全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA 42(2): 164-168(2012)
收稿日期: 2011-04-13; 修回日期: 2011-09-01
基金项目: 马铃薯产业技术体系(GWZJ-2)
通讯作者: 王 舰,研究员,主要从事马铃薯遗传育种研究; E-mail: wangjian2197@sohu. com
第一作者: 连延浩(1988 - ),男,汉族,在读研究生,研究方向为马铃薯抗逆育种, E-mail: lianyanhao0123@163. com。
青海马铃薯晚疫病菌线粒体 DNA单倍型鉴定及分析
连延浩1, 叶广继1, 2, 王 舰1, 2*
( 1青海大学教育部青藏高原生物技术重点实验室, 西宁 810016; 2青海省农林科学院生物技术研究所, 西宁 810016)
摘要:为查明青海地区晚疫病菌单倍型分布情况,本研究对青海不同地区采自 2006 ~ 2007 年的 70 个晚疫病菌材料的线粒
体单倍型进行了分析,结果表明:94. 3%的菌株为Ⅱa型,5. 7%的菌株为Ⅱb型,其中Ⅱb 型均分离自番茄。 这说明青海地
区马铃薯晚疫病菌群体类型比较单一,主要为Ⅱa型,线粒体单倍型不存在多态性。
关键词:马铃薯;晚疫病菌;单倍型;线粒体 DNA
Identification and analysis of mitochondrial haplotypes on potato Phytophthora in-
festans in Qinghai area LIAN Yan-hao1, YE Guang-ji1,2, WANG Jian1,2 ( 1The Tibet Plateau Biotech-
nology Key Lab of Ministry of Education, Qinghai University, Xining 810016, China; 2 Institute of Biotechnology of Qinghai
Academy of Agriculture and forestry, Xining 810016, China)
Abstract: To detect the distribution of mitochondrial haplotypes of Phytophthora infestans in Qinghai Pro-
vince, 70 isolates of Phytophthora infestans collected from different areas in 2006 - 2007 were identified and
analyzed. The results showed that the typeⅡa was the most important, accounting for 94. 3% , and the rest
5． 7% belong to the typeⅡb. The typeⅡb strains were all isolated from tomato plants. The results showed that
the typeⅡa was the major potato Phytophthora infestans strain in Qinghai, and its mitochondrial haplotype was
simplistic.
Key words: potato; Phytophthora infestans ; haplotype; mtDNA
中图分类号: S436. 32 文献标识码: A 文章编号: 0412-0914(2012)02-0164-05
马铃薯晚疫病是由致病疫霉引起的一种常见
的卵菌病害,自 1845 年首次在爱尔兰大流行[1]以
后,在世界各马铃薯主产区均有发生和流行,严重
威胁着马铃薯的生产。 进入 20 世纪 80 年代以来,
晚疫病在世界各马铃薯主产区的频频发生及其所
造成危害的严重程度已引起了国际社会的极大关
注。 青海作为中国马铃薯的一大主产区,开展晚疫
病群体研究工作尤为重要。
马铃薯病菌群体结构的组成与变化直接影响
着病害的发生与流行[2]。 线粒体 DNA(mtDNA)
单倍型是指根据线粒体染色体组上 DNA 序列的
差异而定义出来的单倍群。 与核 DNA 相比,它具
有分子小、结构简单、无组织特异性等特点,多为单
亲遗传,序列相对保守,是一个相对独立的复制单
位[3]。 国外对晚疫病菌群体 mtDNA 单倍型多态
性的研究表明:晚疫病菌群体的 mtDNA 单倍型划
分为Ⅰa、Ⅰb、Ⅱa、Ⅱb 共 4 种类型[4]。 国内部分地
区的学者已经开展了对晚疫病菌单倍型的鉴定,均
取得了一定的结果。 分析晚疫病菌株的 mtDNA
单倍型,可以用于检测晚疫病菌群体的遗传结构的
演变,监控晚疫病菌群体的变异情况。
本研究通过对青海地区晚疫病菌 mtDNA 单
2 期 连延浩,等:青海马铃薯晚疫病菌线粒体 DNA单倍型鉴定及分析
倍型的鉴定,了解其遗传演化情况,为青海地区晚
疫病群体结构研究工作奠定了基础。
1 材料与方法
1. 1 供试菌株及培养基
供试菌株为 2006 ~ 2007 年间采集的菌株,共
70 个。 其中湟中县 2 个,湟源县 16 个,平安县 2
个,互助县 15 个,乐都县 12 个,大通县 6 个,化隆
县 2 个,循化县 4 个和西宁城北区 11 个,具体见表
1。 菌株编号中前两个字母后的两位数表示采集年
份。 采集地主要分布于青海马铃薯主产区海东地
区。 菌株均由青海大学教育部青藏高原生物技术
重点实验室收集保存。
黑麦液体培养基:黑麦种子 60 g在 800 mL去
离子水中浸泡 24 ~ 36 h,在 121℃高压蒸汽灭菌,
经四层纱布过滤去渣。 上清液补足水 1 000 mL,
分装,灭菌[5]。
Table 1 Collection location and host of Phytophthora infestans strains
Code of strain Location Host Code of strain Location Host
HY06-01 Huang Yuan Potato HY07-02 Huang Yuan Potato
HY06-02 Huang Yuan Potato HY07-03 Huang Yuan Potato
HY06-03 Huang Yuan Potato HY07-05 Huang Yuan Potato
HY06-04 Huang Yuan Potato XH07-01 Xun Hua Potato
HY06-06 Huang Yuan Potato XH07-02 Xun Hua Tomato
DH06-01 Huang Yuan Potato XH07-03 Xun Hua Tomato
DH06-02 Huang Yuan Potato XH07-04 Xun Hua Potato
DH06-04 Huang Yuan Potato DT07-01 Da Tong Potato
DH06-05 Huang Yuan Potato DT07-02 Da Tong Potato
DH06-06 Huang Yuan Potato DT07-03 Da Tong Potato
DH06-07 Huang Yuan Potato DT07-04 Da Tong Potato
DH06-08 Huang Yuan Potato DT07-05 Da Tong Potato
HZ06-01 Hu Zhu Potato DT07-07 Da Tong Potato
HZ06-03 Hu Zhu Potato LD07-01 Le Du Potato
HZ06-04 Hu Zhu Potato LD07-02 Le Du Potato
HZ06-05 Hu Zhu Potato LD07-03 Le Du Potato
HZ06-06 Hu Zhu Potato LD07-04 Le Du Potato
HZ06-07 Hu Zhu Potato LD07-05 Le Du Potato
HZ06-08 Hu Zhu Potato LD07-06 Le Du Potato
XN06-01 Xi Ning Potato LD07-07 Le Du Potato
XN06-02 Xi Ning Potato LD07-08 Le Du Potato
XN06-03 Xi Ning Potato LD07-09 Le Du Potato
XN06-04 Xi Ning Potato LD07-11 Le Du Potato
XN06-07 Xi Ning Potato LD07-12 Le Du Potato
XN06-08 Xi Ning Potato LD07-14 Le Du Potato
PA07-01 Ping An Potato HH07-01 Huang Zhong Potato
PA07-02 Ping An Potato HH07-02 Huang Zhong Potato
HL07-01 Hua Long Potato HZ07-03 Hu Zhu Potato
HL07-02 Hua Long Potato HZ07-04 Hu Zhu Potato
XN07-01 Xi Ning Potato HZ07-09 Hu Zhu Potato
XN07-02 Xi Ning Potato HZ07-10 Hu Zhu Potato
XN07-03 Xi Ning Tomato HZ07-13 Hu Zhu Potato
XN07-04 Xi Ning Tomato HZ07-14 Hu Zhu Potato
XN07-05 Xi Ning Potato HZ07-16 Hu Zhu Potato
HY07-01 Huang Yuan Potato HZ07-20 Hu Zhu Potato
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植物病理学报 42 卷
1. 2 DNA提取
挑取供试菌株于黑麦液体培养基中培养 3 周
左右后,收集菌丝体,抽干菌丝体上的液体,装入
2. 0 mL 管中,用磨砂的玻璃棒捣碎菌丝体,采用
CTAB法提取菌丝 DNA。 所得 DNA经 1%的琼脂
糖凝胶电泳检测和蛋白核酸测定仪检测纯度与浓
度后,用 TE 缓冲液稀释成 100 ng·μL -1,于
-20℃保存。
1. 3 PCR扩增
以所提取的晚疫病菌 DNA 为模板,引物参照
Gareth等[6]的实验,由上海生工合成 F1 / R1 和 F2 /
R2 两对引物,其对应 PCR 扩增产物为 P1、P2。 引
物序列 F1: 5′-GCAATGGGTAAATCGGCTCAA-
3′;R1: 5′-AAACCATAAGGACCACACAT-3′; F2:
5′-TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT-3′; R2: 5′-
TTACGGCGGTTTAGCACATACA-3′ 。 用 ddH2O
将合成好的引物配制成浓度为 7. 0 μM 的溶液,于
-20℃保存备用。
PCR 反应体系 ( 25 μL ): 10 × PCR buffer
2. 5 μL,2. 5 μM 的 dNTP 溶液 2. 0 μL,2. 5 U 的
Taq 酶 0. 5 μL,7. 0 μM 的两对引物分别加入
1. 2 μL(引物终浓度为 0. 336 μM),DNA 模板
5 μL,加 ddH2O补足 25 μL。
PCR 扩增程序:94℃预变性 90 s;94℃变性
40 s,55℃退火 60 s,72℃延伸 90 s,36 个循环。
PCR产物于 1. 2%的琼脂糖凝胶中电泳检测,于凝
胶成像仪中拍照。
1. 4 酶切分析
以 PCR产物为模板进行酶切,分别用 CfoⅠ酶
切 P1 产物,MspⅠ酶切 P2 产物。 酶切试剂盒购自
Promega公司。
酶切体系:总体系为 20 μL。 其中 MUL-
TICORE 10 × buffer 溶液 2. 0 μL、 BSA 溶液
0. 2 μL、酶 0. 5 μL、PCR产物 8 μL,补足 ddH2O至
20 μL。 酶切产物于 2%的琼脂糖凝胶电泳中检
测,于凝胶成像仪中拍照。
2 结果与分析
2. 1 晚疫病菌 DNA提取
晚疫病菌 DNA的提取采用 CTAB 法,本实验
成功提取了 70 个菌株的 DNA,图 1 是部分菌株的
DNA电泳图,测定其 OD值均在 1. 8 ~ 2. 0。
2. 2 晚疫病菌 mtDNA的 PCR扩增
用 F1 / R1,F2 / R2 两对引物对晚疫病菌 DNA
进行 PCR 扩增,扩增出 P1 产物(1 118 bp)和 P2
产物(1 070 bp)(图 2)。
2. 3 酶切分析
分别用 CfoⅠ、MspⅠ酶切 P1 和 P2。 根据酶
切结果条带的大小对晚疫病菌的 mtDNA 单倍型
进行分析。 P1 经 CfoⅠ酶切后产生 907 bp 和
211 bp大小片段的为Ⅰa 或Ⅰb 型,产物仅为
1 118 bp的为Ⅱa 或Ⅱb 型。 对 70 个菌种材料 P1
产物进行酶切,发现结果均为 1 118 bp 的条带,确
定其为Ⅱa 或Ⅱb 型。 P2 经 MspⅠ酶切后产生
720 bp和 350 bp片段的为Ⅱb 型,产生 720 bp、
147 bp和 203 bp片段的为Ⅱa型[6](图 3)。
Fig. 1 DNA gel electrophoresis of Phytophthora infestans
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2 期 连延浩,等:青海马铃薯晚疫病菌线粒体 DNA单倍型鉴定及分析
Fig. 2 PCR products P1 and P2 with specific primers F1 / R1 and F2 / R2
Fig. 3 Restriction digestion analysis of P1 and P2 using CofⅠand MspⅠ
在 70 个菌株中,有 66 个菌株 mtDNA 单倍型
为Ⅱa 型,占试验菌株的 94. 3% ,其余的 4 个菌株
mtDNA单倍型为Ⅱb型,且Ⅱb 型菌株分布在循化
县和西宁城北,菌株均分离自番茄,循化县的菌株
采自生产田,西宁城北的菌株采自农户的蔬菜大
棚。
分析结果表明青海地区的马铃薯 mtDNA 单
倍型主要为Ⅱa型,这与 Guo等[7]报道的内蒙古晚
疫病菌 mtDNA单倍型为Ⅱa 型相符,为较年轻的
菌系。
3 讨论
本研究对青海地区的晚疫病菌线粒体单倍型
进行了分析,发现该地区马铃薯晚疫病菌群体单倍
型类型单一,主要为Ⅱa 型,不具有多态性。 该结
果可以为该地区晚疫病菌的演化提供依据。
另外,Ⅰb型为古老的菌系,Ⅰa、Ⅱa、Ⅱb 为近
年来的演化菌系,青海地区病菌为Ⅱa 型,属演化
菌系,其产生原因有待研究。 青海地区晚疫病菌类
型单一,一方面可能和该地区在进行引种试验过程
中未引入外源病菌有关。 另一方面,由于青海是典
型的高原大陆气候,海拔高,日照长,降雨少,湿度
小,不利于晚疫病菌的生长[8],使得该地区的菌落
保持着Ⅱa 型这种适合本地区生长的菌落群体。
Lionel等 [9]利用 RG57 探针和同工酶基因型研究
发现采自番茄和马铃薯上的晚疫病病原菌基因型
明显不同,说明晚疫病病原菌有寄主专化作用。 因
此,对于Ⅱb 型的出现,由于其采自番茄植株,笔者
认为可能是寄主专化作用的结果,详细原因正在研
究中。
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责任编辑:
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李晖
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