全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４４(２): ２２１￣２２４(２０１４)
收稿日期: ２０１３￣０７￣０３ꎻ 修回日期: ２０１３￣１０￣０９
基金项目: 公益性行业(质检)科研专项(２０１１１００３５)
通讯作者: 邓丛良ꎬ高级农艺师ꎬ主要从事植物病毒检测技术研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ: ｄｅｎｇｃｌ＠ｂｊｃｉｑ ｇｏｖ ｃｎꎮ
研究简报
应用纳米磁珠实时荧光定量 ＰＣＲ方法检测
番茄黄化曲叶病毒
赵晓丽１ꎬ 周 琦１ꎬ 孙 宁２ꎬ 邓丛良１∗
( １北京出入境检验检疫局植物实验室ꎬ北京 １０００２６ꎻ２东南大学ꎬ南京 ２１００９６)
Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｍａｔｏ ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｖｉｒｕｓ ｂｙ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ
ｗｉｔｈ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ＺＨＡＯ Ｘｉａｏ￣ｌｉ１ꎬ ＺＨＯＵ Ｑｉ１ꎬ ＳＵＮ Ｎｉｎｇ２ꎬ ＤＥＮＧ Ｃｏｎｇ￣ｌｉａｎｇ１ (１Ｐｌａｎｔ Ｌａｂｏ￣
ｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｅｉｊｉｎｇ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００２６ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２Ｓｏｕｔｈｅａｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００９６ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ａ ｒａｐｉｄꎬ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｑＰＣＲ ａｓｓａｙ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｔｏｍａｔｏ ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｖｉｒｕｓ (ＴＹＬＣＶ)ꎬ ａ ｐａｉｒ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ
ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｋｎｏｗｎ ＴＹＬＣＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ Ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｗｉｔｈ ＭＮＰ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅꎬ ａ ｎｏｖｅｌ ＭＮＰ－ｑＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ａｎｄ ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙꎬ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｓ Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａ￣
ｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ Ｃｔ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｐｌｏｔｔｅｄ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｓｈｏｗｅｄ ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ(Ｒ２ ＝０ ９９９４)ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｌｏｇ ｏｆ ｃｏｐｙ
ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｈｉｇｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｆｏｒ ＴＹＬＣＶ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃｒｏｓｓｉｎｇ
ｒｅａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｔｏｍａｔｏ ｓｅｖｅｒｅ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ Ｔｏｍａｔｏ ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ Ｓａｄｉｎｉａ ｖｉｒｕｓꎬ ａｎｄ ｗａｓ １０－ｆｏｌｄ ｍｏｒｅ
ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｈａｎ ｒｏｕｔｉｎｅ ＰＣＲ Ｂｏｔｈ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ ｏｆ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ２％ꎬ ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ａ ｇｏｏｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ
Ｗｅ ｈａｖｅ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＴＹＬＣＶ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｓａｍｐｌｅｓ ｒａｐｉｄｌｙ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙ
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｔｏｍａｔｏ ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｖｉｒｕｓꎻ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎꎻ ＭＮＰꎻ ｑＰＣＲ
文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０２￣０２２１￣０４
番茄黄化曲叶病毒(Ｔｏｍａｔｏ ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｖｉ￣
ｒｕｓꎬ ＴＹＬＣＶ)为双生病毒科(Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ)菜豆金
色花叶病毒属(Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ)成员ꎬ于 １９６４ 年在以
色列首次发现[１]ꎬ目前我国已有 １５个省(自治区、直
辖市)发现该病毒[ ２ ]ꎬＴＹＬＣＶ 主要通过烟粉虱传
播ꎮ
随着分子生物学技术的不断发展ꎬ许多快速高
效的检测 ＴＹＬＣＶ 的方法被建立并应用于实际检
测ꎬ其中以 ＰＣＲ 技术最具实用性ꎮ 研究表明 ＰＣＲ
技术是 ＴＹＬＣＶ 检测的有效手段之一[３]ꎬ而实时荧
光定量 ＰＣＲ( ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲꎬ ｑＰＣＲ)不
仅比普通 ＰＣＲ 更加快速、灵敏[４]ꎬ而且能够对模板
进行准确定量ꎮ 核酸提取是现代分子生物学操作最
基本、最关键的步骤ꎬ它是下游核酸检测的基础ꎮ 近
年来出现的通过纳米磁珠(ｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓꎬ
ＭＮＰ)法提取植物核酸ꎬ避免了植物寄主中多糖及
一些酚类物质对 ＰＣＲ反应的影响ꎬ有效克服了传统
核酸提取方法步骤繁琐、耗时长、收率低、接触有毒
试剂、难以实现自动化等缺陷ꎬ该方法已应用于部分
植物病毒的检测[５]ꎮ 本研究通过纳米磁珠提取样品
中核酸ꎬ与实时荧光定量 ＰＣＲ 技术结合ꎬ建立了
ＴＹＬＣＶ的ＭＮＰ－ｑＰＣＲ检测方法ꎮ
１ 材料与方法
１ １ 材料
ＴＹＬＣＶ阳性材料采自北京田间番茄样品ꎮ 番
植物病理学报 ４４卷
茄重型曲叶病毒 ( Ｔｏｍａｔｏ ｓｅｖｅｒｅ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｖｉｒｕｓꎬ
ＴｏＳＬＣＶ)和撒丁岛番茄黄化曲叶病毒 (Ｔｏｍａｔｏ
ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ Ｓａｄｉｎｉａ ｖｉｒｕｓꎬ ＴＹＬＣＳＶ)购自美国菌
种保藏中心 (Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎꎬ
ＡＴＣＣ)ꎮ Ｆｅ３Ｏ４ / ＳｉＯ２核壳结构纳米磁珠由本实验
室制备ꎮ
１ ２ 引物及探针的设计与合成
根据ＮＣＢＩ核酸序列数据库中 ＴＹＬＣＶ不同分离
物保守序列ꎬ设计 １对引物和 １条 ＴａｑＭａｎ探针ꎮ 引
物和探针由大连宝生物技术公司合成ꎬ其序列如下:
上游引物 ＴＹＬＣＶ－ＦＰ: ５′ ＧＴＣＣＴＧＧＡＴＴＧＣＡＧＡＧ￣
ＧＡＡＧＡＴ ３′(１７０３ －１７２４)ꎻ下游引物 ＴＹＬＣＶ－ＲＰ:
５′ ＧＣＧＴＧＧＴＡＣＡＡＣＧＴＣＡＴＴＧＡＴＧ ３′(１８５９－１８３８)ꎻ
ＴａｑＭａｎ探针 ＴＹＬＣＶ－Ｐｒｏｂｅ: ５′ ＦＡＭ－ＣＧＴＡＣＴＴＴ￣
ＧＴＧＴＴＧＣＴＴＴＧＣＣＡＧＴＣＣＣＴ－ＴＡＭＲＡ ３′(１ ７６０ ~
１ ７８７)(引物与探针位点参照ＴＹＬＣＶ基因ꎬＧｅｎｅＢａｎｋ
登录号:ＧＵ９８３８５９)ꎮ
１ ３ ＭＮＰ法提取 ＤＮＡ
称取 １００ ｍｇ 发病番茄叶片ꎬ加入 １ ｍＬ 的研
磨液 ( ５ Ｍ 异硫氰酸胍、 ０ １％ ＴｒｉｔｏｎＸ￣１００、 ２％
ＰＶＰ)进行充分研磨ꎬ５ ０００ ｒｐｍ离心 ５ ｍｉｎꎮ 取 １００
μＬ上清液于 １ ５ ｍＬ 离心管中ꎬ加入 １ ｍｇ ＭＮＰ
和 １倍体积的无水乙醇ꎬ上下颠倒混匀ꎬ室温放置
５ ｍｉｎꎮ 磁分离后弃上清液ꎬ用 ２００ μＬ ７０％乙醇清
洗 ３次ꎮ 加入 ５０ μＬ ｄｄＨ２Ｏꎬ室温放置 ５ ｍｉｎ 后ꎬ
磁分离ꎬ小心吸取上清液至新的离心管中备用ꎮ
１ ４ ＭＮＰ￣ｑＰＣＲ标准曲线的建立
应用引物 ＴＹＬＣＶ￣ＦＰ与 ＴＹＬＣＶ￣ＲＰ进行 ＰＣＲ
扩增ꎬＴＡ克隆制备重组质粒 ＤＮＡꎮ 经测序鉴定序
列的正确性ꎬ提取质粒ꎬ经紫外分光光度计测定其
浓度ꎮ 将阳性质粒标准品浓度换算成 ｃｏｐｉｅｓ
μＬ－１后ꎬ１０倍梯度稀释成 １ ０×１０７ ~１ ０×１０１ ｃｏｐｉｅｓ
μＬ－１ꎬ共稀释 ７个梯度ꎬ进行 ｑＰＣＲ扩增ꎬ绘制标
准曲线ꎮ
１ ５ ＭＮＰ￣ｑＰＣＲ反应体系的方法学检测
１ ５ １ 特异性试验 以 ＴＹＬＣＶ、 ＴｏＳＬＣＶ 和
ＴＹＬＣＳＶ 阳性材料的 ＤＮＡ 为模板ꎬ进行 ＭＮＰ－
ｑＰＣＲ的特异性试验ꎮ
１ ５ ２ 灵敏性试验 称取 ＴＹＬＣＶ 阳性材料 １００
ｍｇꎬ加入 １ ｍＬ研磨液研磨ꎬ离心后进行 １０倍梯度
稀释(稀释倍数为 １０１ ~ １０７)ꎬＭＮＰ 法提取稀释样
品中的 ＤＮＡꎬ进行 ｑＰＣＲ和普通 ＰＣＲ扩增ꎮ ｑＰＣＲ
反应体系为 ２５ μＬ:２×Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ １２ ５ μＬꎬ
ＲＯＸ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｙｅ １ μＬꎬ１０ μｍｏｌＬ－１ ＴＹＬＣＶ－
ＦＰ 与 １０ μｍｏｌＬ－１ ＴＹＬＣＶ －ＲＰ 各 ０ ５ μＬꎬ１０
μｍｏｌＬ－１ ＴＹＬＣＶ －Ｐｒｏｂｅ １ μＬꎬＤＮＡ １ μＬꎬ加
ｄｄＨ２ Ｏ 至终体积 ２５ μＬꎮ 反应程序为: ９５℃
１ ｍｉｎꎻ９５℃ ５ ｓꎬ６０℃ ３０ ｓꎬ４０ 个循环ꎮ 普通 ＰＣＲ
反应体系:１０×ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ２ ５ μＬꎬ１０ ｍｍｏｌＬ－１
ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ (各 ２ ５ ｍｍｏｌＬ－１) １ μＬꎬ１０ μｍｏｌ
Ｌ－１ ＴＹＬＣＶ－ＦＰ与 １０ μｍｏｌＬ－１ ＴＹＬＣＶ－ＲＰ各
０ ５ μＬꎬ２５０ ＵμＬ－１ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶 ０ ２ μＬꎬ
ＤＮＡ １ μＬꎬ加 ｄｄＨ２Ｏ 至终体积 ２５ μＬꎮ ＰＣＲ 程
序:９４℃ ５ ｍｉｎꎻ９４℃ ３０ ｓꎬ５６℃ ４０ ｓꎬ７２℃ ３０ ｓꎬ３０
个循环ꎻ７２℃延伸 １０ ｍｉｎꎮ 扩增产物经 ２ ％的琼脂
糖凝胶电泳ꎬ凝胶成像仪观察结果ꎮ
１ ５ ３ 重复性试验 为考察试验组间差异性ꎬ将
上述不同梯度稀释样品连续 ３天进行 ３次试验ꎬ根
据获得的 Ｃｔ值计算平均 Ｃｔ 值、标准差(ＳＤ)和变
异系数(ＣＶ)ꎮ
１ ６ 田间样品的检测
用所建立的 ＭＮＰ－ｑＰＣＲ 方法对从北京顺义、
大兴、通州等 １０ 个区县的大棚中采集表现典型植
株矮缩、顶部叶片黄化上卷症状的 １０ 份番茄叶片
样品进行 ＴＹＬＣＶ定量检测ꎮ
２ 结果与分析
２ １ 标准曲线的建立
重组质粒测序结果表明ꎬ扩增的 ＰＣＲ 产物序
列与 ＴＹＬＣＶ北京分离物序列(ＧＵ９８３８５９)完全一
致ꎮ 以 Ｃｔ 值为 ｙ 轴ꎬ阳性质粒拷贝数的对数值
( ｌｏｇ ｃｏｐｉｅｓ)为 ｘ 轴绘制标准曲线 (图 １): ｙ ＝
－３ ４７０ ６ｘ＋４２ ６６３ꎬＲ２ ＝０ ９９９ ４ꎮ
２ ２ ＭＮＰ￣ｑＰＣＲ反应体系的方法学检测
２ ２ １ 特异性试验 特异性试验结果表明ꎬＴＹＬ￣
ＣＶ 的模板能够扩增到典型曲线ꎬ其 Ｃｔ 值为
２４ ６３ꎬ而未能从 ＴｏＳＬＣＶ和 ＴＹＬＣＳＶ和阴性材料
的模板中得到典型扩增曲线ꎬ结果与预期相符ꎬ表
明该方法具有良好的特异性ꎮ
２２２
２期 赵晓丽ꎬ等:应用纳米磁珠实时荧光定量 ＰＣＲ方法检测番茄黄化曲叶病毒
Ｆｉｇ. １ Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｑＲＣＲ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｏｆ ＴＹＬＣＶ
２ ２ ２ 灵敏性试验 灵敏性试验结果表明ꎬ使用
ｑＰＣＲ方法时ꎬ当 ＤＮＡ稀释 １０７倍时已没有扩增曲
线ꎬ稀释 １０６ 倍时ꎬ仍有扩增曲线ꎬ且 Ｃｔ 值为
３５ ７０ꎬ根据标准曲线可得病毒含量为 １ ０ × １０２
ｃｏｐｉｅｓμＬ－１(图 ２)ꎮ 而普通 ＰＣＲ产物经 ２％琼脂
糖凝胶电泳显示ꎬ当 ＤＮＡ 稀释 １０５倍时ꎬ还可观察
到扩增条带ꎬ但当 ＤＮＡ稀释 １０６倍时ꎬ则观察不到
扩增条带(图 ３)ꎬ这表明 ｑＰＣＲ检测灵敏度比普通
ＰＣＲ检测灵敏度高 １０倍ꎮ
Ｆｉｇ. ２ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＭＮＰ－ｑＰＣＲ ｆｏｒ ＴＹＬＣＶ
１－７: Ｔｈｅ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ＴＹＬＣＶ ＤＮＡ ｗｅｒｅ １０１ꎬ １０２ꎬ
１０３ꎬ １０４ꎬ １０５ꎬ １０６ꎬ １０７ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎻ ８: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ
Ｆｉｇ. ３ Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｏｕｔｉｎｅ ＰＣＲ ｆｏｒ ＴＹＬＣＶ
Ｍ: ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００ꎻ １－７: Ｔｈｅ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｔｉｍｅｓ ｏｆ ＴＹＬＣＶ ＤＮＡ ｗｅｒｅ １０１ꎬ １０２ꎬ １０３ꎬ １０４ꎬ １０５ꎬ １０６ꎬ １０７ꎬ
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎻ ８: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ
Ｔａｂｌｅ １ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ ｏｆ ＭＮＰ￣ｑＰＣＲ
Ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｔｉｍｅ
Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ ｏｆ ｉｎｔｒａ－ａｓｓａｙ Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ ｏｆ ｅｘｔｒａ－ａｓｓａｙ
Ｍｅａｎ Ｃｔ ｖａｌｕｅ±ＳＤ ＣＶ / ％ Ｍｅａｎ Ｃｔ ｖａｌｕｅ±ＳＤ ＣＶ / ％
１０１ １８ ３０±０ ２０ １ ０９ １８ ４４±０ ２０ １ ０７
１０２ ２１ ７３±０ ０７ ０ ３０ ２１ ６９±０ ３７ １ ６９
１０３ ２５ ６０±０ １６ ０ ６３ ２５ ２７±０ ３６ １ ４０
１０４ ２８ ６９±０ １７ ０ ６０ ２８ ６５±０ １６ ０ ５７
１０５ ３２ ３４±０ ３９ １ ２１ ３２ ４０±０ ３２ ０ ９９
１０６ ３５ ６１±０ ０４ ０ １２ ３５ ７２±０ １２ ０ ３５
３２２
植物病理学报 ４４卷
Ｔａｂｌｅ ２ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＹＬＣＶ ｉｎ ｓａｍｐｌｅｓ ｂｙ ＭＮＰ－ｑＰＣＲ
Ｓａｍｐｌｅ ｎｕｍｂｅｒ Ｃｔ ｖａｌｕｅ
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＹＬＣＶ
/ ｃｏｐｉｅｓμＬ－１
Ｓａｍｐｌｅ ｎｕｍｂｅｒ Ｃｔ ｖａｌｕｅ
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＴＹＬＣＶ
/ ｃｏｐｉｅｓμＬ－１
１ １７ ２８ ２ １×１０７ ６ １９ ８９ ３ ６×１０６
２ ３１ ６１ １ ５×１０３ ７ ２２ ９５ ４ ８×１０５
３ １９ ２３ ５ ６×１０６ ８ ２６ ７０ ４ ０×１０４
４ ２３ ２９ ３ ８×１０５ ９ ２１ ９０ ９ ６×１０５
５ ２９ ２９ ７ １×１０３ １０ ３０ ５５ ３ １×１０３
２ ２ ３ 重复性试验 重复性试验结果表明ꎬ同一
试验内的最大标准偏差为 ０ ３９ꎬ最大变异系数为
１ ２１％ꎻ不同试验间的最大标准偏差为 ０ ３７ꎬ最大变异
系数为 １ ６９％(表 １)ꎮ 可见ꎬ此 ｑＰＣＲ检测方法重复
性好ꎬ可对 ＴＹＬＣＶ进行稳定、可靠的检测ꎮ
２ ３ 田间样品中 ＴＹＬＣＶ的定量检测
用所建立的 ＭＮＰ－ｑＰＣＲ 方法对从北京 １０ 个
区县采集来的 １０份样品进行 ＴＹＬＣＶ 检测ꎮ 根据
获得的 Ｃｔ值结合标准曲线得到样品中 ＴＹＬＣＶ 的
浓度(表 ２)ꎮ 由结果可见ꎬＴＹＬＣＶ 已经在北京番
茄主产区普遍发生ꎬ必须引起高度重视ꎮ
３ 讨论
本研究采用课题组自行研制的 Ｆｅ３Ｏ４ / ＳｉＯ２核
壳结构纳米磁珠提取核酸ꎬ同时结合 ｑＰＣＲ 技术ꎬ
建立了快速定量检测 ＴＹＬＣＶ 的 ＭＮＰ－ｑＰＣＲ 方
法ꎬ并应用于田间样品的检测中ꎮ ＭＮＰ 法提取核
酸省去了传统 ＤＮＡ 提取过程抽提、离心等繁琐步
骤进而缩短了检测时间ꎻｑＰＣＲ 检测时间比普通
ＰＣＲ检测时间缩短了 １ ５ ｈꎮ 由实验结果可知ꎬ采
用 ＭＮＰ －ｑＰＣＲ 方法检测 ＴＹＬＣＶ 特异性好ꎬ与
ＴｏＳＬＣＶ和 ＴＹＬＣＳＶ 均无交叉反应ꎻ建立的定量
标准曲线 Ｃｔ值与模板拷贝数对数之间呈良好的线
性关系ꎬ相关系数 Ｒ２为 ０ ９９９ ４ꎻ该方法的灵敏度
为 １ ０×１０２ ｃｏｐｉｅｓμＬ－１ꎬ比普通 ＰＣＲ高 １０ 倍ꎻ试
验内及试验间重复性试验的变异系数均小于 ２％ꎬ
重复性好ꎻ该方法可以准确检测田间样品中 ＴＹＬ￣
ＣＶ浓度ꎮ
本研究建立的 ＴＹＬＣＶ ＭＮＰ－ｑＰＣＲ 检测方法
特异性强ꎬ灵敏度高ꎬ重复性好ꎬ且操作简单ꎬ检测
时间短ꎬ能实现对病原物的定量分析ꎬ适用于田间
样品检测ꎬ检测结果准确可靠ꎬ为番茄黄化曲叶病
毒病的早期鉴定提供了一定的理论依据及实践基
础ꎬ在生产中具有较强实用价值ꎮ
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Ｔｏｍａｔｏ ｙｅｌｌｏｗ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ Ｓａｒｄｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｕｓｉｎｇ ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ
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ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｗｉｔｈ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ)
[Ｊ] Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ (中国农
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责任编辑:李晖
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