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Cloning and Function Identification of PrseSHP Gene from Prunus lannesiana (Rosaceae)

日本晚樱PrseSHP基因的克隆与功能分析



全 文 :书西北植物学报!
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文章编号$
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-
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$国家自然科学基金项目"
%##"#!"!
#&长江大学博士启动基金"
&"##1""#"##&
#
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作者简介$刘志雄"
#1,,(
#!男!博士!副教授!主要从事园林植物分子育种研究
2)34.5
$
675.8,,
!9
4:;;+<;3
日本晚樱
1(2)031
基因的克隆与功能分析
刘志雄#!!李来运#!李凤兰!
"
#
长江大学 园艺园林学院!湖北荆州
*%*"!$
&
!
北京林业大学 生物科学与技术学院!北京
#"""&%
#

!
要$采用同源克隆方法结合
=>?2
技术!从日本晚樱"
!"#$#%&$$(%)$
#品种(大岛樱)中克隆到花发育调控
相关的
!"%(*+!
基因"
@A0B40C
登录号为
@D%!*$
#
!"%(*+!
基因序列全长
#!!%E
F
!包含
#
个长
,*#E
F

完整开放阅读框!编码
!*
个氨基酸和
#
个终止密码子分子系统发生分析表明!
GH/AIJG

K>LI)E;7
转录因
子的
GM2
%
IJG
进化系!并与蔷薇科植物的
IJG
同源蛋白聚于同一进化分支&蛋白序列比对显示!该转录因子拥有
K
*
N
*
O

?

*
个结构域!且其
?
末端结构域中包含高度保守的
>@
"

#
基序基因表达分析表明!
!"%(*+!
基因主要在(大岛樱)的花瓣*雄蕊*雌蕊和幼果等器官中表达!在花萼中仅能检测到微弱的转录信号!在幼叶中不
表达!与其他植物
*+!
同源基因的表达模式有一定的差别功能分析显示!转
!"%(*+!
基因拟南芥植株明显比
野生型拟南芥弱小!转基因拟南芥在

$
&
片莲座叶后即抽薹开花!时间较野生型拟南芥"
#*
$
#,
片莲座叶后抽薹
开花#明显提前!证明异位表达的
!"%(*+!
基因能促进拟南芥早花!其在花发育过程中可能参与调控植物开花
关键词$日本晚樱&花发育&
K>LI)E;7
&
!"%(*+!
中图分类号$
P,&
!!!
文献标志码$
>
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1(4/42*$//)2-$/$
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R
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F
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R
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F
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R
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R
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F
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F
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F
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R
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9
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R
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F
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R
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N
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F
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T809
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1
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9
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R
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R
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R
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R
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RR
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R
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9
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7.
8
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F
3A0U
&
K>LI)E;7
&
!"%(*+!
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日本晚樱"
!"#$#%&$$(%)$
#是蔷薇科"
=;/4)
#著名的观赏花木其花色艳丽!冠型优美!品
种多!适应性广!观赏价值高!被广泛用于城市园林
景观建设+#,随着近年国内赏樱热持续升温!选育
或引进名优樱花品种!增加城市园林多样性!满足人
们对人居环境日益增长的审美需求显得尤为重要
中国樱花种质资源丰富!开展樱花生殖发育调控研
究!对樱花杂交育种*遗传改良和种质创新等均有较
重要的意义在拟南芥中!
*+-3345!!667
"
*+!
#是参与调控雌蕊*子房*胚珠和果实发育的
?类
K>LI)E;7
基因!并具有促进角果正常开裂的
功能+!,近年研究发现!
*+!
基因还参与调控植物
的胎座发育+%,
78!
是矮牵牛"
!(9#$):
;
.")/
#
*+!
同源基因!其除参与调控心皮发育和果实开裂
外!还具有调控雄蕊正常发育和决定花分生组织特
征的功能+*,&本氏烟草"
<)=09)$.($9:>)$
#的
*+!
同源基因
<.*+!

78!
基因功能相
似+$),但在茄科植物番茄"
*0&$#>&
;
=0
1
("%)2
=#>
#中!其
*+!
同源基因
3-?@#
仅参与调控果
皮的发育与果实的成熟!并不参与花分生组织特性
决定!也 未 在 雌 蕊 中 表 达+),,而 豆 科 苜 蓿 属
"
A(/)=
B
0
#植物中的
*+!
同源基因有参与种间荚
果形态分化的功能+&,蔷薇科植物桃"
!"#$#%
1
("2
%)=
#的
*+!
同源基因
!
1
("*+!
在成熟果实中的
表达量明显升高!并且在中*内果皮明显分离的栽培
品种中表达更强+1!#",&
7*+!
为草莓"
7"
B
")_
$$%%
#的
*+!
同源基因!其表达量的减少能延
缓果实的成熟+##,上述研究表明!不同类群被子植
物中的
*+!
同源基因!参与植物生殖发育调控的
同时!其功能伴随被子植物的演化而发生了分化
相对模式植物和草本园艺作物而言!园林树木
童期长!生殖发育过程复杂并季节性开花!相关研究
相对滞后本研究以日本晚樱里樱系野生单瓣品种
(大岛樱)"
!,&$$(%)$
(
K4C.0;
)#为试材!系统研
究其
*+!
同源基因在花和果实发育过程中的表达
模式和功能!为樱花的分子辅助育种积累资料
#
!
材料和方法
:+:
!

!

!""1

*
$
$
月采集 (大岛樱)的幼叶*花芽和
幼果!将雌雄蕊刚发育成熟但未开放的花蕾按花萼*
花瓣*雄蕊与雌蕊分开!并将这
*
轮花器官*幼叶和
幼果立即用液氮速冻!后
(&"`
保存备用
:+;
!

!

:<;<:
!
日 本 晚 樱
1(2)031
基 因 克 隆
!

2>IW/
F
.0
植物
=Z>
提取试剂盒"北京艾德莱#提
取(大岛樱)花芽总
=Z>
!按试剂盒说明书操作参
照文献+
#
,的方法合成第一链


%a)=>?2

增!
%a)=>?2
基因特异引物为
@IGIJG
&根据获得

%a)=>?2
扩增序列设计
$a)=>?2
扩增引物!利

$a)=>?2
试剂盒 "
bAH/.;0!+"
!
.0X.UH;
R
A0

司#!参照文献+
#!
,的方法!扩增日本晚樱
!"%(*+!
基因的
$a
端序列!
$a)=>?2
的第一链

合成引
物为
@IG#IJG
!第
#

G?=
和巢式
G?=
反应的基
因特异引物分别为
@IG!IJG

@IG%IJG
根据
$a)=>?2

%a)=>?2
扩增序列进行电子拼接!在
基因的
$a)D\=

%a)D\=
区设计克隆日本晚樱
!"%(*+!
基因全长引物!验证拼接序列的真实性并
分离出
!"%(*+!
基因
G?=
扩增的上下游引物为
GH/AIJGS

GH/AIJG=

G?=
扩增退火温度为
$
$
$&`
*阳性克隆鉴定参照文献+
#!
,所用引物
"表
#
#均由生工生物"上海#股份有限公司合成!
LZ>
由华大基因测序
:+;+;
!
蛋白同源比对与分子系统发生分析
!

!"%(*+!
基因编码的蛋白在
Z?BN
数据库中执行
B54/U
搜索与同源比对并将
GH/AIJG
转录因子同
Z?BN

IJG
同 源 蛋 白 序 列 进 行 比 较用
K2@>$+"
软件!选邻接法"
ZA.
R
:E;8H
-
;.0.0
R
!
ZY
#
构建分子系统发生树+#%,
:<;<=
!
半定量
3>?@$3
检测
1(2)031
基因表达的
组织特异性
!
提取(大岛樱)幼叶*花萼*花瓣*雄蕊*
雌蕊和幼果中的总
=Z>
!检测其质量与完整性!将
其逆转录成第一链

用半定量
=\)G?=

术检测
!"%(*+!
基因在这

种器官中表达的组织
特异并根据
!"%(*+!
基因的特异序列设计上下
游引物
=\IJGS

=\IJG=
!进行
=\)G?=
分析
之前!检测引物的特异性&以日本晚樱
-=9)$
基因作
内参!内参引物序列和
=\)G?=
检测参考文献+#*,
:+;+A
!
载体构建与功能分析
!

!"%(*+!
基因
包含完整开放阅读框"
]=S
#的正义片段插入到
C.
"

*>
"
限制性酶切位点之间!并将其克隆
到表达载体
F
BN#!#
上!构建载体的上下游引物为
\GH/AIJGS

\GH/AIJG=
将构建好的
F
BN#!#)

:
!
引物名称及序列
\4E5A#
!
GH.3AH043A40V/A
^
8A0
引物名称
GH.3AH043A
引物序列
GH.3AH/A
^
8A0"
$a
"
%a
#
@IGIJG $a)>?>>\@@>@\\???>>>\?>>@)%a
@IG#IJG $a)??>>@>\\>?>@@@>@@>)%a
@IG!IJG $a)>@@?@@??>?@@@\>@>@>>@)%a
@IG%IJG $a)?@?\\>>\?\?>>\?\\@??\?\\)%a
GH/AIJGS $a)?@?\?>>?\?>>?>>?\>>?)%a
GH/AIJG= $a)\@@>>?>\?>?>?@@?>\\?)%a
=\IJGS $a)>?>>\@@>@\\???>>>\?>>@)%a
=\IJG= $a)@?>@?\?@>\?\???\?\\\)%a
\GH/AIJGS $a)?@?\?\>@>>?\?>>?>>?\>>?)%a
\GH/AIJG= $a)\???@@@>>?>\?>?>?@@?>\\?)%a
^
4\@>@?>>@@>@\>?>?)%a
^
4?>\?\@\\@@>>@@\@?\)%a
^
GH/AIJGS $a)@@>>@>?\@@>@>>>@@@>\)%a
^
GH/AIJG= $a)>\\\@\\\@?\@?\@\\@\@)%a
,"$#
&
期 刘志雄!等$日本晚樱
!"%(*+!
基因的克隆与功能分析
!"%(*+!
表达载体导入农杆菌
@b%#"#)1"
菌株!
在农杆菌的介导下!用浸花法将
%$I
$$
!"%(*+!

入野生型拟南芥
?;5)"
+
#$
,
收获拟南芥
#
代种子!
消毒除菌后置于含
$"
%
R
%
3M
卡拉霉素的
#
%
!KI
培养基上
*`
暗培养
!*:
!后转入
!!`
!光暗周

#:
%
&:
的温室中培养
#"V
!筛选根系发育良
好!且真叶和生长点都为绿色的植物为阳性转化苗!
经炼苗*壮苗后移置到人工气候箱!待开花后进行实
时荧光定量
G?=
"
^
840U.U4U.XAHA45U.3A=\)G?=
!
^
=\)G?=
#鉴定!检测
!"%(*+!
在转基因拟南芥中
的表达水平作
^
=\)G?=
分析时!以拟南芥
-=9)$
基因为内参!非转基因拟南芥为阴性对照!
^
=\)
G?=
分析用的内参基因上下游引物为
^
4
^
4!
!"%(*+!
基因的上下游引物为
^
GH/AIJ)
GS

^
GH/AIJG=
!并观察外源基因表达量高的转
基因拟南芥表型!分析
!"%(*+!
基因的功能
!
!
结果与分析
;<:
!
1(2)031
基因全长
+BC5
序列的克隆
同源克隆方法结合
=>?2
技术!从(大岛樱)花
芽中分离出
!"%(*+!
基因完整

全长序列
结构分析表明!日本晚樱
!"%(*+!
基因序列

全长为
#!!%E
F
!包括
!*E
F

$a)D\=
*
,*#E
F

完整
]=S

!#&E
F

%a)D\=
!编码
!*
个氨基酸

#
个终止密码子在
Z?BN
网站上执行
B54/U

索和序列同源比对显示!其与
K>LI)E;7
基因家族
中的
IJG
进化系亲缘关系最近!命名为
!"%(*+!
!
@A0B40C
登录号为
@D%!*$

;+;
!
蛋白序列同源比对与分子系统发生分析

#
表明$日本晚樱
GH/AIJG
与桃的
G
F
AHIJG
亲缘关系最近!同苹果的
KVK>LI#*
亲缘关系次
之!三者同其他蔷薇科植物的
IJG
同源蛋白聚于同
一进化分支!与其他科属植物的
IJG
同源蛋白分
开!聚类结果支持传统经典分类学种属间的亲缘关
系蛋白序列同源比对"图
%
#显示$
GH/AIJG
转录
因子包含
#
个高度保守的
K>LI
结构域!由
$,

氨基酸残基组成"
#
$
,!
#&
#
个次级保守的
O
结构
域!含
&!
个氨基酸"
#"$
$
#&
#!由
O#
"
#"$
$
#!
#*
O!
"
#%1
$
#$%
#和
O%
"
##
$
#&
#
%
个含疏水氨基酸
残基的亚结构域+#,&其
K>LI
区与
O
区之间!含
#
个保守性相对较低的间隔区
N
区!由
%!
个氨基酸残
基组成"
,%
$
#"*
#&该转录因子
?
末端结构域序列
变异较大!由
"
个氨基酸残基组成"
#&,
$
!*
#!包

!
个十分保守的
>@
"

#
基序!属
?
类转录因
子&另外!该转录因子的
Z
末端还有一段由
#$
个氨
基酸残基组成的延伸序列
;<=
!
花器官与幼果中
1(2)031
基因表达的半定量
3>?@$3
检测
!!
半定量
=\)G?=
检测"图
!
#显示$
!"%(*+!

要在 (大岛樱)的花和果中表达!在幼叶中不表达&
其在花瓣*雄蕊和雌蕊中表达量高!在花萼中表达量
低且
!"%(*+!
基因在(大岛樱)花瓣*雄蕊!雌蕊
和幼果中的表达差异不显著"
!
#
"+"$
#!但其在这
些器官中的转录活性均显著高于花萼"
!
$
"+"$
#
;!
1(2)031
基因的功能分析
为进一步验证
!"%(*+!
基因在日本晚樱生殖
发育过程中的功能!将
!"%(*+!
基因的正义片段
克隆到双元表达载体
F
BN#!#
中!经农杆菌介导转入
野生拟南芥抗生素筛选和
^
=\)G?=
鉴定"图
*
#
结果共获得
!%

%$I
$$
!"%(*+!
拟南芥转基因植
株!跟踪观察这些转基因拟南芥植株的表型发现!
%
株转基因拟南芥中有
#,
株拟南芥开花时间明显提
前!占转基因植株总数的
,%+1c
!其在

$
&
片莲座

#
!
GH/AIJG
同其他
IJG
同源蛋白的分子系统发生分析
括号内为氨基酸登录号&分支上的数字表示
#"""
次重复
计算获得的自展百分比&标尺代表遗传距离
S.
R
+#
!
G:
9
5;
R
A0AU.<4045
9
/./;TGH/AIJG[.U:;U:AH
IJG)5.CAK>LI)E;7
F
H;UA.0/
@A0E40C4<
&
Z83EAH/HA
F
HA/A0U
U:AB;;U/UH4
FF
AHR
AX458A/<45<854UAVE
9
#"""HA
F
5.<4UA/
&
\:A/<45AE4HHA
F
HA/A0U/
R
A0AU.
!
!
!"%(*+!
基因在(大岛樱)不同器官中的表达
5A+
幼叶&
/A+
花萼&
F
A+
花瓣&
/U+
雄蕊&
R9
+
雌蕊&
TH+
幼果
S.
R
+!
!
27
F
HA//.;04045
9
/./;T!"%(*+!.0V.TTAHA0U
;H
R
40/;T!,&$$(%)$
(
K4C.0;
)
5A+Y8XA0.5A5A4T
&
/A+IA
F
45
&
F
A+GAU45
&
/U+IU43A0
&
R9
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9
0;A<.83
&
TH+W;80
R
TH8.U
&"$#
西
!

!

!

!

!

%$


%
!
GH/A/JG
蛋白序列同源比对和结构分析
双下划线代表
K>LI)E;7
区&单下划线代表
O
区&近缘蛋白中的圆点表示相同的氨基酸残基!方框中分别为
>@
"

#
基序&
括号内为氨基酸登录号&
GH/AIJG+
日本晚樱&
G
F
AHIJG+
桃&
KVK>LI#*+
苹果&
S4IJG+
草莓&
\HIJG+
太行花&
IJG#
!
IJG!+
拟南芥&
GM2+
金鱼草&
SBG+
矮牵牛&
\>@M#+
番茄&
ZEIJG+
本氏烟草
S.
R
+%
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R
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F
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F
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F
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4HA.0V.<4UAV4/V;U/+>@)3;U.T
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GH/AIJG+!"#$#%&$$(%)$
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AHIJG+!,
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1
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*
!
转基因拟南芥
^
=\)G?=
检测
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野生型拟南芥&
4
!
E+
转基因拟南芥植株
S.
R
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期 刘志雄!等$日本晚樱
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基因的克隆与功能分析
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的野生型拟南芥要长到
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型拟南芥弱小!但其花器官结构未见明显改变"图
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基因在花发育过程中能促
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同源序列比对与分子系统发生分析表明!(大岛
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转录因子的
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进化系!并与蔷薇科植物
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同源蛋白聚于
同一进化分支表达分析表明!
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主要在
(大岛樱)的花瓣*雄蕊*雌蕊和幼果等器官中表达!
在花萼中仅能检测到微弱的转录信号!在幼叶中不
表达!其表达模式与其他类群植物中的
*+!
同源
基因有一定的差异
!
1
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为日本晚樱近缘种桃的
*+!
同源
基因!其仅在雄蕊*雌蕊和果实中表达!主要参与果
实的发育+1,&而蔷薇科另一植物太行花的
*+!

源基因
3"*+!
仅在发育中的雄蕊和雌蕊中表达!
随着子房中胚珠的发育!其转录活性仅局限在胚珠
中!参与调控胚珠的发育+#,,
3-?@#
为茄科植物
番茄的
*+!
同源基因!在花发育过程中其主要在
雄蕊和雌蕊中表达!并且在花瓣中也能检测到微弱
的转录信号&但在果实发育过程中!其仅在果皮中表
达!参与调控果皮的发育与果实的成熟+,,&
78!

矮牵牛的
*+!
同源基因!其主要在雄蕊*柱头和胚
珠中表达!除参与调控雌蕊发育和果实开裂外!还参
与调控花分生组织的形成!促进植物开花+*,可见!
不同类群植物中
*+!
同源基因除表达模式变化
外!其功能也发生了相应的分化从日本晚樱
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基因的表达模式及
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转基因
拟南芥的表型推测!
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在发育过程中具有促
进开花和参与调控果实发育的功能!其具体的调控
机制仍有待进一步研究
参考文献!
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