全 文 ：书西北植物学报!
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!!
文章编号$
#"""()"!*
"
!"#$
#
"%(#&#&("&
收稿日期$
!"#!("%(!"
%修改稿收到日期$
!"#$("&(!+
基金项目$国家自然科学基金"
$"*&"#$&
#%河南省基础与前沿技术研究计划项目"
%!$"")#"!))
#
作者简介$袁红雨"
#%,$
#!男!博士!教授!主要从事植物分子遗传学研究&
-(./01
$
2
3/4564
72
3#%%!
!2
/566896.
茶树
121%3!
基因克隆和转录活性分析
袁红雨#!朱小佩#!曾
!
威#!杨会敏!!孙
!
楠#!谢素霞#!程
!
琳#
"
#
信阳师范学院 生命科学学院!河南信阳
),)"""
%
!
红河学院 生命科学与技术学院!云南蒙自
,,##""
#
摘
!
要$采用
:;<-
技术克隆了一个受冷诱导的茶树
!"#
基因全长
9=>;
!命名为
!$!"##
"
?@4A/4B
登录号为
-C*,$!$+
#&
!$!"##9=>;
全长序列为
#!##D
E
!开放阅读框编码
!*%
个氨基酸&氨基酸序列分析表明!
具有
家族典型的保守结构域!与其他植物的
具有较高的相似性%与拟南芥辣椒和橡胶树编码的
相
似性分别为
*,H

,$H
和
*,H
&亚细胞定位结果表明!
位于细胞核内&分别将
#"
个
缺失突变体
与
?;I)=>;
结合域融合的结果显示!
的羧基末端酸性结构域"第
#$&
位氨基酸至
!*%
位氨基酸#在酵母
中具有转录激活活性&实时定量
:J(K<:
分析表明!
$!"##
基因受低温的快速诱导表达&
关键词$茶树%
%表达分析%亚细胞定位
中图分类号$
L&+*
文献标志码$
;
"#$%&($)&)*+,&)#-,(
.
($)/-(0&($)/)&%
1
#(#$234
121%3!54)42,$61$4)**-$2-/)/2-2
MC;>N64
72
3
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E
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#
!
O->?Q@0
#
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M;>?N30.04
!
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RC>>/4
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PS-R3T0/
#
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7
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2
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7
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2
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<504/
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7
@6UI0U@R90@49@/4WJ@954616
72
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2
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7
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7
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7
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7
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#
D
2
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E
04
1@4
7
Y5
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E
@4V@/W04
7
UV/.@@496W04
7
!*%/.046/90WF8;.046/90WF@
]
3@49@/10
7
4.@4Y
F56\@WY5/Y2E
09/1964F@VX@W.6Y0UF6U2
8E
V6Y@04\/FX@V
2
F0.01/V
04/.046/90WF@
]
3@49@Y6E
1/4YF
E
@90@F
!
/4WF56\04
7
*,H
!
,$H/4W*,H/.046/90WF@(
]
3@49@0W@4Y0Y
2
Y60
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$)34&%**44&
!
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V@F
E
@9Y0X@(
1
2
8R3D9@131/V169/Y064/FF/
2
04W09/Y@WY5/YE
V6Y@04\/F169/Y@W044391@3F8Q5@4Y@4
W@1@Y064.3Y/4YF6U2
@/FY?;I)=>;(D04W04
7
W6./04
!
0YF9/VD6T
2
1(Y@V(
.04/1/90W09V@
7
064
"
UV6.#$&
Y5
/.046/90WY6!*%
Y5
/.046/90W
#
9631W/9Y0X/Y@Y5@YV/4F9V0
E
Y06404
2
@/FY8
L3/4Y0Y/Y0X@V@/1(Y0.@:J(K<:/4/1
2
F0FV@X@/1@WY5/Y!$!"##\/F04W39@W
]
309B1
2
D
2
16\Y@.
E
@V/Y3V@8
84
1
9$,*#
$
!%&(()%$)**$)$
%
%
@T
E
V@FF064/4/1
2
F0F
%
F3D9@131/V169/10[/Y064
!!
低温胁迫严重影响着植物的生长发育&为了抵
御低温危害!植物在长期进化过程中形成了独特的
防御和适应机制&尤其对于温带植物来说!受到非
冰冻低温驯化后!其抗寒能力增强(#(!)&在拟南芥
中!
冷应答途径是植物低温应答反应中的一种
重要途径($)&拟南芥编码一个由

和
构成的转录因子小家族()(*)!这些转录因子与
冷诱导基因启动子中的
<:J
(
,(&
)
"
<(V@
E
@/Y
#*
=:-
"
W@5
2
WV/Y064(V@F
E
64F0X@@1@.@4Y
#元件特异地结合!
激活冷诱导基因的表达&在
!"#!
过表达的转基因
拟南芥中!有
!+H
的冷诱导基因在常温下上调表
达(+)&当
!"##

!"#!
和
!"#$
基因过量表达时!
转基因拟南芥不经过低温胁迫!其耐寒性也会显著
增强(%(##)!而降低
!"##
和
!"#$
的表达量后!即使
经过冷驯化!拟南芥的耐寒性仍然降低了约
!*H
"
*"H
(
#!(#$
)
&
越来越多的实验证明
冷应答途径在高等
植物中高度保守&除了拟南芥外!已经从
*)
个属的
植物中分离到了
!"#
基因!包括单子叶植物
!$
个
属!双子叶植物
$#
个属!其中
#$
个属为木本植
物(#))&拟南芥
!"#
基因在油菜中过量表达导致转
基因植株抗寒性增强(#*)!而水稻中的
!"#
同源基
因"
7$89:"#
#在拟南芥中过量表达导致植株的耐
寒旱及耐盐能力都增强(#,)&桃树中的
;
0
!"##
基因在转基因苹果中过量表达!导致苹果耐寒性增
强(#&)&从小麦拟南芥和柑橘的研究中发现
!"#
基因的表达水平似乎是影响植物抗寒能力的关键因
素!同时
调节子的数目也影响植物抗寒能
力(#))&与草本植物相比!木本植物中
!"#
基因的
表达调控更复杂&同一物种中一年生组织与多年生
组织中
!"#
的表达模式并不相同(#+)!植物休眠前
与休眠后!
"#
表达的时程也是不同的(#%)&
早春的低温冷害常常造成茶树春梢受害!严重
影响早春茶的生产&陈喧等(!")利用
9=>;(;GIK
以及
:;<-
技术从茶树中分离出
#
个
!"#
基因!
作者在研究茶树幼苗对低温的应答反应时用抑制消
减杂交技术从茶树叶片中分离到
#
个新的
!"#
基
因
9=>;
片段"
?@4A/4B
登录号为
G-%)!#""
#&本
实验根据该基因片段设计引物!以低温处理的茶树
幼叶
RZ;:J9=>;
文库为模板!采用
:;<-
技术
分离得到了这一
!"#
基因的全长
9=>;
!并分析了
该基因的亚细胞定位转录激活活性及其表达特性&
#
!
材料和方法
!8!
!
材
!
料
以
!
年生茶树"
!%&(()%$)**$)$I8
#栽培品种
+信阳群体种,营养钵扦插苗为实验材料&处理前!
将茶树幼苗先在温度为
!$^
"
!*^
光照强度为
#,"
#
.61
-
.
!
-
F
#和光照时间为
#!5
-
W
#条件
下生长
&W
&低温处理时!将光照培养箱的温度降至
)^
"
*^
!持续光照!光照强度保持不变&分别于
低温
)^
"
*^
处理
!

&

#)

!)
和
$,5
后取充分展
开的片叶!液氮中保存!用于实验分析&以不进行低
温处理的相同叶位叶片做对照&
!8:
!
方
!
法
!;:;!
!
121%3!
基因全长序列的克隆及测序
!
利
用
RZ;:J
JZ
:;<-9=>;
试剂盒构建
RZ;:J
9=>;
文库(!#)&根据已获得的茶树
!$!"##9=>;
片段设计特异性引物
?KR#
和
?KR!
"表
#
#&以
*_(
:;<-9=>;
文库为模板!利用
*_
通用引物和
?KR!
扩增该基因
9=>;
的
*_
末端&
K<:
程序为$
%)^!.04
!
%)^$"F
!
**^$"F
!
&!^#.04
!
$"
个循环&以
$_(:;<-9=>;
文库为模板!采用
$_
通
用引物和
?KR#
扩增该基因
9=>;
的
$_
末端&
K<:
程序为$
%)^!.04
!
%)^$"F
!
*!^$"F
!
&!^!
.04
!
$"
个循环&
K<:
产物凝胶电泳后用凝胶回收
试剂盒"
J/B/V/
公司#回收目的片段!与
E
Z=#+(J
载体连接并转化
=N*
$
&重组质粒鉴定后送上海联
众基因科技研究院测序&
!;:;:
!
121%3!
基因的表达特性分析
!
分别取
)
^
低温处理不同时段"
!

&

#)

!)
和
$,5
#的茶树
幼苗充分伸展的叶片!利用
J:S[61
试剂"
S4X0YV6
7
@4
公司#提取总
:>;
&利用反转录试剂盒"
G@V.@4Y/F
公司#反转录合成
9=>;
第一链&
以不同样品的
9=>;
为模板!利用
:@/1(J0.@
K<:
仪"
;ASK:SRZ&$""
#扩增内参基因
!
<14-4()*
和目标基因
!$!"##
&反应体系为$
#
#
I9=>;
!
#"
#
IRMA:?V@@4:@/1(J0.@K<:Z/FY@VZ0T
!每种
引物大约
*
E
.61
!加水至
!"
#
I
%每一反应设
$
个重
复&反应条件$
%*^#.04
!
%*^#*F
!
*$^#*F
!
&*^$".04
!共
)"
个循环&设定程序!使扩增结束
后
K<:
仪自动运行绘制融解曲线"
%*^#*F
!
,"^
#*F
!
%*^#*F
#以判断是否发生了特异性扩增&处
理组目的基因相对于对照组目的基因的表达倍数按
!

""
!;:;<
!
121%3!
的亚细胞定位
!
根据
!$!"##9=(
>; :`G
两端序列!设计
#
对含
=-%
%
酶切位点的
引物
和
"表
#
#&酶
切扩增产物!将
!$!"##
基因 的
:`G
序列与
E
AS#!#
载体中的
?GK
基因融合!转化
=N*
$
并鉴
定重组质粒&采用冻融法将重组质粒导入农杆菌
-N;#"*
&
K<:
鉴定含重组质粒的菌落&
无菌条件下!取洋葱内层鳞茎!切成若干个约
#
9.
! 小块!剥取表皮细胞!平铺到
#
*
!ZR
固体培养
基上!
+^
暗培养
!)5
&将含有重组质粒的农杆菌
菌株接种于
#"".IIA
液体培养基"含
*".
7
*
I
卡
那霉素#中%
!+^
!
!""V
*
.04
!摇床培养至
=`
,""
为
"8*
"
"8+
!
)"""V
*
.04
离心
#".04
!用
#
*
!ZR
液
+#&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
$$
卷
体培养基"含
#"..61
*
IZ
7
<1
!
!
"
#
.61
*
I;F
#悬
浮沉淀&然后用悬浮菌液浸泡预培养的表皮细胞
$".04
!吸干表面菌液后!平铺到
#
*
!ZR
固体培养
基上&
#,5
光照*
+5
黑暗!
*^
培养
!W
&清洗共
培养后的洋葱表皮!置载玻片上!
)+"4.
波长下!荧
光显微镜观察&
!;:;=
!
121%3!
缺失突变子的构建及其在酵母细
胞中转录激活活性分析
!
根据
; :`G
序列!设计引物"表
#
#!在
*_
端引物引入
:3/:
%
酶
切位点!在
$_
端引物引入
;$1
%
酶切位点!然后扩增
!$!"##
基因编码区的各种缺失片段$
#
"
&&+D
E
"
*
7
5Y#
引物#
#
"
!!!D
E
"
*
7
5Y!
引物#
#
"
)"+D
E
"
*
7
5Y$
引物#
!!"
"
)"+
D
E
"
*
7
5Y$
引物#
!!"
"
&&+
D
E
"
*
7
5Y#
引物#
)"%
"
&&+
D
E
"
*
7
5Y#
引物#
)"%
"
*!!
D
E
"
*
7
5Y&
引物#
)"%
"
*&$
D
E
"
*
7
5Y+
引物#
*#)
"
,,"
D
E
"
*
7
5Y%
引物#
*&)
"
&&+
D
E
"
*
7
5Y#
引物#
,)$
"
&&+D
E
"
*
7
5Y#
引物#&将
这些缺失片段与
E
?Aa&
载体中的
?;I)=>;
结
合结构域融合&采用
I0;9
酵母转化法转化
;N#"%
酵母感受态细胞&在缺少
JV
E

N0F
和
;W@
的
R=
培养基上
$"^
培养
$W
!筛选转化子&
表
!
!
本研究所用引物
J/D1@#
!
KV0.@VF3F@W04Y50FFY3W
2
引物名称
KV0.@V
引物序列
KV0.@VF@
]
3@49@
?KR# *_(
7
/9
7
/
7
9YYYY
7
YY
77
9YY9($_
?KR! *_(Y/99
7
/
7
99/Y/Y99Y9
7
/9($_
77
Y9Y/
7
//Y
77
/YY9
7
/
7
9//
7
///($_
77
Y9Y/
7
///YY
7
/
7
//
7
9Y99/
7
/
7
($_
777
//YY9/Y
77
/YY9
7
/
7
9//
7
///($_
777
//YY9
7
Y
7
Y/99
7
/
77
Y
7
Y
7
/
77
($_
777
//YY99Y
7
999
7
YY99
77
9YY9/YY($_
777
//YY9/9Y
7
///9Y
7
9
7
/9Y
7
/
7
($_
777
//YY9/9Y
7
///9Y
7
9
7
/9Y
7
/
7
($_
777
//YY9/Y
7
99
777
/YY
7
9YY
7
9//($_
7
5Y# *_(
77
9Y
7
9/
7
//YY
7
/
7
//
7
9Y99/
7
/
7
($_
7
5Y! *_(
77
9Y
7
9/
7
9/9Y
777
Y
7
99
7
/
7
Y9Y9($_
7
5Y$ *_(
77
9Y
7
9/
7
99Y99///99
7
/
7
Y9/
7
9($_
7
5Y& *_(
77
9Y
7
9/
7
9/9
7
Y9/99Y
77
//9/Y99Y($_
7
5Y+ *_(
77
9Y
7
9/
7
Y
7
9Y
7
YY
7
Y/
7
YY
7
9/
7
Y9
7
($_
7
5Y% *_(
77
9Y
7
9/
7
YY
7
9//
7
9//Y999
77
9/Y($_
!!
参照
M@/FYKV6Y6961FN/4WD66B
"
9164Y@95
#中
的方法!以邻硝基苯
&
(=(
半乳吡喃糖苷"
>`K?
#为
底物!对报告基因
1/9O
表达的
&
(
半乳糖苷酶活性进
行定量分析&
!
!
结果与分析
:;!
!
121%3!
基因的克隆
根据所得到的茶树
!"#9=>;
片段的序列设计
上游引物和下游引物&用下游引物和
RZ;:J9=>;
的
*_
通用引物扩增
9=>;
的
*_
末端%用上游引物和
$_
通用引物扩增
9=>;
的
$_
末端&
*_(:;<-
和
$_(
:;<-
分别得到长度约
)*"D
E
和
%$"D
E
的扩增产物
"图
#
#!测序结果表明它们分别是所克隆基因的
*_
端
和
$_
端&将上述序列拼接得到
#!##D
E
的全长
9=>;
序列&
:`G
搜索结果显示该序列含有一个完
整的
:`G
!编码
#
条由
!*%
个氨基酸残基组成的多
肽链!其蛋白质理论分子量为
!+8!B=
!等电点"
E
S
#
为
*8#*
&拼接
9=>;
的
*_(CJ:
和
$_(CJ:
的长度
分别为
#$+D
E
和
!,,D
E
&
:;:
!
121%3!
基因编码产物聚类分析
同源性比对表明
与拟南芥辣椒甘薯
和橡胶树的
序列一致性分别是
*,H

,$H

,#H
和
*,H
!但与茶树另一
!"#
基因"
?@4A/4B
登
录号为
;#编码产物的相似性仅为
))H
!因
此推定该基因为茶树
!"#
基因家族的一个新成员&
含有
家族的保守序列!包括
;K!
*
-:-AK=>;
结合域及其两侧的保守基序"图
!
#&在
蛋白中!
;K!
结构域上游的碱性保守基序
Kaa
*
:K;?:TaGT-J:NK
被认为是核定位信号!
图
#
!
!$!"##9=>;
扩增
Z8#*"D
E
1/WW@V
%
*_8!$!"##
基因的
*_(:;<-
产物%
$_8!$!"##
基因的
$_(:;<-
产物
G0
7
8#
!
;.
E
10U09/Y0646U!$!"##9=>;
Z8#*"D
E
1/WW@V
%
*_8*_(:;<-
E
V6W39Y6U!$!"##
%
$_8$_(:;<-
E
V6W39Y6U!$!"##
%#&#
%
期
!!!!!!!!!!!!!!
袁红雨!等$茶树
!$!"##
基因克隆和转录活性分析
而下游
=R;Q:
基序代表
;K!
结构域的
<
末端&
采用
=>;Z;>
软件和邻位法"
>b
#构建了包
含
!!
个来自
#!
种不同物种的
的进化树!图
$
显示这些植物的
根据它们的遗传相似性聚合
为
)
个主要类群&茶树的
!
个
转录因子遗传
距离较远!
与垂枝桦和粗柠檬的
聚类
在一起!另一个茶树
转录因子与油菜和拟南芥
的
聚类在一起&
:;<
!
121%3!
基因表达特性分析
实时荧光定量
:J(K<:
分析表明!
!$!"##
为
一冷应答基因&在正常生长条件下!
!$!"##
在叶
片中低水平表达&低温处理导致
!$!"##
转录本的
水平迅速升高!并在处理
!5
前后达到最大值&此
后!
$!"##
的表达水平开始下降!但在
!)5
内仍
保持了较高的转录本水平"图
)
#&
!$!"##
和拟南
芥的
!"#
基因均受低温的快速诱导!但
!$!"##
受
低温诱导表达的时间更为持久&
:;=
!
121%3!
细胞定位
!$!"##
含有一个
;K!
*
-:-AK
结构域和一段
保守的核定位信号"
KaaK;?:aaG:
#!因此!推测
该蛋白质定位在细胞核中&为了证实这一推测!将
融合蛋白在洋葱表皮细胞中瞬时表
达!结果表明在
)+"4.
波长的激发光下!
?GK
融合蛋白的绿色荧光特异性出现在细胞核中
"图
*
#!而对照组中
?GK
绿色荧光均一地分散在细
胞质中&说明
中含有细胞核定位序列!而
且该序列的活性不需要翻译后修饰&
:;>
!
?#?@A!
转录激活活性
具有一羧基末端酸性结构域!为了证
明该结构域具有转录激活作用!将
!$!"##
基因的
编码区插入到
E
?Aa&
表达载体的多克隆位点!与
?;I)
的
=>;
结合结构域融合后"图
,
#!导入到缺
失
>+?)
基因的
;N#"%
酵母细胞中&结果表明野
生型
与
?;I)=>;
结合结构域融合后能
图
!
!
不同物种
蛋白氨基酸序列比对
黑色表示在所有
*
种蛋白质氨基酸序列中都相同的氨基酸残基%灰色表示在
)
种蛋白质氨基酸序列中相同的氨基酸残基%
三角符号为
的特征序列%方框中为
;K!=>;
结合结构域%星号为保守的氨基酸残基%箭头表示可能的
<
末端酸性结构域&
辣椒"
;;L++)""
#%
SD8
甘薯"
;A:!$"*,
#%
ND8
橡胶树"
;;M)$!#$
#%
;Y8
拟南芥"
;Ac!&#$+
#
G0
7
8!
!
;.046/90W.31Y0
E
1@/10
7
4.@4Y6U7
FUV6.6Y5@V
E
1/4YF
;.046/90WF0W@4Y09/104/1U0X@
E
V6Y@04F/V@F5/W@WD1/9B
!
\501@/.046/90WV@F0W3@FY5/Y/V@964F@VX@W04U63V6U
Y5@U0X@F@
]
3@49@F/V@F5/W@W
7
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2
8J5@Y\695/V/9Y@V0FY09F@
]
3@49@F6U2
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@4916F@FY5@;K!=>;D04W04
7
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2
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#
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西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
$$
卷
够有效地激活
(%3A

5@B
和
+8:
报告基因的表
达!而单独的
?;I)=>;
结合结构域不能激活报
告基因表达!这说明在酵母中
具有转录激
活作用"图
&
#&为了更精细地定位
的转录
激活区!采用同样的方法检测了
的各种缺
失突变体对转录的激活作用!图
&
显示
<
末端区域
的缺失"
"
<

"
<#

"
>
"
<#

"
>#
"
和
"
>#
"
<$
#导
致报告基因不能被激活!相反
>
末端的缺失
"
"
>
和
"
>#
#并不影响报告基因
的表达!这一结果证实了
的
<
末端酸性域
具有转录激活作用&
&
(
半乳糖苷酶活性测定结果显示!虽然都含有完
整的
<
末端!但是
#$&(!*%
"
"
>#
#的转录
激活活性明显比
和
&)(!*%
"
"
>
#高"图
+
#!推测在融合蛋白中
的
>
末端
和
;K!
结构域可能对
<
末端区域的转录激活活性
图
$
!
不同物种
氨基酸序列系统进化树分析
G0
7
8$
!
K5
2
16
7
@4@Y09YV@@6UY5@/.046/90W
F@
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3@49@F6UE
1/4YF
E
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图
)
!
低温处理对
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基因表达的影响
G0
7
8)
!
-T
E
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7
@4@04V@F
E
64F@Y6961W
产生了阻碍作用&尽管酸性结构域缺失了一段
>
末
端序列!
#%!(!*%
"
"
>$
#和
!#*(!*%
"
"
>)
#仍具有较高的转录激活活性!但若删
除酸性结构域最后的
,+
个氨基酸"
"
>#
图
*
!
核定位实验
G0
7
8*
!
>391@/V169/10[/Y0646UY5@图
,
!
?;I)=>;
结合域与各种
缺失突变体形成的融合蛋白示意图
G0
7
8,
!
R95@./Y096X@VX0@\6UY5@U3F064
E
V6Y@04FU6V.@W
D@Y\@@4Y5@?;I)=>;(D04W04
7
W6./04/4W
X/V063FW@1@Y064.3Y/4YF6U图
&
!
转录激活区的确定
;8
具有转录激活活性重组子的筛选"
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*
(JV
E
*
(N0F
*
(;W@
培养基#%
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重组子筛选"
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培养基#
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/9Y0X/Y064W6./046U;8R9V@@404
7
6UYV/4FU6V./4YF\0Y5YV/4F9V0
E
Y064
/9Y0X/Y064
"
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*
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E
*
(N0F
*
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4Y5@Y09.@W03.
#%
A8R9V@@404
7
6UYV/4FU6V./4YF
"
R=
*
(JV
E
F
2
4Y5@Y09.@W03.
#
#!&#
%
期
!!!!!!!!!!!!!!
袁红雨!等$茶树
!$!"##
基因克隆和转录活性分析
图
+
!
&
(
半乳糖苷酶活性检测
;N#"%
为
;N#"%
酵母细胞裂解液%
E
?Aa&
为携带
E
?Aa&
质粒的
;N#"%
酵母细胞裂解液%
为表达
?;I)=>;
结合结构域
(
融合蛋白的酵母细胞裂解液%
"
<

"
<#

"
>
"
<#

"
>

"
>#

"
>#
"

"
>#
"
<$

"
>!
"
<)

"
>$

"
>)
分别表示表达
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结合结构域和
各种缺失突变体
融合蛋白的酵母细胞裂解液%本实验重复
$
次!取平均值
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标准误
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(
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"
<$
#!其转录激活活性消失&因此!
的
<
末端
,+
个氨基酸残基可能在转录激活中起着关键
作用&
$
!
讨
!
论
S<-#(冷应答途径是目前最为清楚的一个调
节植物冷信号传递和冷驯化的转录级联!在该途径中
转录因子处于中心地位&在受
调节的低温
应答基因的启动子中存在一至多个
<:J
*
=:-
元件!
与这些元件结合并激活下游基因的表达!其中包
括能够提高植物耐冰冻性的基因&已在毛果杨
"
;/
0
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0
%
#
(
#+
)
甜 樱 桃 "
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4&
#
(
!$
)
垂枝桦"
"14(%
0
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#
(
#%
)等落叶树种以及
蓝桉"
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#
(
!)
)
枸橘"
;/*3),4$1,)
E
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%1%
#和葡萄柚"
!)1,4$
0
%,%.)$)
#
(
!*
)等常绿树种分离出
!"#
基因!说明
S<-#(冷应答途径在木本植物
中也广泛存在&对桉属植物的研究发现!低温耐受
型桉树的
!"#
基因受低温持续诱导的时间比低温
敏感型的桉树长!说明
冷应答途径可能在木本
植物的耐寒性方面发挥重要作用&
本研究利用
:;<-
技术从茶树的叶片中克隆
到一个新的
转录因子基因
!$!"##
!氨基酸序
列比对结果显示该基因的编码产物与垂枝桦和粗柠
檬的
的遗传距离较近&
含有一
;K!
*
-:-AK=>;
结合域!
Q/4
7
等(!,)利用电泳迁移率
改变检测法证明
能够结合
<:J
*
=:-
顺式
元件&与
;K!
*
-:-AK
蛋白质家族的其他成员相
比!
转录因子有两段特有的标识序列!分别位
于
;K!
*
-:-AK
结构域的两端&上游标志序列被
认为是核定位信号&尽管
的上游标志序列
在第
*
和第
#"
位置上发生了变化!然而瞬时转染实
验证实
仍定位于细胞核中&第二段标识序
列
=R;Q:
高度保守!其功能目前尚不清楚&在
中!
=R;Q:
的第三位点丙氨酸变为缬氨
酸!相同的变化也出现在某些茄属和苜蓿属物种中&
具有羧基末端酸性结构域!在酵母细
胞中能够激活报告基因的转录&缺失突变分析证
明!完整的酸性结构域的转录激活活性最高!
<
端缺
失导致该结构域丧失转录激活活性!而
>
端缺失对
转录激活作用的影响有限&因此!在激活转录方面!
酸性结构域的
<
端比
>
端更为重要&总的来说!
!$!"##
基因的表达受低温的快速诱导!表达产物
可以特异性地结合
<:J
*
=:-
元件!激活转录!推
测
冷应答途径可能在茶树的冷驯化中发挥重
要作用&
参考文献!
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