全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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基金项目$国家香蕉产业技术体系专项资金"
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#&福建省农业科技平台"
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作者简介$陈芳兰"
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#!女!在读硕士研究生!主要从事花卉生物技术研究
7)89.:
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通信作者$赖钟雄!博士!研究员!博士生导师!主要从事园艺植物生物技术研究
7)89.:
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三明野生蕉
!
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&
葡聚糖酶基因克隆及其
低温下
(
处理后的表达分析
陈芳兰!林玉玲!陈裕坤!冯
!
新!张梓浩!赖钟雄"
"福建农林大学 园艺植物生物工程研究所%园艺学院!福州
%$"""!
#
摘
!
要$以三明野生蕉"
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AA
+3B
C
D?E
A
#为材料!利用
4F)G24
和
4327
技术!克隆获得
"
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葡聚糖酶
$
个
基因"
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#的
>H63
和
H63
序列序列和生物信息学分析表明
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/
A
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(
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C
/
A
!
和
LE
C
/
A
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蛋白具有
6
端和
2
端"
2FGG
#信号肽结构!推测为
$
类
"
)#
!
%
葡聚糖酶!而
LE
C
/
A
%
只含有
6
端信号肽!无
2FGG
结构!
LE
C
/
A
$
则不具有信号肽结构&构建
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(
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(
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*
瞬时
表达载体并转化洋葱表皮的亚细胞定位观察结果显示!常温下
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(
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#
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和
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#
&
*
主要在细胞膜(细胞
质上表达!而经过
1M
低温处理后
!"
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#
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#!
(
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#
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!
和
!"
%
#
&
*
均能够转移至细胞核表达&
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因
在不同低温处理下的实时荧光定量"
N
4F)G24
#检测结果显示!
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因均能响应低温胁迫!是低温胁迫
相关基因!但基因间表达水平存在差异&低温下
53
处理后的定量结果显示!
53
处理会推迟
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因的
表达
关键词$三明野生蕉&
"
)#
!
%
葡聚糖酶&水杨酸&低温胁迫&亚细胞定位&实时荧光定量
G24
中图分类号$
O1,
&
O1&
!!!
文献标志码$
3
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,
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0
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4F)
G24
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香蕉是芭蕉科"
LE/9>Z9>
#芭蕉属"
!"#$
#植物!
是重要的观赏植物和粮食作物栽培香蕉适于在热
带亚热带地区种植!低温寒害会造成香蕉严重的叶
片果实损伤!在观赏和生产应用上受到严重限
制)#)!*研究发现!野生蕉具有较强耐寒性和抗病
性!与栽培香蕉相比!能够在温度更低!环境更恶劣
的条件下生长!因此充分开发利用野生蕉的优良特
性!对改良香蕉种质资源具有重要意义)%)$*
植物在受到非生物胁迫"机械伤害(高温(低温(
盐胁迫等#时!除了会产生生理生化上的应激反应抵
抗环境胁迫外!还会形成一系列的信号传导途径!激
活逆境相关基因的表达!诱导包括
"
)#
!
%
葡聚糖酶
在内的一系列抗逆蛋白来提高植物抵御环境伤害的
能力),)&*
"
)#
!
%
葡聚糖酶所属的
G4)!
蛋白是一类
重要的病程相关蛋白)#"*!在抵抗真菌侵染(病虫害(
环境胁迫等方面具有重要作用)##)#%*
"
)#
!
%
葡聚糖
酶根据其进化关系(蛋白质定位(功能和理化性质等
特点!可分为
*
类$
$
类蛋白含有一个与液泡定位相
关的
2)
端信号肽延伸结构"
2FGG
#!通常定位于液
泡上!主要由碱性蛋白组成!能够被病原体(乙烯(紫
外线照射及伤害诱导等表达!但受细胞分裂素和生
长素的抑制&
%
(
&
(

类由于不含有
2FGG
结构通
常定位在细胞间隙和细胞外!一般为酸性蛋白!酸性
蛋白能够受到病原体(细胞分裂素(水杨酸等诱导表
达)#%)#*目前对
"
)#
!
%
葡聚糖酶在植物抗寒作用方
面的研究相对较少!张妙霞)**对野生蕉抗寒机理展
开了初步研究!并在
!1M
常温和
#$M
下处理
%"X
后转入
*M
处理
,*X
的低温条件下!克隆到三明野
生蕉碱性
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因
!"
%
#
&
和
!"
%
#
&
#
!
进行相关的生物信息学和定量表达分析后!推测
!"
%
#
&
和
!"
%
#
&
#
是抗寒相关基因
水杨酸"
53
#是普遍存在于高等植物体中的内
源激素!广泛参与植物的生长发育!同时也是响应植
物环境伤害的重要信号因子!研究表明!外施
53
能
够缓解病虫害(高温(低温(重金属胁迫(盐胁迫等造
成的植物伤害)#1)#&*近年来的研究表明!在非生物
胁迫方面!
53
能通过
6G#).0\Z
A
Z0\Z0Y
途径!促进
抗氧化酶及保护酶相关基因如
)*+
(
,-.
(
/)0
(
1)-
(
,*.
(
23,
等的表达来清除植物体内的过氧
化物&也能通过
6G#)\Z
A
Z0\Z0Y
途径诱导
G4
相关
基因如葡聚糖酶基因(几丁质酶基因等的表达!共同
提高植物抗性!促进植物体抵御环境胁迫的能
力)!"*在
53
缓解植物低温胁迫方面!目前人们集
中于
53
作用于
6G
#
).0\Z
A
Z0\Z0Y
途径的研究!在香
蕉幼苗(甘蓝幼苗(茄子幼苗(西洋杜鹃(黄瓜幼苗(
水稻幼苗等不同科属植物上均有报道)!#)!1*对
6G#)\Z
A
Z0\Z0Y
途径!即
53
在低温下诱导病程相
关基因表达的研究较少!
2X90
C
)` E.H.0
C
)
#
*的研究
表明!水杨酸及茉莉酸能够诱导低温处理番茄果实
中
G4!
和
G4%
基因的表达本试验通过克隆获得
$
条三明野生蕉
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因!分别为编码酸
性
"
)#
!
%
葡聚糖酶的
!"
%
#
&
!
(
!"
%
#
&
%
(
!"
%
#
&
$
以
及编码碱性
"
)#
!
%
葡聚糖酶的
!"
%
#
&
#!
(
!"
%
#
&
*
!
之后进行了基因的碱基序列(氨基酸序列及生物信
息学的分析&对
!"
%
#
&
#!
(
!"
%
#
&
!
(
!"
%
#
&
*
进行
洋葱表皮亚细胞定位观察&分析不同低温及
53
处
理后
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因的定量表达情况!探讨
"
)
#
!
%
葡聚糖酶基因的低温表达机制
#
!
材料和方法
%+%
!
供试材料
试验所用三明野生蕉组培苗由福建农林大学园
艺植物生物工程研究所继代保存
%+B
!
方
!
法
%CBC%
!
!
$%
!
&
葡聚糖酶基因的克隆及序列分析
!
以
#%M
处理
%,X
的三明野生蕉组培苗叶片为材
料!参照天泽
463
提取试剂盒说明书进行总
463
的提取!并根据
FXZD8?
公司的
4Z^ZDY3.\J.D/Y
5YD90\>H635
[
0YXZ/./ .`Y
试剂盒说明书合成
>H)
63
!作为基因克隆模板采用
2F3B
法进行三明
野生蕉组培苗叶片
H63
的提取将
!"
%
#
&
和
!"
%
#
&
#
的
>H63
序列作为目标序列在小果野蕉基
因 组 数 据 库 "
XYY
A
$%%
K90909)
C
Z0?8Z+>.D9\+;D
%
X?8Z
#中
B:9/Y
!选取结果最靠前的
$
条
"
)#
!
%
葡聚
糖酶基因序列作为参考序列进行同源克隆!使用
H63L36
设计不同基因间包含有开放阅读框
"
I4J
#的引物!用于
>H63
及
H63
的克隆!其中
!"
%
#
&
#!
的
I4J
扩增采用张妙霞设计的引物序
"##
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
列
%a
端非编码区克隆采用
4327
巢式
G24
技术!
根据已经获得的
>H63
序列!设计
!
条
%a)4327
引
物!以
9E9
A
为下游引物进行扩增
G24
反应体系
及扩增程序参考赖恭梯)!&*的方法做适当调整引
物序列(退火温度和用途见表
#

G24
产物经过电
泳(回收(
F3
克隆后!将阳性克隆子送至铂尚公司
测序测序结果采用
H63L36
(
L7U3
和
GD?)
G9D98
(
5.
C
09:G*+"
(
FL
A
DZ(
G5I4F
(
62BR)GD?)
YZ.0F??:/
(
L?Y.;
在线分析软件对其核苷酸和氨基
酸序列进行分析
%+B+B
!
亚细胞定位观察
!
对所获得的其中
%
个
"
)
#
!
%
葡聚糖酶基因"
!"
%
#
&
#!
(
!"
%
#
&
!
(
!"
%
#
&
*
#
的
I4J
序列进行限制性内切酶分析!在基因编码
区的起始密码子和终止密码子处分别设计带酶切位
点
456
$
和
)
&
7
$
的上下游引物见表
#
!
G24
扩增
获得带酶切位点的
I4J
片段采用限制性内切酶
456
$
和
)
&
7
$
分别双酶切
A
23LBR3:%"!)UJG
质
粒及
!"
%
#
&
#!
(
!"
%
#
&
!
(
!"
%
#
&
*
的
G24
产物"酶
切体系参照
FXZD8?
酶切说明书#后!经
F
*
H63
连
接酶连接!获得
%$5)LE
C
/
A
#+!)UJG
(
%$5)LE
C
/
A
!)
UJG
(
%$5)LE
C
/
A
*)UJG
重组质粒!并送铂尚公司测序
以验证载体构建正确采用冻融法将重组质粒导入
QB3**"*
农杆菌!使用农杆菌介导法侵染洋葱表皮细
胞)%"*将侵染的洋葱表皮材料!一部分置于
!$M
表
%
!
基因克隆"亚细胞定位以及荧光定量
D)E
引物序列
F9K:Z#
!
Q./Y?;
A
D.8ZD/E/Z\.0
C
Z0Z>:?0.0
C
!
/EK>Z:E:9D:?>9:.@9Y.?0
!
O4F)G24
引物名称
GD.8ZD098Z
引物序列
GD.8ZD5Z
N
EZ0>Z
"
$a
#
%a
#
退火温度
F8
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M
用途
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3FUUF33223U3UUFU2F2F2F
FF3U2FU33U2F33F3UUUF3332
323U3F23FUU2U33223F3U2
U33FUFF222F2FF2FUUFF23F
3FUU2F3FF2233U33FF3FFFUUF2
FU323F33222332U3223U
3FUU2FUU2UU32UFUF2FF2F2F
FF323333UUUUU33U33F3233UU
U23333223U3F233UUF2F2U322U
FUU3U3U3UFUUU3UUUU2U332
223UUF2F232FFF22F3FU22FFUF
U3FU3U33223U333U2FF23UUU
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)223FUU3FUU23323333U2FF2F2F2F
;;32F3UFU33U2FF3FFFUUF3U32UUU2
)223FUU3FUUF33223U3UUFU2F2F2F
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)223FUUFU323F33222332U3223U
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2FF2F2F2F2223U2U3UUFU
UU3FFUU3UU223UFU32FU2
F2233233UF2F2F32333F22332
223UF3FU2U32U32UFF22F2
2UU23FU3F2UU233233F2FF222
U223UF3FU2U32U32UFF22F2
3FUFFF23F22233F33U23322FU
UU33FF2F223FF23FF2FU22F
U32F23F2FU2FU2233FU22F
FU3F32222U3U332U22FUF
U232FF2UUF2F2FFF33F223332
222332U3223U333F2F23UU
223FFU23FFUFF33F2F23UF2FFU
2FFUUF33F2F3232FFU23F2333U
$
$$
$,
$
$1
$$
$1
$$
$1
$1
,!
I4J
扩增
38
A
:.;.>9Y.?0
?;I4J
%a)4327
亚细胞定位
5EK>Z:E:9D:?>9:.@9Y.?0
N
4F)G24
!!
注$下划线为酶切位点!黑体部分为保护性碱基
6?YZ
$
FXZDZ/YD.>Y.?0Z0@
[
8Z>EYY.0
C
/.YZ/=ZDZ
A
?.0YZ\?EYK
[
E0\ZD:.0Z/90A
D?YZ>Y.^ZK9/Z/=ZDZ9
AA
Z9DZ\.0K?:\+
###
&
期 陈芳兰!等$三明野生蕉
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因克隆及其低温下
53
处理后的表达分析
培养
!
#
%后使用共聚焦成像仪观察基因的亚细
胞定位!另一部分在
!$M
培养
!后转移到
1M
继
续培养
!"X
!使用
#
(
C
%
8QH3GR
染色后再进行亚
细胞定位的观察
%+B+&
!
实时荧光定量表达分析
!
将生长健壮且长
势相近的三明野生蕉组培苗!分别经不同温度"
!1
M
(
!"M
(
#%M
(
*M
(
"M
(
(!M
(
(*M
(
(,M
#
下处理
%,X
!
1M
低温下处理
#
(
*
(
1
(
#!
和
!*X
!
1
M
低温下喷施
"+$88?:
%
Q53
处理
#
(
*
(
1
(
#!
和
!*
X
后!取叶片于液氮速冻!置于
(1"M
保存!用于
463
提取每个处理重复
%
次参照
5SB47<)
5>D.
A
Y
FL试剂盒将提取的总
463
逆转录成
>H63
!
用于荧光定量表达分析分别在
!"
%
#
&
(
!"
%
#
&
#
的跨内含子区域!
!"
%
#
&
#!
区别于
!"
%
#
&
(
!"
%
(
#
&
#
的外显子区域设计特异性引物!
!"
%
#
&
!
和
!"
%
#
&
*
在靠近终止密码的区域设计上游引物!
%a)
]F4
区域设计下游引物!在
!"
%
#
&
%
的
I4J
区域!
!"
%
#
&
$
的
$a)]F4
区域分别设计上下游引物!引
物序列见表
#
以
#15
为内参基因)**反应体系和
扩增程序参考赖恭梯方法)!&*做适当调整使用荧
光定量
G24
仪
Q.
C
XY2
[
>:ZD*1"
"
4?>XZ
#进行扩增
将不同处理的
>H63
样本的混合物稀释不同倍数
作为模板制作标准曲线!获得
7
值在
#+&
#
!+#
之
间!并验证引物特异性!得到单峰溶解曲线扩增反
应结束后!数据处理按照
G;9;;.
法!采用
7<>Z:
计算
基因相对表达量每试验
%
次独立重复
!
!
结果与分析
BC%
!
三明野生蕉
!
$%
!
&
葡聚糖酶基因
:FG(
和
FG(
序列的获得
!!
表
!
显示!以合成的经
#%M
处理
%,X
的三明
野生蕉组培苗叶片
>H63
为模板!经
G24
扩增得
到
$
个单一片段!长度分别为
##!!
(
##1#
(
##&1
(
##!"
和
#!&!K
A
测序结果分析显示!这
$
条序列
均带有完整
I4J
区!分别为
#"!"
(
#"*
(
&&&
(
#"!%
和
&,"K
A

B:9/Y0
和功能结构域分析显示!这
$
条片段与其他物种
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因序列高度
一致!编码蛋白均具有糖基水解酶第
#
保守特征结
构域)
QRbL
*
+
)
QRbLJS_3
*+
%
,)
5F3U
*
7
)
5F3
*
U_G
)
5F6
*
+
)
53UO
*
)
#%
*
说明它们为三明野生蕉
的
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因!分别命名为
!"
%
#
&
#!
(
!"
%
#
&
!
(
!"
%
#
&
%
(
!"
%
#
&
*
和
!"
%
#
&
$
之后进行
%a)]F4
巢式扩增!获得
!"
%
#
&
#!
(
!"
%
#
&
!%a)
]F4
长度分别为
1#
和
#%*K
A
最后以三明野生蕉
叶片
H63
为模板!克隆获得
!"
%
#
&
!
(
!"
%
#
&
%
(
!"
%
#
&
*
(
!"
%
#
&
$H63
序列!长度分别为
#!"
(
##&1
(
#!##
和
#!&!K
A
"表
!
#
BCB
!
三明野生蕉与小果野蕉
!
$%
!
&
葡聚糖酶基因
序列比对分析
!!
以三明野生蕉为材料!克隆获得的
"
)#
!
%
葡聚
糖酶基因序列结果分析显示!
"
)#
!
%
葡聚糖酶基
因间具有较高相似性!为
1"+$!c
"
I4J
#!
!"
%
#
&
%
和
!"
%
#
&
$
无内含子结构!而
!"
%
#
&
#!
(
!"
%
#
&
!
和
!"
%
#
&
*
均包含
#
个内含子! 个外显子!内含子
剪接均符合
UF)3U
剪切规则"图
#
#
三明野生蕉与小果野蕉的
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因
序列 比 对 发 现!
!"
%
#
&
#!
(
!"
%
#
&
!
(
!"
%
#
&
%
(
!"
%
#
&
*
和
!"
%
#
&
$
分别与小果野蕉
"
)#
!
%
葡聚糖
酶基因
/)!8,
-
,59:#"0"#!$"
-
""#
(
/)!8,
-
,59:10!!"*"
-
""#
(
/)!8,
-
,59:10!!*$"
-
""#
(
/)!8,
-
,59:%0"1"%"
-
""#
和
/)!8,
-
,59:10
!!**"
-
""#
具有高度相似性!但在基因内含子剪接
和翻译位点上存在较大差异"图
#
#
!"
%
#
&
#!
与
/)!8,
-
,59:#"0"#!$"
-
""#
有着相同的内含子剪
切位点!编码基本一致的氨基酸序列&
!"
%
#
&
!
和
!"
%
#
&
*
与
/)!8,
-
,59:10!!"*"
-
""#
和
/)(
!8,
-
,59:%0"1"%"
-
""#
不同的内含子剪切位点!
使得
!"
%
#
&
!
和
!"
%
#
&
*
形成更长的转录本!从而
表
B
!
!
$%
!
&
葡聚糖酶基因
:FG(
及
FG(
序列信息
F9K:Z!
!
FXZ.0;?D89Y.?0?;
"
)#
!
%)
C
:E>909/Z>H6390\H63/Z
N
EZ0>Z/
基因名称
UZ0Z098Z
>H63
长度
QZ0
C
YX
%
K
A
登录号
UZ0K90TRH
I4J
%
K
A
氨基酸数
38.0?9>.0E8KZD
%a)]F4
%
K
A
H63
长度
QZ0
C
YX
%
K
A
登录号
U90K90TRH
!"
%
#
&
#+! ##!! `L"%!#1" #"!" %%& 1#
"
A
:?
[
3!#K
A
#
!"
%
#
&
! ##1# J`"##$" #"* %*1 #%*
"
A
:?
[
3#1K
A
#
#!" `L!%#,
!"
%
#
&
% ##&1 `L"%!#1 &&& %%! 1" ##&1 `L!%#$
!"
%
#
&
* ##!" d`#1,&, #"!% %*" & #!## `L!!&,#
!"
%
#
&
$ #!&! `L"%!#& &," %#& " #!&! `L!%#*
!##
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
图
#
!
三明野生蕉及小果野蕉
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因结构示意图
黑色框表示转录本的结构外显子!白色框表示可变外显子!实线表示内含子及部分
%
.
]F4
!
22
%
2U
(
UF
%
23
(
UF
%
3U
表示内含子剪接位点!
3FU
为起始密码子!
F3U
和
F33
为终止密码子
J.
C
+#
!
5908.0
C
=.:\K9090990\9>E8.09Y9=.:\K90909
"
)#
!
%)
C
:E>909/Z
C
Z0Z/>?0/YDE>Y.?0\./
A
:9
[
>?0/Y.YEY.^ZZTK?[
/
A
:.>Z\Z.
]F49DZ\./
A
:9
[
ZK
[
/?:.\:.0Z/
!
22
%
2U
!
UF
%
23
!
UF
%
3UDZ
A
DZ/Z0Y/
A
:.>Z/.YZ/+3FU.0\.>9YZ//Y9DY>?\?0/90\F3U
!
F33.0\.>9YZ/Y?
A
>?\?0/+
编码更长的氨基酸序列&而翻译起始位点的不同使
得
!"
%
#
&
%
(
!"
%
#
&
$
比
/)!8,
-
,59:10!!*$"
-
""#
(
/)!8,
-
,59:10!!**"
-
""#
编码更短的氨基
酸序列这种基因结构的差异!使得三明野生蕉与
小果野蕉形成不同的
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因转录本!
从而导致翻译的
"
)#
!
%
葡聚糖酶在结构和功能上存
在差别
将
!"
%
#
&
#!
与
!"
%
#
&
"
&#$K
A
#和
!"
%
#
&
#
"
&$#K
A
#
)
*
*对比发现!
!"
%
#
&
#!
比
!"
%
#
&
(
!"
%
(
#
&
#
多出
#"*
和
,&K
A
碱基!其余部分基本匹配观
察基因结构"图
#
#发现!
!"
%
#
&
#!
比
!"
%
#
&
和
!"
%
#
&
#
多出的片段正好与位于
!"
%
#
&
)H63
(
!"
%
#
&
#)H63
中与外显子相接的内含子片段相吻
合!并 且
!"
%
#
&
#!
(
!"
%
#
&
(
!"
%
#
&
#
中!只 有
!"
%
#
&
#+!
符合
UF)3U
内含子剪切规则因此认
为
!"
%
#
&
#!
(
!"
%
#
&
(
!"
%
#
&
#
是来自于同一基因
的不同转录本!但是
!"
%
#
&
#!
才是
!"
%
#
&
#!
(
!"
%
#
&
(
!"
%
#
&
#%
个基因中的正常转录本!
!"
%
#
&
(
!"
%
#
&
#
可能是外显子缺失型的可变剪接体)%#)%%*
即
!"
%
#
&
在剪切时将连接内含子
$a
和
%a
端的
$#
和
$%K
A
外显子一同切除!
!"
%
#
&
#
在剪切时则将连
接内含子
%a
端的
,&K
A
外显子切除
BC&
!
三明野生蕉
!
$%
!
&
葡聚糖酶生物信息学分析
利用
H63L36
将克隆获得的
"
)#
!
%
葡聚糖酶
基因序列翻译成氨基酸序列!进行生物信息学分析!
LE
C
/
A
#+!
(
LE
C
/
A
*
属于碱性
"
)#
!
%
葡聚糖酶!
LE
C
/
A
!
(
LE
C
/
A
%
(
LE
C
/
A
$
属于酸性
"
)#
!
%
葡聚糖
酶"表
%
#
$
个
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因富含的氨基酸
情况为"氨基酸含量大于
1c
#$
LE
C
/
A
#+!
富含
3:9
##+!c
(
5ZD&+c
(
b9:&+c
(
U:
[
1+%c
和
QZE
1+%c
!
LE
C
/
A
!
富含
3:9#"+,c
(
5ZD##+1c
和
b9:
&+$c
&
LE
C
/
A
%
富含
3/01+*c
(
QZE&+%c
(
5ZD
##+#c
和
b9:#"+1c
!
LE
C
/
A
*
富含
3:9##+$c
(
b9:#"+&c
和
5ZD1+1c
的氨基酸!
LE
C
/
A
$
富含
3:9&+*c
(
QZE1+$c
和
5ZD1+1c
分析氨基酸序
列比对图"图
!
#!结果显示
LE
C
/
A
#+!
(
LE
C
/
A
!
和
LE
C
/
A
*
均编码有
!#
个氨基酸组成的
6
端前导信
号肽序列!并且具有
2
端延伸信号肽序列"
2FGG
#
结构的
6)
糖基水解酶位点!推测
LE
C
/
A
#+!
(
LE
C
)
/
A
!
和
LE
C
/
A
*
属于
$
类
"
)#
!
%
葡聚糖酶!而
LE
C
)
/
A
%
只含有
6
端信号肽!无
2FGG
结构!
LE
C
/
A
$
不
具有信号肽结构!因此
LE
C
/
A
%
和
LE
C
/
A
$
可能归
于后三类
"
)#
!
%
葡聚糖酶)#$!#,!%**将三明野生蕉
"
)
#
!
%
葡聚糖酶基因与多个物种的
"
)#
!
%
葡聚糖酶氨
%##
&
期 陈芳兰!等$三明野生蕉
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因克隆及其低温下
53
处理后的表达分析
表
&
!
!
$%
!
&
葡聚糖酶基因翻译的氨基酸序列特征
F9K:Z%
!
FXZ98.0?9>.\/Z
N
EZ0>Z>X9D9>YZD./Y.>/?;
"
)#
!
%)
C
:E>909/Z
C
Z0Z/
蛋白名称
GD?YZ.0098Z
相对分子量%
H9
4Z:9Y.^Z8?:Z>E:9D
=Z.
C
XY
%
H9
稳定性
5Y9K.:.Y
[
%
]0/Y9K.:.Y
[
亲疏水性
P
[
\D?
A
X
[
:.>
%
P
[
\D?
A
X?K.>
等电点
GR
酸碱性
3>.\.>
%
B9/.>
跨膜结构域个数
FD90/8Z8KD90Z
\?89.00E8KZD
LE
C
/
A
#+! %,%$!+%
不稳定
]0/Y9K.:.Y
[
疏水
P
[
\D?
A
X?K.> 1+*
碱性
B9/.>
LE
C
/
A
! %"1+
不稳定
]0/Y9K.:.Y
[
疏水
P
[
\D?
A
X?K.> *+1"
酸性
3>.\.> ##
LE
C
/
A
% %$&#+!
稳定
5Y9K.:.Y
[
亲水
P
[
\D?
A
X
[
:.> *+%!
酸性
3>.\.> 1
LE
C
/
A
* %,**+&
稳定
5Y9K.:.Y
[
疏水
P
[
\D?
A
X?K.> &+##
碱性
B9/.> 1
LE
C
/
A
$ %*,!"+!
不稳定
]0/Y9K.:.Y
[
疏水
P
[
\D?
A
X?K.> *+$1
酸性
3>.\.> ##
图
!
!
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因间的氨基酸序列比对图
大框表示糖基水解酶
#
保守氨基酸序列&
6)
C
:
[
表示
2
端延伸信号肽
2FGG
结构的
6
端糖基化位点
J.
C
+!
!
3:.
C
08Z0Y?;98.0?9>.\/Z
N
EZ0>Z/?;
"
)#
!
%)
C
:E>909/Z0E8KZD/
U:
[
>?)X
[
\D?)#/ED
A
ZD;98.:
[
>?0/ZD^Z\\?89.0/./DZ
A
DZ/Z0YZ\K
[
K.
C
/?:.\:.0ZK?<
!
6)
C
:
[
.0\.>9YZYXZ6)
C
:
[
>?/
[
:9Y.?0/.YZ?;2)YZD8.09:
A
D?
A
Z
A
Y.\Z
"
2FGG
#
+
基酸序列进行进化树分析"图
%
#!结果可以分为
!
大分支体系!
$
类
LE
C
/
A
#+!
(
LE
C
/
A
!
(
LE
C
/
A
*
与
拟南芥"
,:$;<=6
&
#<#>9$?<$@$
#
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因
BU#
"
3F%U$!"+#
#(
BU!
"
3F%U$!,"+#
#(
BU%
"
3F%U$!*"+#
#(
B7F3U*
"
3F$U!"%%"+#
#(
BU$
"
3F$U!"%*"+#
#处于同一分支体系!进化关系较
近!其中碱性
LE
C
/
A
#+!
(
LE
C
/
A
*
与生姜"
A<@
%
<(
;7:
#亲缘关系最接近!酸性
LE
C
/
A
!
与豆科的田菁
"
)7#;$@<$:6#>:$>$
#亲缘关系最接近&
LE
C
/
A
(
LE
C
)
/
A
#
(
LE
C
/
A
%
(
LE
C
/
A
$
则与海棠 "
B$>:6
&
9$5":(
5$#
#(橡胶树"
17C7$;:$##(无油樟"
,D;6(
:7??$>:<596
&
6=$
#独立为另一分支体系
BCH
!
12
3
4
5
%B
"
12
3
4
5
B
"
12
3
4
5
H
的亚细胞定位
分析
!!
利用
G5I4F
预测
!"
%
#
&
!
主要在细胞质膜和
内 质网膜表达!而
!"
%
#
&
#!
和
!"
%
#
&
*
在细胞外
*##
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
图
%
!
三明野生蕉及其他物种
"
)#
!
%
葡聚糖酶的系统进化树
分支上的数字代表
#"""
次
B??Y/YD9
A
重复验证中该节点的可信度百分比值
J.
C
+%
!
GX
[
:?
C
Z0ZY.>YDZZ?;
"
)#
!
%)
C
:E>909/Z;D?85908.0
C
=.:\K9090990\?YXZD/
A
Z>.Z/
FXZ0E8KZD9YYXZKD90>XZ/DZ
A
DZ/Z0Y/YXZDZ:.9K.:.Y
[A
ZD>Z0Y?;B??Y/YD9
A
9^:EZ/9>>?D\.0
C
Y?#"""DZ
A
:.>9Y.?0/
表达试验中根据
UJG
荧光蛋白信号在洋葱表皮
上的分布!观察
!"
%
#
&
#!
(
!"
%
#
&
!
和
!"
%
#
&
*
常
温和低温处理下亚细胞定位常温处理结果"图
*
#
显示!
LE
C
/
A
#+!)UJG
(
LE
C
/
A
!)UJG
和
LE
C
/
A
*)
UJG
蛋白主要分布在细胞膜(细胞质上!
UJG
空载
体蛋白在细胞核(细胞质(细胞膜(细胞间隙处均有
分布&
1M
低温处理结果"图
$
#显示!经核染料
H3)
GR
染色过的洋葱表皮细胞核呈现蓝色荧光信号!
LE
C
/
A
#+!)UJG
(
LE
C
/
A
!)UJG
和
LE
C
/
A
*)UGJ
融
合表达载体的绿色荧光信号除了分布在细胞膜和细
胞质外!还与
H3GR
染色的核荧光信号重叠!说明
LE
C
/
A
#+!)UJG
(
LE
C
/
A
!)UJG
和
LE
C
/
A
*)UGJ
在
低温下均能够转移至细胞核表达
BCI
!
低温处理下
!
$%
!
&
葡聚糖酶基因表达分析
利用实时荧光定量!检测不同温度处理下!三明
野生蕉
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因的表达水平结果"图
,
#显示!随着温度降低!
!"
%
#
&
(
!"
%
#
&
#
和
!"
%
(
#
&
#!
呈现/先升高后降低0的表达趋势!
!"
%
#
&
!
(
!"
%
#
&
%
(
!"
%
#
&
*
和
!"
%
#
&
$
呈现/先降低后升高
再降低0的表达趋势&
!"
%
#
&
(
!"
%
#
&
#!
(
!"
%
#
&
!
和
!"
%
#
&
$
在
*M
时达到表达高峰!表达量分别为
常温的
!+$
(
!+!
(
%+$
和
#+*
倍左右!而
!"
%
#
&
#
(
!"
%
#
&
%
和
!"
%
#
&
*
在
"M
表达量达到最高!分别
为常温的
!+
(
$
和
*+$
倍左右总体上!
!"
%
#
&
(
!"
%
#
&
!
(
!"
%
#
&
*
和
!"
%
#
&
$
对温度变化的响应较
为平缓!表达量较低!而
!"
%
#
&
#
(
!"
%
#
&
#!
和
!"
%
#
&
%
对温度变化响应剧烈!表达量较高说明
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因均能够响应低温胁迫改变表达
量!但是基因间的表达趋势和表达水平存在差异
BCJ
!
低温下
(
处理后
!
$%
!
&
葡聚糖酶基因表达
分析
!!
对三明野生蕉组培苗进行
1M
低温及
1M
下喷
施
53
处理!处理时间为
"
#
!*X
实时荧光定量结
果"图

#显示!
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因能够在
1M
低温
处理
#
#
*X
内显著提高表达量!其中
!"
%
#
&
(
!"
%
(
#
&
#
和
!"
%
#
&
#!
在低温处理
#X
时达到高峰!而
!"
%
#
&
!
(
!"
%
#
&
*
和
!"
%
#
&
$
在处理
*X
时达到高
峰
1M
低温下喷施
53
则推迟了
"
)#
!
%
葡聚糖酶
基因的表达!使得
!"
%
#
&
(
!"
%
#
&
#
和
!"
%
#
&
#!
在
处理
#!X
时达到最高!且高于未喷施
53
达到高峰
时的表达量!而
!"
%
#
&
!
(
!"
%
#
&
*
和
!"
%
#
&
$
在
53
处理
#!X
后开始升高!并且在处理
!*X
时已显著
超过未喷施
53
所达到的表达高峰说明
"
)#
!
%
葡
聚糖酶基因对低温的响应呈现较为敏感的即时效
应!均能在短时间内快速提高表达水平!并且在低温
下能够被
53
调控表达
$##
&
期 陈芳兰!等$三明野生蕉
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因克隆及其低温下
53
处理后的表达分析
图
*
!
常温下
!"
%
#
&
#!
(
!"
%
#
&
!
和
!"
%
#
&
*
在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位
3B2
(
H7J
(
UPR
(
d` Q
和
L6I
分别为携带有
LE
C
/
A
#+!)UJG
(
LE
C
/
A
!)UJG
(
LE
C
/
A
*)UJG
融合表达载体(
#%"!
空载体及
未侵染农杆菌的洋葱表皮在共聚焦显微镜不同视野下拍摄的图片图片
3HUdL
为明场下的洋葱表皮细胞形态!
B7P`
为
不同基因的表达载体和空白载体在
UJG
荧光场下的绿色信号分布!
6
显示未侵染农杆菌的洋葱表皮细胞无绿色荧光信号分布
2
(
J
(
R
(
Q
和
I
分别为图片
3B
(
H7
(
UP
(
d`
和
L6
的叠加
J.
C
+*
!
5EK>Z:E:9D:?>9:.@9Y.?0?;!"
%
#
&
#!
!
!"
%
#
&
!
!
!"
%
#
&
*.0YXZ?0.?0Z
A
.\ZD89:>Z:/9YD??8YZ8
A
ZD9YEDZ
3B2
!
H7J
!
UPR
!
d` Q90\L6IDZ
A
DZ/Z0YYXZ
A
.>YEDZ/?;?0.?0Z
A
.\ZD89:>Z:/?;LE
C
/
A
#+!)UJG
!
LE
C
/
A
!)UJG
!
LE
C
/
A
*)UJG;E/.?0
A
D?YZ.0
!
#%"!)
A
?/.Y.^Z>?0YD?:
A
D?YZ.090\0Z
C
9Y.^Z>?0YD?:>9
A
YEDZ\K
[
8.>D?/>?
A
ZE0\ZD\.;;ZDZ0Y^.Z=/+
3HUdL/X?=YXZ8?D
A
X?:?
C
.>9:?;?0.?0Z
A
.\ZD89:>Z:/E0\ZDKD.
C
XY;.Z:!
B7P 6`/X?=YXZ
C
DZZ0;:E?DZ/>Z0Y/.
C
09:
E0\ZDUJG;.Z:&
2
!
J
!
R
!
Q90\I=ZDZYXZ.89
C
Z/8ZD
C
Z\?;3B
!
H7
!
UP
!
d` 90\L6
A
.>YEDZ/
!
DZ/
A
Z>Y.^Z:
[
+
,##
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
图
$
!
1M
低温处理后
!"
%
#
&
#!
(
!"
%
#
&
!
和
!"
%
#
&
*
在洋葱表皮细胞中的亚细胞定位
3B2H
(
7JUP
(
Rd` Q
分别为携带有
LE
C
/
A
#+!)UJG
(
LE
C
/
A
!)UJG
(
LE
C
/
A
*)UJG
融合表达载体的洋葱表皮在
共聚焦显微镜不同视野下拍摄的图片图片
37R
为明场下的洋葱细胞形态!
BJd
为洋葱表皮细胞核经
H3GR
染色后
发出蓝色荧光!
2U`
表示
LE
C
/
A
#+!)UJG
(
LE
C
/
A
!)UJG
(
LE
C
/
A
*)UJG
融合表达载体在
UJG
荧光场下的绿色荧光分布
H
(
P
(
Q
分别为图片
3B2
(
7JU
(
Rd`
的叠加
J.
C
+$
!
5EK>Z:E:9D:?>9:.@9Y.?0?;!"
%
#
&
#!
!
!"
%
#
&
!
!
!"
%
#
&
*.0YXZ?0.?0Z
A
.\ZD89:>Z:/E0\ZD1MYDZ9YZ3B2H
!
7JUP90\Rd` QDZ
A
DZ/Z0YYXZ
A
.>YEDZ/?;?0.?0Z
A
.\ZD89:>Z:/?;LE
C
/
A
#+!)UJG
!
LE
C
/
A
!)UJG90\LE
C
/
A
*)UJG;E/.?0
A
D?YZ.0>9
A
YEDZ\K
[
8.>D?/>?
A
ZE0\ZD\.;;ZDZ0Y^.Z=/+37R/X?=YXZ8?D
A
X?:?
C
.>9:?;?0.?0Z
A
.\ZD89:>Z:/E0\ZDKD.
C
XY;.Z:!
BJd[
Z\YXZ?0.?00E>:ZE/>?:?DK:EZ=.YXH3GR
&
2U` /X?=YXZ
C
DZZ0;:E?DZ/>Z0Y/.
C
09:?;LE
C
/
A
#+!)UJG
!
LE
C
/
A
!)UJG90LE
C
/
A
*)UJG;E/.?0
A
D?YZ.0E0\ZDUJG;.Z:\+H
!
P90\Q=ZDZYXZ.89
C
Z/8ZD
C
Z\?;3B2
!
7JU90\Rd`
A
.>YEDZ/
!
DZ/
A
Z>Y.^Z:
[
+
图
,
!
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因在不同温度下处理
%,X
的相对表达
J.
C
+,
!
4Z:9Y.^ZZ<
A
DZ//.?0?;
"
)#
!
%)
C
:E>909/Z
C
Z0Z/9Y\.;;.ZDZ0YYZ8
A
ZD9YEDZYDZ98Z0Y/;D?8!1MY?"M;?D%,X
##
&
期 陈芳兰!等$三明野生蕉
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因克隆及其低温下
53
处理后的表达分析
图

!
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因不同处理下的相对表达量
3
(
B
(
2
分别为常温
!1M
(
1M
(
1Me53
处理
"
#
!*X
的
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因相对表达量
J.
C
+
!
4Z:9Y.^ZZ<
A
DZ//.?0:Z^Z:?;
"
)#
!
%)
C
:E>909/Z
C
Z0Z/E0\ZD\.;;ZDZ0YYDZ9Y8Z0Y/
3
!
B90\2DZ
A
DZ/Z0YYXZDZ:9Y.^ZZ<
A
DZ//.?0?;
"
)#
!
%)
C
:E>909/Z
C
Z0Z/E0\ZD!1M
!
1M90\1Me53YDZ9Y8Z0Y;?D"(!*X
!
DZ/
A
Z>Y.^Z:
[
%
!
讨
!
论
&C%
!
!
$%
!
&
葡聚糖酶基因的可变剪接可能参与低
温胁迫相关反应
!!
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因是一类重要的逆境胁迫相
关基因)%$*本试验通过对三明野生蕉
"
)#
!
%
葡聚糖
酶基因进行不同处理的定量表达结果分析表明!
"
)
#
!
%
葡聚糖酶基因均能够响应低温胁迫!是低温胁
迫相关基因!在抗寒中起到重要作用
"
)#
!
%
葡聚
糖酶基因对低温胁迫的响应可分为
!
种类型$
!"
%
(
#
&
(
!"
%
#
&
#
!
!"
%
#
&
#!
对低温响应更为敏感"
1M
处理
#X
即达到表达高峰#!随着温度的降低!能够
迅速启动抗寒响应机制!呈现直接/升高后降低0的
表达趋势&而
!"
%
#
&
!
(
!"
%
#
&
%
(
!"
%
#
&
*
和
!"
%
(
#
&
$
对低温表现出一段时间的适应过程"
1M
处理
*
X
达到表达高峰#!随着温度的降低呈现/先降低后
升高再降低0的表达趋势总体上
"
)#
!
%
葡聚糖酶
基因均能够相继在
*M
和
"M
处理下达到表达高
峰!推测低温胁迫下!
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因能够分工
协作!协同表达提高植物抵抗低温伤害的能力研
究表明可变剪接现象在真核生物界普遍存在!环境
胁迫能够激发基因不同可变剪接体的表达!从而上
调相关蛋白的表达水平!增强植物抵抗逆境的能
力)%,)%1*本试验发现!不同低温处理诱导了
!"
%
(
#
&
(
!"
%
#
&
#
和
!"
%
#
&
#!
三个剪接体的表达!剪接
位点的差异使得
!"
%
#
&
(
!"
%
#
&
#
(
!"
%
#
&
#!
在植
1##
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
物体中的转录水平和对低温的响应水平上存在差
异$总体上
!"
%
#
&
#
(
!"
%
#
&
#!
的转录水平远高于
!"
%
#
&
!推测
!"
%
#
&
与内含子
$
端相接部分的可变
外显子片段缺失可能是造成
!"
%
#
&
比
!"
%
#
&
#
(
!"
%
#
&
#!
转录水平低的关键&低温处理下
!"
%
#
&
(
!"
%
#
&
#!
在
*M
表达量最高!而
!"
%
#
&
#
在
"M
时才达到最高表达量!可能
!"
%
#
&
(
!"
%
#
&
#!
与
!"
%
#
&
#
具有差异的
%
端可变剪接片段对调控基因
响应低温胁迫起到重要作用
&CB
!
低温诱导
12
3
4
5
%B
"
12
3
4
5
B
"
12
3
4
5
H
的亚
细胞定位改变从而提高抗寒性
!!
本试验利用共聚焦显微镜观察到常温下!
$
类
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因
!"
%
#
&
#!
(
!"
%
#
&
!
(
!"
%
#
&
*
不仅定位于膜系统!还有少量定位在细胞质中研
究表明!许多基因并不只存在一种蛋白定位!如
4EF-#
(
4-E#
等一些
4
基因的多种定位是其能够
执行功能的关键)%&!*"*推测
"
)#
!
%
葡聚糖酶在细胞
膜系统及细胞质的分布使得
"
)#
!
%
葡聚糖酶可能执
行蛋白转运及信号传递等功能此外许多基因能够
被代谢干扰(信号传导(环境改变等刺激改变其亚细
胞定位)%&)*!*如拟南芥中!定位于内质网的
"
)#
!
%
葡聚糖酶
3YBU!
在
53
处理下能够分泌到质外体
中)*%*本试验对
!"
%
#
&
#!
(
!"
%
#
&
!
(
!"
%
#
&
*
的
亚细胞定位试验进行了低温处理!观察低温对
!"
%
#
&
#!
(
!"
%
#
&
!
(
!"
%
#
&
*
表达的影响!结果显
示
1M
低温处理下
!"
%
#
&
#!
(
!"
%
#
&
!
(
!"
%
#
&
*
均
能够转移至细胞核表达!结合定量结果
!"
%
#
&
#!
(
!"
%
#
&
!
(
!"
%
#
&
*
从
#%M
到
*M
处理之间的基因
表达量急剧升高!推测
!"
%
#
&
#!
(
!"
%
#
&
!
(
!"
%
(
#
&
*
基因在低温下大量表达!一部分翻译成抗逆蛋
白直接参与抗寒作用!另一部分则转移至细胞核!作
为其他低温胁迫相关基因的信号传导因子起调控作
用相关作用机理已有报道!如在拟南芥中!
3+)#
对抗病基因的诱导需要在定位于细胞核的
E-)*
基
因的调控下才能起作用)***因此推测
!"
%
#
&
#!
(
!"
%
#
&
!
(
!"
%
#
&
*
的抗寒途径及作用方式并不是唯
一的!而是与其他抗寒调节相关因子形成复杂的调
控网络从而共同抵抗植物的低温胁迫
&C&
!
低温下
(
调控
!
$%
!
&
葡聚糖酶基因表达的可
能机制
!!
F?8?
[
96.T.
等)*$*认为
53
是碱性
"
)#
!
%
葡聚
糖酶基因的抑制因子!是酸性
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因
的激发因子!反之
d3
是碱性
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因的
激发因子!是酸性
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因的抑制因子!
植物受到机械伤害下!内源
53
不会变化!而
d3
能
够积累!因此机械伤害会促进碱性
"
)#
!
%
葡聚糖酶
基因的表达!但不会诱导酸性
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因
表达而
2X90
C
)` E.H.0
C
)
#
*用低温处理西红柿果
实
"
#
!1发现!
53
和
d3
都能够促进了碱性
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因的表达因此
53
和
d3
在受到机械
伤害和低温胁迫下对
G4
蛋白的诱导机制是不同
的本试验定量结果表明!
53
能够通过
6G#)\Z)
A
Z0\Z0Y
途径推迟
1M
低温下碱性和酸性
"
)#
!
%
葡
聚糖酶基因的表达前人研究表明低温会使植物体
内的细胞膜结构首先出现变化!膜脂相变导致细胞
代谢失调是植物受到寒害的关键)*,)*1*推测
1M
低
温破坏了细胞膜结构稳定性!使定位于膜系统上的
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因能够快速响应低温伤害大量表
达!而低温下
53
处理在短时间内保护了植物细胞
膜结构稳定性和完整性!从而减缓了细胞膜受到的
低温伤害)!#!!!1*因此低温下
53
处理延缓了细胞
膜受到低温伤害的时间!使得
"
)#
!
%
葡聚糖酶基因
因未能感受到膜变化而推迟表达
"
)#
!
%
葡聚糖酶
基因的表达机制还有待更为深入的研究
参考文献#
)
#
*
!
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*
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张妙霞
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野生香蕉"
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A
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H
*
+
福州$福建农林大学
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!
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期 陈芳兰!等$三明野生蕉
"
)#
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葡聚糖酶基因克隆及其低温下
53
处理后的表达分析
),
*
!
L3_S
"马文月#
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葡聚糖酶基因克隆及其低温下
53
处理后的表达分析