖孢炭疽菌的 ITS
序列 100%相同。 利用MEGA4. 0 软件构建系统发
育树(图 6-B)。 树图显示,HNZJ001 的 ITS 序列
与尖孢炭疽菌(C. acutatum) ITS 序列相同的置信
度为 100% 。
Fig. 5 　 Determination of carbendazim sensi-
tivity
Left: Treated with 1 mg / mL carbendazol; Right: Treated
with water.
321
　
植物病理学报 42 卷
Fig. 6　 PCR amplification pattern (A) and phylogenetic tree (B) of HNZJ001
3　 结论与讨论
本研究于 2009 年 8 月从怀化线椒发病青果上
分离到 8 个菌落形态特征一致的菌株(HNZJ001 ~
HNZJ008),将分离菌株进行室内离体接种均可使
辣椒发病,回接病果进行再分离,仍得到原分离菌,
经柯赫氏法则验证分离菌即为该病害的致病菌。
通过病菌镜检和培养形态观察、rDNA ITS 序列分
析,将辣椒炭疽病的致病菌确定为尖孢炭疽菌 C.
acutatum(有性阶段为尖孢小丛壳 G. acutata)。
据报道能引起辣椒炭疽病的炭疽菌属真菌有
5 种,除 C. acutatum 和 C. gloeosporioides 外,还有
黑色炭疽菌(C. coccodes = C. nigrum)、黑点炭疽
菌(C. capsici)和黑线炭疽菌(C. dematium) [1 ~ 3]。
C. acutatum在 EPPO 地区、亚洲、非洲、北美洲、南
美洲和大洋洲的多个国家都有分布[4]。 我国此前
只报道 3 种,即 G. cingulata、C. coccodes 和 C.
capsici,加上本文报告的 C. acutatum,辣椒上的炭
疽菌共有 4 种。
就目前所知,有性阶段在 C. acutatum 的生活
史中只起到很小的作用[4]。 2004 年 8 月,挪威在
高灌蓝莓果实上同时发现了子囊壳和子囊孢子,首
次发现自然感病寄主上尖孢炭疽菌的有性阶
段[5]。 但本研究尚未发现其有性阶段,有待进一
步观察。
尖孢炭疽菌在侵染寄主时有高度组织特异
性[6]。 C. acutatum在热带地区能引起果实和叶的
严重病害[3]。 美国俄亥俄州报道该菌在柿椒未成
熟果实上引起炭疽病[2]。 本研究中,怀化芷江辣
椒尖孢炭疽病可发生在未成熟果实而不发生在茎
叶上,室内接种既感染未成熟辣椒果实也感染成熟
辣椒果实,但 C. gloeosporioides 不感染未成熟辣
椒果实,可感染成熟辣椒果实和叶片,显示两者致
病性差异。
炭疽菌属的不同种对药物具有不同的敏感性,
已报告尖孢炭疽菌对苯并咪唑类杀菌剂具有抗性
而胶孢炭疽菌对其敏感 [7,8]。 本试验中尖孢炭疽
菌 HNZJ001 对多菌灵的耐受力比胶孢炭疽菌更
强,与已有报道一致。
C. acutatum的寄主范围广,已知此菌能侵染
草莓、冠状银莲花、苹果、茄子、鳄梨、山茶属、蚕豆
属和白酒草属植物[4]。 近年来又有新的报道[9]。
国内相继报道自草莓[10]、苹果[11]、枇杷[12]、橡
胶[13]、芒果[14]和银杏[15]上分离到尖孢炭疽菌。 本
文是国内首次报道辣椒上的 C. acutatum。
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责任编辑:于金枝
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