全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$国家自然科学基金"
%##""!#1
#&国家教育部回国人员科研启动基金"
!"#"!%
#&鲁东大学博士启动基金&山东省自然科学基金
"
23!"#%45"#1
#
作者简介$王
!
蕾"
#11&
#!女!在读硕士研究生!主要从事植物次生代谢的分子机制研究
6(78.9
$
/:;<=8
!
#,%+>?7
"
通信作者$张
!
娟!博士!副教授!主要从事植物次生代谢的分子机制研究
6(78.9
$
-
@80AB*)
!
#,%+>?7
大豆
123$45%
基因的克隆及功能验证
王
!
蕾#!张
!
娟!"!魏丽娟#!刘林德#
"
#
鲁东大学 生命科学学院!山东烟台
!,)"!$
&
!
鲁东大学 农学院!山东烟台
!,)"!$
#
摘
!
要$以大豆品种(黑农
%$
号)为材料!利用同源克隆方法获得了一个依赖于
C;
"
"
#和
!(
酮戊二酸的双加氧酶基
因!命名为
!"#,$%#
荧光定量
D43
分析显示
!"#,$%#
在大豆根中的表达量最高!其次是荚果*叶和茎&
!
!
)(E
处理对大豆
!"#,$%#
的转录水平影响很小!水杨酸和激动素的处理均显著提高了
!"#,$%#
基因的表达!但随着
处理时间的延长表达水平稳定下降!最后接近处理前的水平带有组氨酸标签的
F7C,GH#
异源表达的蛋白纯化
后!以阿魏酰辅酶
I
为底物研究了其酶活特性!利用
HDJ4
分析检测到
F7C,GH#
能够催化阿魏酰辅酶
I
生成东
莨菪素采用农杆菌介导法将该基因转入拟南芥
&
(
,$)#
突变体!转基因拟南芥与
&
(
,$)#
突变体植株外在表型
没有明显的差异!而香豆素的含量分析显示!转基因株系根中香豆素的含量较拟南芥
&
(
,$)#
突变体有所提高!与
野生型拟南芥中香豆素的含量接近
关键词$
C;
"
"
#和
!(
酮戊二酸依赖的双加氧酶&香豆素&
F7C,GH#
中图分类号$
K*1$
&
K*1
文献标志码$
I
&"()*+,-".#.
/
+.!0*.)1#".+-2+,+)1(,#3+1#"."4123$45%#.5"
6
7(+.
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F7C,GH#=8/8Z9;:?>8:89
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F7C,GH#=;U;:U80/(
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4
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6
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C;
"
"
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S
9@:8U8:;(Q;
Y
;0Q;0:Q.?X
VS
;08/;
&
>?@78U.0/
&
F7C,GH#
!!
香豆素是一类广泛存在于高等植物中的次生代
谢产物!特别是在伞形科*芸香科*豆科*菊科*瑞香
科和木犀科中含量较高+#(!,在化学结构上!香豆素
类化合物是一种具有苯丙
#
(
吡喃酮核的顺式邻羟
基肉桂酸内酯最近大量的科学研究显示!香豆素
及其衍生物在农业*工业*医药业发挥着重要作
用+%($,在真菌或者微生物侵染的植物中香豆素会
大量积累!这表明香豆素可能与植物抗逆的防御性
反应存在着联系+),&许多传统中草药!如前胡*蛇床
子*祖师麻*花椒*秦皮*枳实等!其活性成分就是香
豆素及其衍生物+,(1,!它们在消炎*抗菌*抑制血栓形
成*抗凝血剂*抗肿瘤*抑制中枢神经系统和降低血
压等方面临床疗效显著+(#",&在工业方面!香豆素因
其特殊味道被用于制造香水*香皂和调味剂+##,
香豆素在工业*农业和医药业的重要性使得越
来越多的研究聚焦于香豆素的合成和提取!但由于
工业合成的复杂性和高成本!香豆素在植物中的合
成开始受到人们的关注香豆素结构种类繁多!植
物体内许多酶参与了其合成!其生物合成途径是植
物苯丙氨酸代谢途径的一个分支!其中阿魏酰辅酶
I,G
位的羟基化至关重要最近的研究发现!一些
细胞色素单加氧酶
D)$"
是呋喃香豆素生物合成的
关键酶!其作用机理是催化伞形花内酯
,
位或者
1
位异戊烯化后的羟基化+#!(#),在拟南芥香豆素生物
合成途径中!对香豆酸
(%G(
羟化酶催化对
(
香豆酰
(
4?I%G
位羟基化!进而生成咖啡酰辅酶
I
&接着咖啡
酰辅酶
I
氧甲基转移酶通过修饰
%G
位置上氧甲基
化产生阿魏酰辅酶
I
!然后一个依赖于
C;
"
"
#和
!(
酮戊二酸的双加氧酶催化阿魏酰辅酶
I,G
位的羟
基化!因此该酶被命名为
#,$%
&上述反应产物
,(
羟
基阿魏酰辅酶
I
最终通过顺式%反式异构化和内酯
化生成香豆素+#$,
本研究从大豆中克隆了
#
个拟南芥
&#,$%#
基因的同源基因!通过酶学特性分析其催化活性!并
分析在拟南芥
&
(
,$)#
突变体中过量表达对植株中
香豆素的含量的影响探讨不同植物中
#,$%
同源
基因可能存在的作用或调控机制
#
!
材料和方法
%+%
!
植物材料和生长条件
大豆(黑农
%$
号)种子
!"#!
年
$
月初播种于盆
中!置于光照培养箱"
!1^#
#
_
!
#,B
光照"
$
$
""
$
!#
$
""
#!
1B
暗培养!在结荚期分别取同一植株的
根*茎*叶和荚果液氮速冻后存于
&1"_
待用
拟南芥"
4?9"
*突变体和转基因#种子常规表面
消毒后播种于
5R
固体培养基上!
)_
处理
!
$
%Q
后置于光照培养箱培养+"
!#^ #
#
_
!湿度为
*$`
!
光照时间同上所述,幼苗约高为
#
$
!>7
时!在无
菌条件下分别移植于终浓度为
#""
%
7?9
%
J!
!
)(E
*
水杨酸和激动素的
5R
固体培养基中!然后依次在
处理
"B
*
#!B
*
!)B
*
)1B
时分别取地上部分和根部
材料!液氮速冻
%+<
!
方
!
法
%=<=%
!
大豆
123$45%
基因克隆及其
>5?
序列分
析
!
在大豆基因组数据库"
B::
Y
$%%
===+0>Z.+097+
0.B+
S
?T
%#中找到一个拟南芥
&#,$%#
"
I:%
S
#%,#"
#
和
&#,$%!
"
I:#
S
$$!"
#
+
#$
,的同源序列!根据该序列
信息!在开放阅读框两端分别设计
!"#,$%#
正向引
物
F7C,GH#(C
"
8:
S
:>::>>8>:>>>8>>88:>:>
#和反向引物
F7C,GH#(3
"
:>8:8:>8:
SS
>888::>88:8
S
#
取大豆新鲜叶片约
#
S
!提取总
3MI
大豆总
3MI
提取采用
K.8
S
;0
公司的
3M;8/
V
D980:5.0.
a.:
试剂盒"
K.8
S
;0
!
48:+M?+*)"%
#!具体操作步骤
参照说明书进行
>EMI
第一链合成采用宝生物公
司
DU.7;R>U.
Y
:3[U;8
S
;0:a.:=.:B
S
EMI6U8/;U
"宝生物!
E33")*R
#试剂盒并参考其使用说明进行
操作!以合成的第一链
>EMI
为模板!以
F7C,GH#(
C
和
F7C,GH#(3
为引物!利用普洛麦格公司的
F?9.
:
&
EMI
聚合酶"普洛麦格!
5%""$
#进行
D43
扩增扩增所得
D43
产物与
Y
F5([
载体"天根公
司!
b[%"!
#连接后导入大肠杆菌
EH$
#
!鉴定正确
后送公司测序"华大公司#序列的比对和同源比较
利用
b;>:?UM[O
软件"
O0T.:U?
S
;0
#进行分析
%=<=<
!
实时荧光定量
@-A
分析
!
分别提取液氮速
冻收集的大豆各种材料总
3MI
!
EM8/;O
处理以消
除基因组
EMI
污染第一链
>EMI
合成见
#+!+#

实时荧光定量
D43
分析采用天根公司
RW]3(
FU;;0@/.0
S
3;8958/:;U5.X
"
RW]3FU;;0
#试剂盒
"
[OIMF6M
!
4B.08
!
CD!"!
#反应条件为
)_
预
变性
!7.0
&
)_
变性
#$/
!
$1_
退火
#$/
!
,1_
延
伸
)"/
&
%$
个循环通过比较循环阈值法进行初始
转录物浓度估算+#,,!大豆
PZ.
c
@.:.0
基因"
E!1#!%
#
作为内标实时荧光定量
D43
所用的引物如下$大
豆
PZ.
c
@.:.0
"
E!1#!%
#利用
PZ.
c
@.:.0(C
"
:>:
S
8>8>(
>8::
S
8>88:
S
:
S
#和
PZ.
c
@.:.0(3
"
>::>:
SS
8:
S
::
S
:8
S
:(
>8
S
>
#&大豆
!"#,$%#
利用
F7C,GH#(C
和
F7C,G
H#(3

%+<+B
!
原核表达载体的构建和重组蛋白的诱导表
达
!
利用带有特殊限制性酶切位点的引物
F7C,G
H#(;."H

C
"
88
SS
8:>>8:
S
:>::>>8>:>>>8>>88:>
#和
F7C,GH#(<),

3
"
88>:>
S
8
S
:>8:8:>8:
SS
>888::>88:(
8
S
#扩增
!"#,$%#
基因编码区用
;."H

*
<),

对
!"#,$%#
基因
D43
产物和表达载体
Y
6[%!8
分别进行双酶切!琼脂糖凝胶电泳回收酶切片段
利用
[
)
EMI
连接酶连接后转化大肠杆菌
EH$
#
感
受态细胞!挑取阳性克隆进行菌落
D43
和酶切鉴
)#!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
定!鉴定正确的质粒送华大基因公司测序!确保重组
表达载体的正确性!最终获得正确的重组表达载体
Y
6[%!8(!"#,$%#

利用
4849
!
化学转化法!将
Y
6[%!8(!"#,$%#
质粒转入大肠杆菌
9+.75]J!#
"
E6%
#感受态细胞
利用菌落
D43
对阳性克隆进行鉴定!鉴定正确的单
菌落进一步诱导蛋白表达带有
Y
6[%!8(!"#,$%#
质粒的大肠杆菌
]J!#
单菌落接种于含有
#""0
S
%
7J
氨苄青霉素
J]
液体培养基中!
%*_
过夜培养
然后将过夜培养的菌液以
#d#""
的比例接种于
$"
7J
含有
#""0
S
%
7J
氨苄青霉素的
J]
液体培养基
中!培养至
eE
,""
达
"+%
左右此时将培养液转入
!"_
摇床中培养
#B
后加入终浓度为
"+$77?9
%
J
OD[F
!继续培养
#,B
将培养完成的菌液
)"""
S
*
)_
离心
#"7.0
收集菌体细胞!然后用冰冷的裂解
缓冲液+
$"77?9
%
J[U./(49
!
Y
H1+"
!
"+!$77?9
%
J
M849
!
# 77?9
%
J E[[
!
# 77?9
%
J 6E[I
!
"+!$
77?9
%
JD5RC
"使用前加入#,重悬!超声波破碎
后!
)_
离心
#"7.0
!上清上样于
M.(I
S
8U?/;H./
标签蛋白纯化试剂盒"康为世纪!
4L"1)
#层析柱!
冲洗
%
遍后!用溶解缓冲液洗脱目标蛋白纯化的
蛋白质的浓度利用生工生物公司的
5?Q.<.;Q]U8Q(
V
a.:
"生工生物!
Ra%")#
#试剂盒
进行测定!取少量蛋白质用于聚丙酰胺凝胶电泳检
测!纯化的目的蛋白立即用于酶活性鉴定
%=<=C
!
DE0$FG%
的酶活性分析
!
F7C,GH#
的酶
活性分析参照
a8.
等+#$,的文献
#""
%
J
酶反应体
系中包含
#+!
%
S
蛋白!
#""77?9
%
J[U./
%
H49
!
Y
H
,+$
!
#+" 7
S
%
7J ]RI
!
"+$ 77?9
%
J C;Re
)
!
$
77?9
%
J!(
酮戊二酸钠!
$77?9
%
J
抗坏血酸钠!
#
77?9
%
J
阿魏酰辅酶
I
!
%"_
反应
#7.0
反应完
成后!加入
!"
%
J%7?9
%
JM8eH
放置于
%*_#"
7.0
以终止反应!然后加入
!"
%
J
醋酸反应混合
物
#$"""
S
离心
#"7.0
!上清进行高效液相色谱
"
HDJ4
#分析
HDJ4
分析的条件为
4
#1
柱!流动相
为
!$`
"体积比#的甲醇"含有
"+#`
的甲酸#!流速
为每分钟
#+"7J
!温度为
)"_
!检测波长为
%)1
07
酶的活性鉴定所用的试剂均购自上海生工生
物工程股份有限公司!阿魏酰辅酶
I
来自于余晓丹
博士的馈赠
%+<+H
!
植物转化载体的构建
!
拟南芥
&
(
,$)#
的
突变体"
RIJa
-
#!%1
#购置于美国
R89研究所基因
组分析实验室"
eB.?R:8:;P0.T;U/.:
V
!
4?9@7Z@/
!
eH
!
PRI
#依据
[(EMI
插入鉴定的原理"
B::
Y
$%%
/.
S
(
089+/89\+;Q@
%
:Q08
Y
U.7;U/+!+B:79
#!在线设计
%
条引
物
J]Z#+%
"
I[[[[F44FI[[[4FFII4
#*
JD
"
FF[(
4FFFI[[4[II[4[4IF4
#和
3D
"
IFIIFI[FF(
[FIFFIFF4[[4
#以筛选鉴定突变体纯合系
载体
Y
#%""(%$R(!"#,$%#
用于在拟南芥突变
体
&
(
,$)#
中过量表达
F7C,GH#
利用
D43
从已
测序正确的
[(!"#,$%#
扩增
!"#,$%#
编码区!
扩增引物带有特异的限制性酶切位点
;."H

和
=.6

!
D43
片段分别用
;."H

和
=.6

双酶切
后!与经过同样双酶切的质粒
Y
487Z.8#%""
进行连
接!连接产物转化大肠杆菌
EH$
#
!阳性克隆进行菌
落
D43
和酶切鉴定鉴定正确的质粒利用电转化
的方法转入农杆菌
Fb%#"#
以备植物转化侵染
%+<+$
!
植物转化
!
拟南芥转化方法参照
];0:
+
#*
,的
方法拟南芥
&
(
,$)#
突变体种子
)_
春化
!
$
%Q
后播种于用
]$
营养液浸泡过的含有蛭石的种植
盆!随后于
!%_
培养待植物开花后!剪去其主枝
顶端!促侧枝发展在剪枝后的
)
$
,Q
内!进行农
杆菌转化将植株倒置于含
Y
#%""(%$R(!"#,$%#
质粒的农杆菌转化缓冲液的玻璃瓶中!维持
%"/
!取
出种植盆!在暗处保湿侧放
!)B
!然后将种植盆直
立!按正常的方法培育植株至结实!收获成熟种子
转基因植株的纯合系筛选参照文献+
#1
,进行!
转基因植株
EMI
提取采用
4[I]
法+#1,
D43
鉴
定时分别利用潮霉素和
!"#,$%#
的特异引物检
测!反应体系为
EMI
模板
#
%
J
!
#"fD43
缓冲液
!
%
J
!
+$77?9
%
JQM[D"+)
%
J
!
#"
%
7?9
%
J
的正反
向引物各
#
%
J
!
U9.
:
#P
!
QQH
!
e
补齐到
!"
%
J
反
应条件为
)_
预变性
%7.0
!
)_
变性
%"/
!
$$_
退火
%"/
&
*!_
延伸
#+$7.0
&
%$
个循环后!
*!_
总
延伸
#"7.0

%+<+I
!
香豆素的定量分析
!
拟南芥植株中香豆素
含量的测定方法见文献+#,!植物材料液氮研磨后悬
浮在冰冷的甲醇中
!!B
!甲醇溶液中含有
)(
羟甲香
豆素作为内标提取液
#$"""
S
离心
#"7.0
!上清
用于
HDJ4
分析!分析条件见
#+!+)

!
!
结果与分析
<=%
!
大豆
123$45%
的克隆
用拟南芥
&#,$%#
"
I:%
S
#%,#"
#和
I:C,GH!
"
I:#
S
$$!"
#
+
$
!
#$
,的基因序列
]JIR[
搜索大豆的
6R[
据库"
F;0;O0Q;X
#!检测到一个
6R[
片段
"
[4))"#1!
#与拟南芥
&#,$%#
和
&#,$%!
一致
性高达
,"`
!没有发现其它一致性更高的
6R[
序
$#!
!
期
!!!!!!!!!!!!!!
王
!
蕾!等$大豆
!"#,$%#
基因的克隆及功能验证
列序列分析显示
[4))"#1!
具有完整的开放阅读
框!把 该基因命名为
!"#,$%#
利 用该 序 列
]JIR[
搜索大豆基因组文库"
M4]O
!
B::
Y
$%%
===+
0>Z.+097+0.B+
S
?T
%#!在染色体
#1
和
1
上均发现了
!"#,$%#
基因片段!这表明
!"#,$%#
基因具有
!
个基因拷贝!由于大豆是四倍体的双子叶植物!因此
一个基因在基因组中很可能存在着多个拷贝基因
组序列和
>EMI
序列比对发现!
!"#,$%#
和
&#,$%#
以及
&#,$%!
具有相同的内含子结构
氨基酸序列比对显示"图
#
#!
F7C,GH#
和
I:C,GH#
以及
I:C,GH!
分别具有
$)`
和
$%`
一致性根据
得到的序列信息设计特异引物!利用
3[(D43
扩增
!"#,$%#
全长
>EMI
序列!
D43
扩增片段!连接
Y
F65([
载体后转化大肠杆菌!阳性克隆鉴定正确
后送 公 司 测 序该 基 因 序 列 已 经 上 传
M4]O
"
aN),%%"
#多次测序结果显示!该基因与
M4]O
基因组文库中的相应序列有一个氨基酸的差异!这
有可能是基因来源的大豆品种不同造成的
大豆
F7C,GH#
氨基酸序列分析显示!该蛋白
具有一个
!eF(C;
"
"
#氧化酶超级家族的保守区
域在其
M(
末端有一个非血红素双脱氧酶区域!该
区域也是依赖于
!(
酮戊二酸和
C;
"
"
#双氧化酶活
性的蛋白保守区段该蛋白还具有一个
!eFE
超
级家族保守的
C;
"
"
#结合区域
H
!!$
(g(E
!!*
(g0(
H
!1%
!
I:C,GH#
也有该区域另外!在
F7C,GH#
中
还发现了一个结合
4$
羧基基团的保守区域"
3
!%
(
g(R
!$
#利用
R=.//(5?Q;9
工作站!根据推断的氨
基酸序列!预测了
F7C,GH#
*
I:C,GH#
和
I:C,GH!
蛋白的三级结构!这
%
个蛋白具有非常相似的三级
结构+!",!这也暗示了
F7C,GH#
可能和
I:C,GH#
以
图
#
!
大豆与拟南芥
C,GH
氨基酸序列同源性分析
C.
S
+#
!
I7.0?8>.Q89.
S
07;0:?I:C,GH#80QI:C,GH!4
515
及
I:C,GH!
具有相同的酶学特性!
F7C,GH#
可能
是大豆香豆素合成途径中的关键酶
<=<
!
123$45%
的转录表达模式分析
以大豆
>-1
:
2117
基因为内参!利用实时定量
D43
研究了
!"#,$%#
在各个组织器官中的表达
模式!结果"图
!
#表明!
!"#,$%#
在大豆的根中表
达量最高!这暗示着大豆根中的香豆素含量最高
对拟南芥的研究也发现!香豆素类物质东莨菪素及
其吡喃葡萄糖苷东莨菪苷在野生型的根中含量最
高!是地上部分的
#1"
倍!这间接印证了香豆素类物
质东莨菪素及其衍生物主要在植物的根系中发挥重
要作用!可能与植物的抗逆反应机制有一定的关系!
相关的研究也发现!真菌和微生物侵染的植物根系
会有香豆素类物质的大量积累+!#(!!,在大豆的其它
组织器官中!
"#,$%#
基因的表达量也相对较高!
而在拟南芥中
&#,$%#
和
&#,$%!
主要在根部表
达!在地上部分的表达量极低!几乎检测不到!但是
!
!
)(E
的处理能够诱导
&#,$%!
在地上部分的表
达这暗示着不同植物
C,GH
的作用和调控机制存
在差异!它们可能有不同的底物特异性!这需要进一
步的研究进行印证
同时!本实验研究了不同处理对大豆
!"#,$
%#
转录表达水平的影响分别用
!
!
)(E
*水杨酸和
激动素处理了播种
#"Q
左右的大豆幼苗!取材时间
为处理
"
*
#!
*
!)
和
)1B
取材时分地上部分和根
部!液氮速冻然后分别提取各部分*各时间段材料
的总
3MI
!反转录成
>EMI
进行实时荧光定量
D43
反应结果显示!!
)(E
的处理对大豆
!"#,$
%#
的表达影响很小但是水杨酸和激动素的处理
均显著提高了该基因的表达水平!然而随着处理时
间的延长!
"#,$%#
的转录表达水平稳定下降!最
后接近处理前的水平"图
%
#这暗示了
!"#,$%#
基因在大豆生物抗逆中发挥着重要的作用!同时也
图
!
!
大豆不同器官中
!"#,$%#D43
分析
C.
S
+!
!
6X
Y
U;//.?0
Y
8::;U0??U
S
80/?V
Z;80U;T;89;QZ
V
U;89(:.7;D43
,#!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
说明了植物对逆境的适应性!当逆境胁迫达到一定
时间后!植物会通过调控自身基因的表达来适应逆
境!继续保持稳定的生长
<=B
!
DE0$FG%
酶活性鉴定
带有组氨酸标签的
F7C,GH#
在大肠杆菌中表
达后!利用
M.(M[I
琼脂糖层析柱纯化重组蛋白!
F7C,GH#
在大肠杆菌中诱导表达和纯化的蛋白见
图
)
然后通过测定该蛋白是否能够催化底物的邻
位羟基化来验证其酶学特性以不加蛋白的反应混
合物为阴性对照!当以阿魏酰辅酶
I
为底物时!一
个邻位羟基化的产物通过经反式%顺式异构化和内
酯化的自发过程生成了东莨菪素
HDJ4
检测到一
个产物的吸收峰!该吸收峰的紫外吸收光谱与东莨
图
%
!
水杨酸"
I
#和激动素"
]
#处理后地上部和
根中
!"#,$%#
表达
C.
S
+%
!
6X
Y
U;//.?0
Y
8::;U0?:U;8:7;0:/?<89.>
V
9.>8>.Q
"
I
#
80Q\.0;:.0
"
]
#
图
)
!
F7C,GH#
蛋白表达和纯化的
RER(DIF6
检测
5+
蛋白
58U\;U
&
#+
加
OD[F
诱导的含
Y
6[%!8
空载体的
[U80/
]J!#
"
E6%
#菌株&
!+
加
OD[F
诱导的含
Y
6[%!8(!"#,$%#
质粒的
[U80/]J!#
"
E6%
#菌株&
)+
层析柱纯化过的目的蛋白
C.
S
+)
!
RER(DIF68089
V
/./?<:B;;X
Y
U;//.?0?5+DU?:;.078U\;U/
&
#+O0Q@>;Q>;9>?0:8.0.0
SY
6[%!8
&
!+O0Q@>;Q>;9>?0:8.0.0
SY
6[%!8(!"#,$%#
&
%+D@U.<.;Q
Y
U?:;.0
菪素相似"图
$
#这些结果表明!大豆
F7C,GH#
能
够催化阿魏酰辅酶
I
邻位的羟基化!属于依赖于
C;
"
"
#和
!(
酮戊二酸依赖的双加氧酶
<=C
!
DE0$FG%
参与植物香豆素合成的功能分析
为了更好地理解
F7C,GH#
的功能!在拟南芥
&
(
,$)#
突变体中过量表达了大豆的
F7C,GH#
!以
便观察该蛋白是否能把拟南芥的突变体恢复成野生
型在
%$R
启动子下的
!"#,$%#
通过农杆菌转化
的方法转入拟南芥
&
(
,$)#
突变体植株共获得
$
个独立的
3[(D43
验证正确的转基因系!转基因拟
南芥与
&
(
,$)#
突变体植株外在表型没有观察到明
显的差异"图
,
#依据文献+#,提供的方法测定转基
因植株根系的香豆素含量!同时提取拟南芥野生型
和拟南芥
&
(
,$)#
突变体根系香豆素作为对照
HDJ4
分析结果"图
*
#显示!
F7C,GH#
过量表达的
转基因株系根中香豆素的含量相比较拟南芥突变体
本身有所提高!与野生型拟南芥中香豆素含量接近
这表明
F7C,GH#
与
I:C,GH#
有相似功能!均在香
豆素生物合成的过程中发挥着关键作用拟南芥野
生型和突变体含量比较与已发表的结论相似+#$,
图
$
!
大豆
F7C,GH#
酶活性鉴定的
HDJ4
分析
I+
不加蛋白的阴性对照&
]+
加
F7C,GH#
纯化蛋白&
4+
东良菪素"标准样品#
C.
S
+$
!
HDJ4
Y
U?<.9;/?<;X:U8>:/Q.<<;U;0:U;8>:.?0/
V
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I+L.:B?@:
Y
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&
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Y
U?:;.0
&
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Y
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"
/:80Q8UQ/87
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9;
#
*#!
!
期
!!!!!!!!!!!!!!
王
!
蕾!等$大豆
!"#,$%#
基因的克隆及功能验证
图
,
!
拟南芥突变体与转基因株系表型
I+&
(
,$)#
突变体&
]+F7C,GH#
转基因株系&
4+
野生型
C.
S
+,
!
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Y
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VY
;>?7
Y
8U./?087?0
S
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4
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&
(
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!
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S
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Y
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;
I+&+.-13,
4
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(
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&
]+[80
S
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Y
980:?&
4+L.9Q:
VY
;
图
*
!
各材料根系中香豆素的含量比较
L[+
野生型拟南芥&
I:<,GB#+
拟南芥
&
(
,$)#
突变体&
F7C,GH#(I:<,GB#+F7C,GH#
转基因株系
C.
S
+*
!
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980:/
L[U;
Y
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VY
;
&
I:<,GB#U;
Y
U;/;0:/7@:80:
Y
980:
&
F7C,GH#(I:<,GB#./:B;:U80/
S
;0.>
Y
980:?%
!
讨
!
论
尽管目前很多研究显示香豆素及其衍生物在植
物对病原菌的抗逆过程中发挥着重要作用!但是其
机制并不清楚!很多植物香豆素合成的关键酶尚未
知晓!而香豆素本身的医疗作用已经使人们越来越
关注它为了更深入地理解香豆素在植物中的作
用!本研究获得了
#
个大豆的香豆素合成关键基因
!"#,$%#
!并通过一系列的实验研究了其酶学生化
特性!同时利用基因的表达模式分析和互补实验探
索了其在植物中的生物学功能
在过去的几十年里!大豆的营养价值越来越受
到人们的关注!其次生代谢的研究已经非常深入!然
而在大豆植物化学物质中!异黄酮是目前讨论最多
的.健康促进因子/!而香豆素却并没有引起足够的
重视由于香豆素在植物抗逆反应中也发挥着一定
的作用!因此探索植物香豆素合成的关键酶显得至
关重要同异黄酮相似!香豆素也是一组苯酚类次
生代谢物!并且其生物合成途径也是苯丙氨酸代谢
途径的一个分支苯丙氨酸生物合成途径起始于
J(
苯丙氨酸!该氨基酸经苯丙氨酸解氨酶*肉桂酸
(
)(
羟化酶*
)(
香豆酸$辅酶
I
连接酶*香豆酸
(%G(
羟化
酶*咖啡酰辅酶
I
氧甲基转移酶被催化生成阿魏酰
辅酶
I
接着阿魏酰辅酶
I
经过邻位的羟基化!以
及反式%顺式异构化和内酯化的过程!最终生成香豆
素类物质东良菪素!其中后两步的过程是自发的!不
需要酶的催化!因此邻位羟基化是植物中香豆素合
成的关键步骤+#$,目前仅在拟南芥中报道发现了
一个催化邻位羟基化的香豆素生物合成关键酶
I:C,GH#
该酶是一个依赖于
C;
"
"
#和
!(
酮戊二
酸的双加氧酶!能够催化阿魏酰辅酶
I
的
,G
位羟基
化生成东良菪素+#$,在大豆中!利用同源克隆的方
法获得了
#
个拟南芥的同源基因
!"#,$%#
氨基
酸序列比对的分析结果显示!该酶与拟南芥
I:C,G
H#
*
I:C,GH!
的一致性很高分别利用
F7C,G
H#
*
I:C,GH#
和
I:C,GH!
氨基酸序列进行了三维
结构预测!结果表明!
F7C,GH#
和拟南芥
I:C,G
H#
*
I:C,GH!
具有相似的空间结构和作用位点
而且
F7C,GH#
的酶学特性分析也显示!该蛋白能
够以阿魏酰辅酶
I
为底物催化其
,G
位羟基化生成
东良菪素!这表明大豆
F7C,GH#
也是香豆素生物
合成关键酶与此同时!在拟南芥
&
(
,$)#
突变体
中过量表达
F7C,GH#
明显提高了转基因植株根系
中的香豆素含量!与拟南芥野生型根中的香豆素含
量接近!进一步印证了大豆
F7C,GH#
的功能将
来!利用过量表达和
3MI
抑制的方法!在大豆中研
究
F7C,GH#
的功能可能会更深入地揭示其更多的
生物功能
基因表达模式的分析结果显示!与拟南芥
&#,$%#
相比!
!"#,$%#
存在着独特的转录表达
模式
!"#,$%#
在大豆的根*茎*叶*荚果中均有
表达!而拟南芥
&#,$%#
主要在根中表达!在地上
部分其表达量极低!这说明大豆中香豆素在根和地
上部分都发挥着重要作用!或者是
F7C,GH#
在地
上部分以其他物质为底物催化化合物生成在根
中!香豆素可能和异黄酮一样!作为一种植物根系分
泌的一种信号物质!吸引相应的微生物与根系形成
共生关系!促进植物的营养吸收!或者作为一种化学
物质抑制微生物在根系的生长!相关研究也发现香
豆素类化合物不仅能够触杀一些农业害虫+!%,!而且
对一些植物病原真菌有显著的抑制作用+!),在地
上部分!香豆素可能以其特殊的味道增强了植物的
1#!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
抗菌*抗虫性!而且有研究也发现香豆素能够抵抗紫
外线的照射!并且紫外线照射能够提高香豆素的抑
菌性+),当用抗逆信号分子水杨酸和激动素处理大
豆的幼苗时!
!"#,$%#
在地上部分和根中都被强
烈地诱导表达!而
!
!
)(E
对该基因的表达没有明显
的作用!这表明
F7C,GH#
在大豆正常生长和抗逆
过程中可能都发挥着重要作用!由于大豆本身的香
豆素种类就很繁杂!因此与拟南芥
I:C,GH#
相比!
大豆
F7C,GH#
可能有更广的底物范围!也可能是
不同植物中的香豆素合成酶存在不同的调控机制
由于目前报道的以辅酶
I
为底物的双加氧酶并不
多见!因此对大豆
F7C,GH#
的反应机制和底物特
异性进行进一步的深入探讨将会为今后的研究提供
更多的借鉴
参考文献!
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!
孔令义
+
香豆素化学+
5
,
+
北京$化学工业出版社!
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#&#"+
+
!
,
!
周荣汉!段金廒
+
植物化学分类学+
5
,
+
上海$上海科学技术出版社!
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