全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４４(５): ４６９￣４７７(２０１４)
收稿日期: ２０１４￣０１￣１０ꎻ 修回日期: ２０１４￣０７￣０３
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(３１１０１４７５)ꎻ 扬州大学高层次人才科研启动基金资助项目(０２７４９８３０１４８１１)
通讯作者: 纪兆林ꎬ 副教授ꎬ 主要从事植物病害生物防治及分子植物病理学研究ꎻ Ｔｅｌ: ０５１１￣８７９７９２４９ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｚｈｌｊｉ＠ｙｚｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１４.０５.００４
水稻白叶枯病菌 Ｈｐａ１Ｘｏｏ蛋白的结构分析
纪兆林１∗ꎬ 李 健１ꎬ 石刘飞１ꎬ 郝 欣１ꎬ 王金生２
( １扬州大学园艺与植物保护学院ꎬ 扬州 ２２５００９ꎻ ２南京农业大学植物保护学院ꎬ 南京 ２１００９５)
摘要:在大肠杆菌中表达了水稻白叶枯病菌 ＪｘｏＩＩＩ 菌株的 Ｈｐａ１Ｘｏｏ(ｈａｒｐｉｎＸｏｏ)蛋白ꎬ通过生物物理和生物化学方法分析了
Ｈｐａ１Ｘｏｏ的结构特征ꎮ Ｈｐａ１Ｘｏｏ粗蛋白能使烟草产生过敏性坏死反应(ＨＲ)ꎬ以及圆二色(ＣＤ)光谱具有 α￣螺旋的典型特征ꎮ
通过柱层析纯化发现 Ｈｐａ１Ｘｏｏ蛋白存在 ２种洗脱峰组分 Ａ和 ＢꎬＢ组分的含量远高于 Ａ组分ꎬ且二组分都具有 ＨＲ活性ꎮ 空
间排阻色谱(ＳＥＣ)和分析超速离心(ＡＵＣ)结构分析表明组分 Ａ 是 Ｈｐａ１Ｘｏｏ的二聚体形式ꎬ而组分 Ｂ 是 Ｈｐａ１Ｘｏｏ的单体形
式ꎮ 组分 Ａ与 Ｂ均具有 α￣螺旋的特征 ＣＤ谱ꎬ但存在含量和构象上的差异ꎮ 生物信息学方法对 Ｈｐａ１Ｘｏｏ二级结构和聚体结
构的预测结果与实验测定和分析拟合的结果相一致ꎮ 另外ꎬ预测也发现 Ｈｐａ１Ｘｏｏ存在丰富的固有无序结构区域ꎮ
关键词:水稻白叶枯病菌ꎻ Ｈｐａ１Ｘｏｏꎻ α￣螺旋ꎻ 过敏性坏死反应ꎻ 聚体结构
Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｐａ１Ｘｏｏ ｆｒｏｍ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ ＪＩ Ｚｈａｏ￣ｌｉｎ１ꎬ ＬＩ Ｊｉａｎ１ꎬ
ＳＨＩ Ｌｉｕ￣ｆｅｉ１ꎬ ＨＡＯ Ｘｉｎ１ꎬ ＷＡＮＧ Ｊｉｎ￣ｓｈｅｎｇ２ ( １Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ｙａｎｇｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ
Ｙａｎｇｚｈｏｕ ２２５００９ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ｎａｎｊｉｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｎａｎｊｉｎｇ ２１００９５ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｈｐａ１Ｘｏｏ(ｈａｒｐｉｎ) ｉｓ ａ ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｉｃｅ ｂｌｉｇｈｔ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ
ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ (Ｘｏｏ) ｔｈａｔ ｅｌｉｃｉｔｓ ａ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ (ＨＲ) ｉｎ ｎｏｎｈｏｓｔ ｔｏｂａｃｃｏ. Ｔｈｅ Ｈｐａ１Ｘｏｏ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｏｆ Ｘｏｏ ＪｘｏＩＩＩ ｓｔｒａｉｎ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｈｐａ１Ｘｏｏｗａｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｕｓｉｎｇ ｂｉｏ￣
ｐｈｙｓｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ. Ｈｐａ１Ｘｏｏ ｃｒｕｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｌｉｃｉｔｅｄ ＨＲ ｏｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｌｅａｖｅｓ ａｎｄ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｔｙｐｉ￣
ｃａｌ α￣ｈｅｌｉｘ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｂｙ ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ (ＣＤ) ｓｐｅｃｔｒｕｍ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ ｐＥＴ￣３０ａ(＋) ｃｒｕｄｅ
ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ. Ｈｐａ１Ｘｏｏ ｃｒｕｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｈｏｗｅｄ ｔｗｏ ｐｅａｋｓ (Ａ ａｎｄ Ｂ) ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ ｔｗｏ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ. Ｂｏｔｈ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ Ａ
ａｎｄ Ｂ ｉｎｄｕｃｅｄ ＨＲ ｏｎ ｔｏｂａｃｃｏ ｌｅａｖｅｓ. Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ａ ｗａｓ ａ ｄｉｍｅｒꎬ ａｎｄ Ｂ ｗａｓ ａ ｍｏｎｏｍｅｒ ｏｆ Ｈｐａ１Ｘｏｏ ａｎａｌｙｓｅｄ ｂｙ
ｓｉｚｅ￣ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ (ＳＥＣ) ａｎｄ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ (ＡＵＣ) ｍｅｔｈｏｄｓ. Ｆｒａｃｔｉｏｎｓ Ａ ａｎｄ Ｂ
ｈａｄ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ α￣ｈｅｌｉｘ ＣＤ ｓｐｅｃｔｒｕｍꎬ ｂｕｔ ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｃｏｎｔｅｎｔ ａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ. ＣＤ ｄａｔａ
ｆｉｔｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ α￣ｈｅｌｉｃａｌ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｆｒａｃｔｉｏｎ Ａ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ Ｂꎬ ａｎｄ
ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｂ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ａ ｃｅｒｔａｉｎ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ β￣ｓｈｅｅｔ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅꎬ ｂｕｔ Ａ ｄｉｄ ｎｏｔ. Ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ
ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｓｔａｔｅ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｐｒｏｇｒａｍｓ Ｐｈｙｒｅ (ｖｅｒｓｉｏｎ ０.２)ꎬ ＨＮＮꎬ ａｎｄ ＳＣＯＲＥＲ ２.０
ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｉｔｔｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ. Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｙꎬ ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ
ｕｓｉｎｇ Ｐｈｙｒｅ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ Ｈｐａ１Ｘｏｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｅｓｅｎｔｓ ｆｉｖｅ ｃｏｎｆｉｄｅｎｔ ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｒｅｇｉｏｎｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ. ｏｒｙｚａｅꎻ Ｈｐａ１Ｘｏｏꎻ α￣ｈｅｌｉｘꎻ ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅꎻ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ
中图分类号: Ｓ４３２.４４ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０５￣０４６９￣０９
革兰氏阴性植物病原细菌 ＩＩＩ 型泌出系统
( ｔｙｐｅ￣ＩＩＩ ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍꎬ Ｔ３ＳＳ) [１]分泌的 ｈａｒｐｉｎ
蛋白一直是植物病理学的研究热点ꎮ Ｈａｒｐｉｎ 是由
ｈｒｐ基因编码ꎬｈｒｐ 基因决定了病原菌对感病寄主
的致病性和对非寄主或抗病寄主的过敏性坏死反
应(ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅꎬＨＲ) [２]ꎮ Ｈａｒｐｉｎ蛋白都
植物病理学报 ４４卷
具有相似的生化特征:富含甘氨酸、缺少半胱氨酸、
热稳定、对蛋白酶敏感以及酸性组成ꎬ其主要共同
生物效应是诱导烟草等非寄主产生 ＨＲ[３ꎬ４]ꎮ 当
ｈａｒｐｉｎｓ应用到非寄主植物时ꎬ它们能激发抗病相
关防卫反应ꎬ例如 ＨＲ、ＲＯＳ爆发、病程相关基因和
防卫相关基因转录本的积累以及系统获得抗病性
(ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅꎬ ＳＡＲ)、抗虫性和促
进植物生长[５~９]ꎮ 由于 ｈａｒｐｉｎｓ 在细菌病原中广泛
存在和分布ꎬ通常认为其是一类 ＰＡＭＰｓ(ｐａｔｈｏｇｅｎ￣
ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐａｔｔｅｒｎｓ)ꎬ但能激活类似 ＥＴＩ
( ｅｆｆｅｃｔｏｒ￣ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ) 的 防 卫 反 应[１０]ꎮ
Ｈａｒｐｉｎ蛋白具有重要的抗病生物功能ꎬ但目前
ｈａｒｐｉｎ蛋白的结构仍不明确ꎮ
水稻白叶枯病菌 Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ.
ｏｒｙｚａｅ 激发非寄主植物产生 ＨＲ 的 ｈａｒｐｉｎ 蛋白
(Ｈｐａ１Ｘｏｏ)由 ｈｐａ１基因编码ꎬＨｐａ１Ｘｏｏ含有 １３９个氨
基酸ꎬ富含甘氨酸ꎬ还含有 １ 个半胱氨酸(其他报
道的 ｈａｒｐｉｎ 不含半胱氨酸)ꎬ分子量为 １３. ７３
ｋＤａ[１１]ꎬ能在烟草上引起 ＨＲꎬ在植物体外施用和
体内表达都能诱导和提高多种植物的抗病、抗旱能
力[１２~１７]ꎮ 本文通过生物物理和生物化学方法对
Ｈｐａ１Ｘｏｏ蛋白进行了初步研究ꎬ以明确 Ｈｐａ１Ｘｏｏ蛋白
在体外的存在形式及其结构特征ꎬ为 ｈａｒｐｉｎ 的功
能￣结构关联及分子机理研究打下基础ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 材料
１.１.１ 菌株及来源
(１)Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１(ＤＥ３) / ｐＥＴ￣３０ａ(＋)∷
ｈｐａ１Ｘｏｏ携带水稻白叶枯病菌(Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ
ｐｖ. ｏｒｙｚａｅ)ＪｘｏＩＩＩ的 ｈａｒｐｉｎＸｏｏ编码基因 ｈｐａ１Ｘｏｏ(ｈｒｆ￣
ＡＸｏｏ)ꎬ具卡那霉素(ｋａｎａｍｙｃｉｎꎬ Ｋｍ)抗性ꎬ本实验
室保存ꎮ
(２)Ｅ. ｃｏｌｉ ＢＬ２１(ＤＥ３) / ｐＥＴ￣３０ａ(＋) 不含有
目的基因的空载体对照菌株ꎬ具 Ｋｍ 抗性ꎬ用作蛋
白提取纯化分析、活性检测的空白对照ꎬ本实验室
保存ꎮ
１.１.２ 供试植物 供试烟草品种为三生烟(Ｎｉｃｏｔｉ￣
ａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ. “Ｘａｎｔｈｉ”)ꎬ 盆栽于温室内(２５ ℃ꎬ
８０％ ＲＨ)ꎬ种植 ７~８周后(８叶期左右)开始使用ꎮ
１.２ 方法
１.２.１ Ｈｐａ１Ｘｏｏ和 ｐＥＴ蛋白的表达与提取
( １)取冰箱保存的实验菌株 ｐＥＴ￣ｈｐａ１Ｘｏｏ /
Ｅ. ｃｏｌｉ ＢＬ２１(ＤＥ３)在 ＬＡ(含 Ｋｍ ３０ μｇ / ｍＬ)平板
上划线ꎬ３７℃活化培养ꎬ后接入 ２０ ｍＬ ＬＢ 培养液
(含 Ｋｍ ３０ μｇ / ｍＬ)中过夜振荡培养(３７℃ꎬ１８０
ｒ / ｍｉｎ)１２ ｈꎮ
(２)将过夜培养物按照 １ ∶ １００ 比例接种于
１００ ｍＬ ＬＢ 液体培养基(含 Ｋｍ ３０ μｇ / ｍＬ)中ꎬ
３７℃、１８０ ｒ / ｍｉｎ 振荡ꎬ进行扩大培养ꎻＯＤ６００达到
０.７后ꎬ以终浓度 １.０ ｍｍｏｌ / Ｌ 加入异丙基硫代￣β￣
Ｄ￣半乳糖苷( ＩＰＴＧꎬ美国 ＥＭＤ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ 公司产
品)诱导培养 ４ ｈꎮ
(３)以 １００ ｍＬ等分离心收集菌体细胞(５ ０００
ｒ / ｍｉｎꎬ５ ｍｉｎꎬ４℃)ꎬ以 １０ ｍＬ 冰冷的磷酸盐缓冲液
(５ ｍｍｏｌ / Ｌ ＫＨ２ＰＯ４ꎬｐＨ ６.５)悬浮菌体ꎬ再以终浓
度 ０.５ ｍｍｏｌ / Ｌ加入苯甲基磺酰氟(ＰＭＳＦꎬ上海生
物工程技术服务有限公司产品)ꎮ
(４)菌体悬浮液置于冰上ꎬ进行超声波破碎ꎻ
共 ５次脉冲ꎬ每次持续不超过 １５ ｓꎬ间隔 ２０ ｓ以上ꎮ
(５)将破碎混合物在 １２ ０００ ｒ / ｍｉｎ、４℃条件下
离心 １５ ｍｉｎꎬ回收上清液ꎮ
(６)上清液经沸水浴处理 １０ ｍｉｎꎬ按照上述条件
离心ꎬ去除沉淀ꎬ获得的上清液即为 Ｈｐａ１Ｘｏｏ粗蛋白ꎮ
(７)按照上述方法ꎬ同样获得空载体 ｐＥＴ 粗蛋
白ꎬ 用作对照ꎮ
１.２.２ Ｈｐａ１Ｘｏｏ蛋白的纯化与分子量测定 粗蛋白
用蛋白液相层析仪 ÄＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒＴＭ ｓｙｓｔｅｍ(瑞典
Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ公司ꎬ安徽省农业科学院水
稻研究所提供)进行凝胶过滤层析(又称空间或尺
寸排阻色谱ꎬｓｉｚｅ￣ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙꎬＳＥＣ)ꎬ
柱子是 Ｓｕｐｅｒｏｓｅ￣１２ １０ / ３００ ＧＬꎬ 洗脱液为 ２０
ｍｍｏｌ / Ｌ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ(ｐＨ ８.０)和 １００ ｍｍｏｌ / Ｌ ＫＣｌꎬ流
速为 ０.８ ｍＬ / ｍｉｎꎮ 根据洗脱峰收集各对应的组分
溶液ꎮ 根据洗脱体积及 Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ 提供
的软件程序 ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ 计算出各洗脱峰的分子量ꎮ
对收集到的各组分洗脱液冷冻干燥处理ꎬ获得冻干
粉ꎮ －７０℃超低温冰箱保存ꎮ
１.２.３ 圆二色(ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍꎬ ＣＤ)光谱测定
(１)样品准备 用 ５ ｍｍｏｌ / Ｌ ＫＨ２ ＰＯ４ ( ｐＨ
６.５)缓冲液对 Ｈｐａ１Ｘｏｏ和 ｐＥＴ 粗蛋白进行适量稀
释ꎬ保证有足够的 ＣＤ 响应信号ꎬ使二者的总蛋白
０７４
５期 纪兆林ꎬ等:水稻白叶枯病菌 Ｈｐａ１Ｘｏｏ蛋白的结构分析
吸光值相近ꎮ 纯化的 Ｈｐａ１Ｘｏｏ蛋白各组分冻干粉用
适量的灭菌超纯水溶解ꎬ使之有足够的 ＣＤ信号ꎮ
(２)圆二色分析 用 Ｊａｓｃｏ￣８１０ 型 ＣＤ 光谱仪
(日本 Ｊａｓｃｏ公司ꎬ扬州大学测试中心提供)进行试
样分析ꎮ 样品池为圆形石英样品池ꎬ光程为
０.１ ｃｍꎬ扫描波长范围为(１９０ ~ ２６０) ｎｍꎬ间隔为
０.１ ｎｍꎬ扫描速率为 １００ ｎｍ / ｍｉｎꎬ每点响应时间
０.２５ ｓꎬ带宽 １.０ ｎｍꎬ测定温度为 ２０℃ꎮ ＣＤ光谱用
椭圆度(ｍｄｅｇ)表示ꎬ所有 ＣＤ 数据经 ３ 次扫描取
平均值ꎬ并扣除背景对照的信号ꎮ 得出 ＣＤ 谱后ꎬ
用仪器自带的软件 Ｊａｓｃｏ’ｓ Ｓｐｅｃｔｒａ ＭａｎａｇｅｒＴＭ拟合
计算蛋白的二级结构含量ꎮ
１.２.４ 分析型超速离心( ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａ￣
ｔｉｏｎꎬ ＡＵＣ)
(１)样品准备 上述制取的蛋白冻干粉用适
量的灭菌超纯水溶解ꎬ使得上机分析的样品 ＯＤ２８０
值达到 １.０ꎬ每样品准备 ６００ μＬꎮ
(２)沉降速率( ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｖｅｌｏｃｉｔｙꎬ ＳＶ)试
验 利用 Ｐｒｏｔｅｏｍｅ ＬａｂＴＭ ＸＬ￣Ｉ型分析型超速离心
机(美国 Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ有限公司ꎬ上海惠生生物
工程公司提供)进行蛋白的 ＳＶ 测试ꎬ分析测试蛋
白的分子量结构ꎮ 使用 Ａｎ￣６０ Ｔｉ 分析型转子ꎬ样
品池是双通道铝制样品池ꎬ内含石英窗ꎮ 分析转速
为 ６０ ０００ ｒ / ｍｉｎꎬ温度为 ２０℃ꎮ 样品过夜离心时进
行 ８００次无间隔扫描ꎮ 获得的沉降数据采用 ｄｃ / ｄｔ
(ｇ(ｓ∗))方法使用 ＤＣＤＴ＋程序(ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｊｐｈｉ￣
ｌｏ.ｍａｉｌｗａｙ.ｃｏｍ / ｄｃｄｔ＋.ｈｔｍ)进行分析ꎮ
１.２.５ ＨＲ 活性测定 将表达获得的 Ｈｐａ１Ｘｏｏ及
ｐＥＴ粗蛋白上清液ꎬ纯化的洗脱峰组分进行 ＨＲ 活
性测定ꎮ 用解剖针在完全展开三生烟叶片下表皮
轻轻刺一下ꎬ用 １ ｍＬ 的注射针筒吸取样品溶液ꎬ
通过轻刺部位注射进入叶片ꎬ每次注射 １００ μＬ 样
品ꎮ 重复 ３张叶片ꎮ 设置样品的阴性对照ꎮ 被注
射的烟草置于温室(２５ ℃ꎬ ８０％ ＲＨꎬ１３ ｈ / ｄ光照)
中ꎬ２４ ｈ后观察注射区是否产生过敏性坏死ꎬ并拍
照记录ꎮ
１.２.６ Ｈｐａ１Ｘｏｏ蛋白的结构预测
(１)二级结构预测 采用在线程序 Ｐｈｙｒｅ(ｖｅｒ￣
ｓｉｏｎ ０.２) ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｓｂｇ. ｂｉｏ. ｉｃ. ａｃ. ｕｋ / ｐｈｙｒｅ / ｈｔ￣
ｍｌ / ｉｎｄｅｘ. ｈｔｍｌ)和 ＨＮＮ(ｈｔｔｐ: / / ｎｐｓａ－ｐｂｉｌ. ｉｂｃｐ.ｆｒ /
ｃｇｉ￣ｂｉｎ / ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ.ｐｌ? ｐａｇｅ ＝ ｎｐｓａ＿ｎｎ.ｈｔｍｌ)对
Ｈｐａ１Ｘｏｏ蛋白进行二级结构的预测ꎮ
(２)寡聚体预测 用 ＳＣＯＲＥＲ ２. ０ ( ｈｔｔｐ: / /
ｃｏｉｌｅｄｃｏｉｌｓ. ｃｈｍ. ｂｒｉｓ. ａｃ. ｕｋ / Ｓｃｏｒｅｒ ) 程 式 预 测
Ｈｐａ１Ｘｏｏ蛋白的寡聚体状态ꎮ
２ 结果与分析
２.１ Ｈｐａ１Ｘｏｏ粗蛋白的 ＨＲ活性及结构
Ｈｐａ１Ｘｏｏ粗蛋白(浓度 １０ μｇ / ｍＬ)注射烟草在
２４ ｈ 内即可产生 ＨＲ 斑ꎬ而对照空载体粗蛋白
(ｐＥＴ)不能诱导烟草产生 ＨＲ(图 １￣Ａ)ꎮ 表明已成
功表达了 ｈａｒｐｉｎ蛋白(Ｈｐａ１Ｘｏｏ)ꎬ并具有 ＨＲ活性ꎮ
Ｆｉｇ. １ ＨＲ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｈｐａ１Ｘｏｏ ｃｒｕｄｅ ｓｕｐｅｒｎａ￣
ｔａｎｔ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｏｂａｃ￣
ｃｏ ｌｅａｖｅｓ
Ａ: Ｈｐａ１Ｘｏｏ ａｎｄ ｐＥＴ ｃｒｕｄｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓꎻ Ｂ: Ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ
Ａ ａｎｄ Ｂ ｏｆ Ｈｐａ１Ｘｏｏ ｃｒｕｄｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ.
通过 ＣＤ光谱测定ꎬ与空载体粗蛋白(ｐＥＴ)相
比ꎬＨｐａ１Ｘｏｏ粗蛋白具有较明显的 α￣螺旋特征ꎬ在
２０８ ｎｍ 和 ２２２ ｎｍ 处有较明显的双负峰(图 ２)ꎮ
而空载体粗蛋白只在 ２０８ ｎｍ 处有一微弱的负峰ꎮ
通过 Ｊａｓｃｏ’ｓ Ｓｐｅｃｔｒａ ＭａｎａｇｅｒＴＭ软件拟合计算出了
它们的二级结构含量ꎮ 空载体粗蛋白中 α￣螺旋、
β￣折叠、转角和无规卷曲的含量分别为 １１. ２％、
４３.９％、０.０％和 ４４.９％ꎻ而 Ｈｐａ１Ｘｏｏ粗蛋白中上述二
级结构的含量分别为１９ .８％ 、４３ .０％ 、１０ . ７％和
１７４
植物病理学报 ４４卷
Ｆｉｇ. ２ ＣＤ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ Ｈｐａ１Ｘｏｏ ａｎｄ ｐＥＴ￣３０ａ(＋) ｃｒｕｄｅ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ ｆｒｏｍ １９０ ｔｏ ２６０ ｎｍ
Ｓｐｅｃｔｒａ ｗｅｒｅ ｒｅｃｏｒｄｅｄ ｏｎ ａ Ｊａｓｃｏ￣８１０ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ａｔ ２０℃. Ｔｈｅ ｆａｒ￣ＵＶ ＣＤ ｓｐｅｃｔｒａ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｍｅａｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｓ
ｗｉｔｈ ａ ０.１ ｃｍ ｌｉｇｈｔ￣ｐａｔｈ ｃｅｌｌ. Ｇｒａｙ ｔｒｉａｎｇｌｅｓꎬ ｐＥＴ￣３０ａ(＋) ｃｒｕｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎꎻ ｂｌａｃｋ ｃｉｒｃｌｅｓꎬ Ｈｐａ１Ｘｏｏ ｃｒｕｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ.
２６.５％ꎮ 可以看出 Ｈｐａ１Ｘｏｏ粗蛋白中 α￣螺旋的含量
明显高于空载体粗蛋白ꎬ空载体粗蛋白中没有转角
结构ꎻ而二者的 β￣折叠含量相当且比较高都达到
了 ４３％ꎻ二者的无规卷曲含量都比较大ꎮ 结果表
明 Ｈｐａ１Ｘｏｏ具有 α￣螺旋二级结构及少量的转角结
构ꎮ
２.２ 表达蛋白的分离纯化及纯化组分的 ＨＲ活性
通过 Ｓｕｐｅｒｏｓｅ￣１２ １０ / ３００ ＧＬ 凝胶柱进行层
析ꎬ分离纯化 Ｈｐａ１Ｘｏｏ粗蛋白上清液ꎮ 由图 ３ 可见
Ｈｐａ１Ｘｏｏ粗蛋白有 ２ 个洗脱峰ꎬ即第一洗脱峰和第
二洗脱峰ꎬ分别以 Ａ 和 Ｂ 表示ꎮ Ｂ 峰的峰面积远
大于 Ａ 峰ꎬ即便扣除 Ｂ 峰的拖尾部分ꎮ 这说明
Ｈｐａ１Ｘｏｏ粗蛋白水溶液中存在 ２ 种不同分子大小的
组分 Ａ和 Ｂꎬ且 Ｂ的含量要大于 Ａꎬ它们对应的洗
脱体积(保留体积)分别为 ８.１７ ｍＬ 和 １５.１１ ｍＬꎮ
收集峰 Ａ和峰 Ｂ 的洗脱液ꎬ得到峰 Ａ 的洗脱液 ３
管ꎬ分别标为 Ａ１、Ａ２和 Ａ３ꎻ峰 Ｂ洗脱液 ４管ꎬ分别
标记为 Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３和 Ｂ４ꎻ另外峰 Ｂ 的拖尾峰处也
收集了 ２管洗脱液ꎬ分别以 Ｃ１ 和 Ｃ２ 标示(图 ３)ꎮ
将上述收集的各管洗脱液注射接种烟草叶片ꎬ２４ ｈ
后观察ꎬ发现 Ａ 组分和 Ｂ 组分各管洗脱液都能诱
导烟草产生 ＨＲ 坏死斑ꎬ而 Ｃ１ 和 Ｃ２ 不能诱导烟
草产生 ＨＲ(图 １￣Ｂ)ꎮ 结果表明 Ｈｐａ１Ｘｏｏ的 ２ 种存
在形式ꎬ组分 Ａ和 Ｂꎬ都具有激发烟草产生 ＨＲ 的
能力ꎮ
２.３ Ｈｐａ１Ｘｏｏ蛋白的聚体形式
根据 Ｂ峰的洗脱体积 １５.１１ ｍＬ(图 ３)ꎬ通过
Ｃａｌｂｒａｔｉｏｎ软件程序计算出 Ｂ 组分的分子量为 １４
ｋＤａꎬ与理论分子量 １３.７３ ｋＤａ相近ꎬ表明层析分离
出的 Ｂ组分是 Ｈｐａ１Ｘｏｏ蛋白的单体形式ꎮ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ￣
１２ １０ / ３００ ＧＬ凝胶柱的柱床体积(Ｖｔ)为 ２４ ｍＬꎬ
外水(间隙)体积(Ｖ０)是 ８ ｍＬꎬ分离的分子量极限
是 ３００ ｋＤａꎮ Ａ 组分峰就是 Ｖ０的峰ꎬ这是因为 Ａ
组分的洗脱体积 ８.１７ ｍＬ几乎等于 Ｖ０(图 ３)ꎬ多出
来的 ０.１７ ｍＬ 可能是误差造成的ꎮ Ａ 组分的分子
量大小超过了该凝胶柱的分离范围ꎬ即 Ａ 的分子
量> ３００ ｋＤａꎮ 这些结果表明ꎬ在水溶液中 Ａ 组分
是以多聚体形式存在的ꎮ 另外峰 Ａ 的面积明显小
于峰 Ｂꎬ说明 Ｈｐａ１Ｘｏｏ粗蛋白水溶液中多聚体的含
量远少于单体的含量ꎮ
在沉降速率试验中ꎬ蛋白质区带的形状与溶液
中蛋白的均质性和扩散特性有关ꎬ而通过区带边界
的运动速度能得到沉降系数( ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉ￣
ｃｉｅｎｔꎬ Ｓ)ꎮ 通过沉降速率试验数据的拟合ꎬ图 ４ 显
示了 Ｈｐａ１Ｘｏｏ粗蛋白洗脱组分 Ａ 和 Ｂ 沉降系数
(ｇ(ｓ∗))的分布ꎮ 结果表明组分 Ａ 和 Ｂ 的最佳沉
降系数分别是 ９.７３０ Ｓ和 ２.１８２ Ｓꎮ 然而ꎬＢ组分的
峰型是异常的ꎬ与 Ａ组分的正态峰型不同ꎬ它偏向
２７４
５期 纪兆林ꎬ等:水稻白叶枯病菌 Ｈｐａ１Ｘｏｏ蛋白的结构分析
Ｓ高值ꎮ 通过 ＤＣＤＴ＋程序以及数学公式计算ꎬ拟
合出组分 Ａ 和 Ｂ 的分子量分别是 ２４ ４４０ Ｄａ 和
７ ８３０ Ｄａꎮ 因为 Ａ的分子量接近 Ｈｐａ１Ｘｏｏ蛋白理论
分子量(１３.７３ ｋＤａ)的 ２倍ꎬ即包含 ２ 个 Ｈｐａ１Ｘｏｏ单
体ꎬ而 Ｂ拟合的分子量要小于 Ｈｐａ１Ｘｏｏ理论单体的
分子量ꎮ 考虑到溶液的密度、粘度、离子强度等都会
对拟合结果产生影响ꎬ并结合试验结果ꎬ得出 Ａ和 Ｂ
组分分别是 Ｈｐａ１Ｘｏｏ蛋白的二聚体和单体形式ꎮ
Ｆｉｇ. ３ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｐａ１Ｘｏｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ. ｃｏｌｉ
ＳＥＣ ｅｌｕｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｈｐａ１Ｘｏｏ ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ￣１２ １０ / ３００ ＧＬ ｇｅｌ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｃｏｌｕｍｎ. Ｔｈｅ ｍａｓｓｅｓ ｏｆ Ｈｐａ１Ｘｏｏ ｗｅｒｅ
ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ａ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｇｒａｍ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｆｒｏｍ Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ. Ｔｈｅ ｃｏｌｕｍｎ ｗａｓ ｅｌｕｔｅｄ ｗｉｔｈ ２０ ｍｍｏｌ / Ｌ
Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ (ｐＨ ８.０) / １００ ｍｍｏｌ / Ｌ ＫＣｌ. Ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ｗａｓ ｍａｉｎｔａｉｎｅｄ ａｔ ０.８ ｍＬ / ｍｉｎ. Ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅ ｖｏｌｕｍｅ ｉｓ ａｂｏｕｔ ０.５ ｍＬ.
Ｆｉｇ. ４ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｈｐａ１Ｘｏｏｅｌｕｔｉｏｎ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ Ａ ａｎｄ Ｂ ｂｙ ＡＵＣ
Ａ ａｎｄ Ｂꎬ ＡＵＣ ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ａｎｄ ｆｉｔｔｅｄ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｏｆ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ Ａ ａｎｄ Ｂ. ＡＵＣ ｄａｔａ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ
ｄｃ / ｄｔ [ｇ(ｓ∗)] ｍｅｔｈｏｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｏｇｒａｍ ＤＣＤＴ＋. Ｓ: Ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ (Ｓｖｅｄｂｅｒｇꎬ １Ｓ ＝ １×１０－１３ ｓ)ꎻ
Ｍ: Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔ (ｋＤａ)ꎻ Ｃｏ: Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ (ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ｖａｌｕｅ ａｔ ２８０ ｎｍ).
３７４
植物病理学报 ４４卷
２.４ Ｈｐａ１Ｘｏｏ蛋白的 ＣＤ光谱
在 ２０ ｍｍｏｌ / Ｌ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ (ｐＨ ８.０) / １００ ｍｍｏｌ /
Ｌ ＫＣｌ缓冲液中ꎬＡ组分的 ＣＤ谱在 ２０８ ｎｍ和 ２２２
ｎｍ处有 ２个负峰(图 ５)ꎬ这是 α￣螺旋二级结构的
典型特征ꎮ 然而组分 Ｂ 只在 ２０８ ｎｍ 处有 １ 个负
峰ꎬ另外在 ２６５ ｎｍ 处出现了一个正峰(图 ５)ꎮ 通
过 Ｊａｓｃｏ’ｓ Ｓｐｅｃｔｒａ ＭａｎａｇｅｒＴＭ软件的定量分析ꎬ拟
合计算出了它们的二级结构含量ꎮ Ｈｐａ１Ｘｏｏ￣Ａ 水
溶液中 α￣螺旋、β￣折叠、转角和无规卷曲的含量分
别为 ２７.０％、０.０％、２６.３％和 ４６.８％ꎻ而在 Ｈｐａ１Ｘｏｏ￣Ｂ
水溶液中含量分别为 １７. ８％、 １６. ６％、 ２３. ０％和
４２.６％ꎮ 可以看出组分 Ａ 中的螺旋含量明显高于
组分 Ｂꎬ且组分 Ａ 中不含有 β￣折叠ꎮ 在转角和无
规卷曲的含量上ꎬ组分 Ａ与 Ｂ是相当的ꎮ
２.５ Ｈｐａ１Ｘｏｏ蛋白结构的预测
图 ６显示了 Ｐｈｙｒｅ(ｖｅｒｓｉｏｎ ０.２)程式对 Ｈｐａ１Ｘｏｏ
Ｆｉｇ. ５ ＣＤ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ Ｈｐａ１Ｘｏｏ ｃｒｕｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｒａｃｔｉｏｎｓ Ａ ａｎｄ Ｂ ｆｒｏｍ ２００ ｔｏ ３００ ｎｍ
Ｓｐｅｃｔｒａ ｗｅｒｅ ｒｅｃｏｒｄｅｄ ｏｎ ａ Ｊａｓｃｏ￣８１０ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ ａｔ ２０℃. Ｔｈｅ ｆａｒ￣ＵＶ ＣＤ ｓｐｅｃｔｒａ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｍｅａｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｓ
ｗｉｔｈ ａ ０.１ ｃｍ ｌｉｇｈｔ￣ｐａｔｈ ｃｅｌｌ. Ｂｌａｃｋ ｃｉｒｃｌｅｓꎬ Ｈｐａ１Ｘｏｏ ｃｒｕｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｒａｃｔｉｏｎ Ａ (Ｈｐａ１Ｘｏｏ ￣Ａ)ꎻ
ｇｒａｙ ｔｒｉａｎｇｌｅｓꎬ Ｈｐａ１Ｘｏｏ ｃｒｕｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｌｕｔｉｏｎ ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｂ (Ｈｐａ１Ｘｏｏ ￣Ｂ) .
Ｆｉｇ. ６ Ｔｈｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｐａ１Ｘｏｏ ｂｙ Ｐｈｙｒｅ ｐｒｏｇｒａｍ
Ｉｎ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎꎬ ｃ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｒａｎｄｏｍ ｃｏｉｌꎻ ｈ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ α￣ｈｅｌｉｘꎻ ｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｅｘｔｅｎｄ ｓｔｒａｎｄ.
Ｉｎ ｄｉｓｏｒｄｅｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎꎬ ｄ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅꎻ ｏ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｏｒｄｅｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ. Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈｅ
ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ.
４７４
５期 纪兆林ꎬ等:水稻白叶枯病菌 Ｈｐａ１Ｘｏｏ蛋白的结构分析
Ｆｉｇ. ７ Ｔｈｅ ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｃ ｓｔａｔｅ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｐａ１Ｘｏｏ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｙ ＳＣＯＲＥＲ ２.０ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ
Ｕｓｅｒ Ｉｎｐｕｔ: >Ｈｐａ１Ｘｏｏ ￣ｓｅｑｕｅｎｃｅꎻ ＭＡＲＣＯＩＬ ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｒｅｇｉｏｎ: １ꎻ ＭＡＲＣＯＩＬ ｏｕｔｐｕｔ ａｔ １％ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ.
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ: ＥＫＱＬＤＱＬＬＣＱＬＩＳＡＬＬＱＳＳＫＮＡＥＥꎻ Ｒｅｇｉｓｔｅｒ: ｅｆｇａｂｃｄｅｆｇａｂｃｄｅｆｇａｂｃｄｅｆｇꎻ Ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ:
Ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ａｓ ＤＩＭＥＲꎬ Ｓｃｏｒｅ ｉｓ ３.９５６６４５.
蛋白二级结构的预测结果ꎮ 几个算法分析表明ꎬ
Ｈｐａ１Ｘｏｏ存在 ２个 α￣螺旋区域ꎬ即含有 １８ 个氨基酸
残基的 Ｎ￣端 α￣螺旋区域 ( ＳＥＫＱＬＤＱＬＬＣＱＬＩＳ￣
ＡＬＬＱ)和含有 １６个氨基酸残基的 Ｃ 端 α￣螺旋区
域(ＰＦＴＱＭＬＭＨＩＶＧＥＩＬＱＡ)ꎮ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ 预测发现
Ｈｐａ１Ｘｏｏ存在 ５个固有无序结构区域ꎬ分别是 Ｎ 端
的 ２个ꎬ中间部分的 １ 个以及 Ｃ 端的 ２ 个ꎮ 其中ꎬ
中间部分的无序结构区域较大ꎬ含有 ３５ 个氨基酸
残基ꎮ ＨＮＮ 方法对 Ｈｐａ１Ｘｏｏ的预测结果与 Ｐｈｙｒｅ
的预测结果相似ꎮ 预测的各二级结构含量如下:
α￣螺旋ꎬ ２５. ９０％ꎻ 无规卷曲ꎬ ７３. ３８％ꎻ β￣折叠ꎬ
０.７２％ꎮ
用 ＳＣＯＲＥＲ ２.０在线程序对 Ｈｐａ１Ｘｏｏ蛋白的寡
聚体形式进行了预测分析ꎬＨｐａ１Ｘｏｏ蛋白可通过 Ｎ
端的 α￣螺旋区域形成 ２￣链卷曲螺旋( ｃｏｉｌｅｄ￣ｃｏｉｌꎬ
ＣＣ)结构ꎬ即能形成二聚体(图 ７)ꎮ 预测结果与本
研究测试分析结果一致ꎬ即在水溶液中 Ｈｐａ１Ｘｏｏ蛋
白除了以单体形式存在外ꎬ还能以二聚体方式存
在ꎮ
３ 讨论
试验中发现 ＳＥＣ 和 ＡＵＣ 分析测得的蛋白分
子量存在差异ꎬ这可能是由于实验过程中的浓度、
粘度、实验条件和误差ꎬ以及自身的降解造成的ꎮ
比如 ＳＥＣ 分析时ꎬ上柱子的是表达的粗蛋白的上
清液ꎬ被稀释了ꎻ而 ＡＵＣ 分析的样品ꎬ是收集到的
组分浓缩冻干以后再行溶解的ꎬ浓度较高ꎬ这些都
可能会影响实验结果ꎮ 特别是 Ｈｐａ１Ｘｏｏ粗蛋白洗脱
组分 ＡꎬＳＥＣ 分析其分子量 >３００ ｋＤａꎬ是 Ｈｐａ１Ｘｏｏ
的多聚体形式ꎻ而 ＡＵＣ分析显示 Ａ组分的分子量
为 ２４.４４ ｋＤａꎬ是 Ｈｐａ１Ｘｏｏ的二聚体ꎮ 二者存在显著
差异ꎮ 推测其中的可能原因是蛋白的形状ꎮ ＳＥＣ
对于分子大小的计算是基于蛋白的“球形”标准结
构[ １８ ]ꎮ 然而ꎬＨｐａ１Ｘｏｏ粗蛋白洗脱组分 Ａ形成的结
构可能不是球形的ꎬ因此早早地就从 Ｓｕｐｅｒｏｓｅ￣１２
凝胶柱中洗脱出来ꎮ 综合分析ꎬ认为 ＳＥＣ 与 ＡＵＣ
的实验结果基本是一致的ꎬ即 Ｈｐａ１Ｘｏｏ粗蛋白洗脱
组分 Ａ和 Ｂ分别是 Ｈｐａ１Ｘｏｏ的二聚体和单体形式ꎮ
在用 ＣＤ光谱仪对 Ｈｐａ１Ｘｏｏ粗蛋白洗脱组分 Ａ
和 Ｂ进行分析时ꎬ(２００~３００) ｎｍ扫描波长涵盖了
部分远紫外光和近紫外光区域ꎮ 一般小于 ２５０ ｎｍ
的波长远紫外扫描能分析出蛋白的二级结构ꎬ而近
紫外扫描(２５０~３００ ｎｍ)能测出一些芳香族氨基酸
残基的特征ꎮ 本试验发现 Ｈｐａ１Ｘｏｏ粗蛋白洗脱 Ａ
组分的 ＣＤ谱具有典型 α￣螺旋的 ２０８ ｎｍ和２２２ ｎｍ
处的双负峰ꎬ而 Ｂ 组分却只有 ２０８ ｎｍ 处的负峰ꎬ
２２２ ｎｍ处的非常微弱ꎮ 所拟合得出的 α￣螺旋含量
也是 Ａ 组分(二聚体)明显高于 Ｂ 组分(单体)ꎮ
另外ꎬ与 Ａ组分相比ꎬＢ 组分在 ２６５ ｎｍ 处出现了
一个明显的正峰ꎬ这是由 Ｈｐａ１Ｘｏｏ中存在的 ６ 个苯
５７４
植物病理学报 ４４卷
丙氨酸(Ｐｈｅ)贡献的ꎮ Ｂ 组分是单体结构ꎬ苯丙氨
酸暴露在外ꎬ自然就会有吸收值ꎻ而 Ａ 组分是二聚
体ꎬ可能苯丙氨酸的发色团部分被掩盖ꎬ在 ２６５ ｎｍ
处也就没有吸收的正峰ꎮ 反过来ꎬＡ 组分和 Ｂ 组
分在 ２６５ ｎｍ处的苯丙氨酸正峰现象也正好可以解
释 Ａ组分和 Ｂ组分的聚体形式ꎮ
目前对 ｈａｒｐｉｎ蛋白的研究侧重于功能、作用位
点和靶标、与植物互作激发的抗病或促进植物生长
的机制以及应用研究等方面[１９]ꎬ而对于其结构的
研究报道较少ꎮ Ｔａｒａｆｄａｒ 等对丁香假单胞菌
(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｓｙｒｉｎｇａ)ｈａｒｐｉｎＰｓｓ蛋白进
行了热力学去折叠研究ꎬ发现该蛋白存在 ３个明显
的变化过程:寡聚体→二聚体→部分去折叠的二聚
体→去折叠的单体ꎮ 在第二阶段之前 α￣螺旋是主
要的二级结构ꎬ含量比较高ꎻ而之后 α￣螺旋含量降
低ꎬβ￣折叠含量增加[２０]ꎮ 这一点与本研究相似ꎬ
Ｈｐａ１Ｘｏｏ能形成二聚体ꎬ二聚体的 α￣螺旋含量高于
单体的 α￣螺旋含量ꎮ Ｏｈ等用电镜和 ＣＤ光谱等方
法测 定 了 ＨｐａＧ 蛋 白 ( 来 自 Ｘ. ａｘｏｎｏｐｏｄｉｓ
ｐｖ. ｇｌｙｃｉｎｅｓ)在植物类质外体条件下的生物化学特
征ꎬ结果表明 Ｈｉｓ６￣ＨｐａＧ 能形成具有生物活性
(ＨＲ)的球形寡聚体ꎬ是原纤维、富含 β￣折叠的纤
丝[２１]ꎮ 进一步生物化学分析发现该蛋白由 α￣螺旋
向富含 β￣折叠的纤丝转变对激发烟草 ＨＲ 活性是
非常重要的ꎮ Ｈｉｓ６￣ＨｐａＧ 的纤丝是淀粉状蛋白ꎮ
同时也发现来自 Ｅｒｗｉｎｉａ ａｍｙｌｏｖｏｒａ 的 ＨｒｐＮ 和来
自 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ ｐｖ. ｓｙｒｉｎｇａｅ的 ＨｒｐＺ在植
物类质外体的条件下也都能形成曲线原纤维或者
纤丝ꎬ表明淀粉状蛋白的形成是这些 ｈａｒｐｉｎ的共有
特征[２１]ꎮ 本研究的实验条件是离体水溶液环境ꎬ
发现 Ｈｐａ１Ｘｏｏ的单体形式就具有 ＨＲ 活性ꎬ并没有
发现 Ｈｐａ１Ｘｏｏ的淀粉状蛋白集结体形式ꎮ 是否与上
述几个 ｈａｒｐｉｎ蛋白(ＨｐａＧ、ＨｒｐＮ和 ＨｒｐＺ)一样ꎬ在
植物类质外体条件下形成纤丝ꎬ还需进一步实验研
究ꎮ
本文也对 Ｈｐａ１Ｘｏｏ蛋白的结构进行了预测ꎬ发
现 Ｈｐａ１Ｘｏｏ存在 ２个 α￣螺旋区域ꎬ分别在 Ｈｐａ１ＸｏｏＮ
端和 Ｃ 端ꎬα￣螺旋含量为 ２５.９％ꎬβ￣折叠的含量几
乎为零ꎬ仅为 ０. ７２％ꎬ而无规卷曲的含量达到
７３.３８％ꎮ 这一预测结果与 Ｈｐａ１Ｘｏｏ二聚体 ＣＤ谱分
析拟合得到的二级结构含量基本一致ꎬα￣螺旋为
２７.０％ꎬβ￣折叠为 ０.０％ꎬ无规卷曲为 ４６.８％ꎻ不同的
是 ＣＤ分析出 Ｈｐａ１Ｘｏｏ二聚体含有一定量的转角
(２６.３％)ꎬ而 Ｐｈｙｒｅ 和 ＨＮＮ 程式没有预测到转角
结构ꎮ ＳＣＯＲＥＲ ２.０ 寡聚体预测结果与测试分析
结果相一致ꎬ即在水溶液中 Ｈｐａ１Ｘｏｏ蛋白除了以单
体形式存在外ꎬ还能以二聚体方式存在ꎮ 固有的无
序蛋白(通常指固有的无结构蛋白)也就是那些缺
少稳定性以及缺少定义完整的三级结构ꎬ仍保留生
物功能的蛋白ꎮ 固有的无序结构区域通常是有功
能活性的ꎮ 许多固有的无序片段折叠并结合在它
们的生物靶目标上ꎬ而有些则组成灵活的连接体ꎬ
在大分子阵列的积聚组装中具有重要作用[２２ꎬ２３]ꎮ
我们通过 Ｐｈｙｒｅ程式预测发现 Ｈｐａ１Ｘｏｏ中存在着丰
富的固有无序区域ꎬ２ 个在 Ｎ 端ꎬ２ 个在 Ｃ 端ꎬ１ 个
在中部ꎮ 这些预测的固有无序区域都不在 α￣螺旋
区域上ꎮ 推测 α￣螺旋区域和固有无序结构区域可
能共同作用ꎬ赋予 Ｈｐａ１Ｘｏｏ蛋白完整的生物功能ꎮ
参考文献
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６７４
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ｔｅｍｉｃ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｐａｔｈｗａｙ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｓａｉｌｃｙｌｉｃ
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[１３] Ｐｅｎｇ Ｊ Ｌꎬ Ｄｏｎｇ Ｈ Ｓꎬ Ｄｏｎｇ Ｈ Ｐꎬ ｅｔ ａｌ. Ｈａｒｐｉｎ￣ｅｌｉｃｉｔｅｄ
ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ
ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｔｈｅ ＮＤＲ１ ａｎｄ ＥＤＳ１ ｇｅｎｅｓ [ Ｊ] . Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ
ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２００３ꎬ ６２:３１７－３２６.
[１４] Ｓｈａｏ Ｍꎬ Ｌｉ Ｌꎬ Ｍｕ Ｄ Ｓꎬ ｅｔ ａｌ. ＨａｒｐｉｎＸｏｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ
ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｒｉｃｅ ｐｌａｎｔｓ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｂａｃｔｅｒｉａｌ
ｌｅａｆ ｂｌｉｇｈｔ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ) [ Ｊ ] . Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｏｎｔｒｏｌ(中国生物防治)ꎬ ２００６ꎬ ２２(２):
１３３－１３６.
[１５] Ｍｅｎｇ Ｆ Ｈꎬ Ｓｏｎｇ Ｃ Ｆꎬ Ｊｉ Ｚ Ｌꎬ ｅｔ ａｌ. Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｒａｎｓ￣
ｇｅｎｉｃ ｔｏｂａｃｃｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ＨａｒｐｉｎＸｏｏ ａｎｄ ｉｔｓ Ｎ￣ｔｅｒｍｉｎａｌ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｎ ＴＭＶ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ｊｏｕｒ￣
ｎａｌ ｏｆ Ｎａｎｊｉｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ (南京农业大学
学报)ꎬ ２００７ꎬ ３０(３):４７－５２.
[１６] Ｚｈａｎｇ Ｌꎬ Ｘｉａｏ Ｓꎬ Ｌｉ Ｗꎬ ｅｔ ａｌ. Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ
Ｈａｒｐｉｎ￣ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅ ｈｒｆ１ ｉｎ ｒｉｃｅ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｄｒｏｕｇｈｔ ｔｏｌ￣
ｅｒａｎｃｅ[Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙꎬ ２０１１ꎬ ６２
(１２): ４２２９－４２３８.
[１７] Ｍｉａｏ Ｗꎬ Ｗａｎｇ Ｊ. Ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｔｔｏｎ
ｗｉｔｈ ａ Ｈａｒｐｉｎ￣ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅ ｈｐａＸｏｏ ｃｏｎｆｅｒｓ ａｎ
ｅｎｈａｎｃｅｄ ｄｅｆｅｎｓｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｇａｉｎｓｔ Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉａｅ
Ｋｌｅｂ[Ｊ] . Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２０１３ꎬ ９５８:
２２３－２４６.
[１８] Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ. Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ: Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ
Ｍｅｔｈｏｄｓ [ Ｍ ] . ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ￣Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ＡＢꎬ
Ｂｊöｒｋｇａｔａｎ ３０ꎬ ７５１ ８４ Ｕｐｐｓａｌａꎬ Ｓｗｅｄｅｎꎬ ２００２.
[１９] Ｃｈｏｉ Ｍ Ｓꎬ Ｋｉｍ Ｗꎬ Ｌｅｅ Ｃꎬ ｅｔ ａｌ. Ｈａｒｐｉｎｓꎬ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃ￣
ｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｂｙ Ｇｒａｍ￣ｎｅｇａｔｉｖｅ ｐｌａｎｔ￣ｐａｔｈｏ￣
ｇｅｎｉｃ ｂａｃｔｅｒｉａ [ Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ￣Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃ￣
ｔｉｏｎｓꎬ ２０１３ꎬ ２６(１０):１１１５－１１２２.
[２０] Ｔａｒａｆｄａｒ Ｒ Ｋꎬ Ｖｅｄａｎｔａｍ Ｌ Ｖꎬ Ｋｏｎｄｒｅｄｄｙ Ａꎬ ｅｔ ａｌ.
Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｔｈｅｒｍａｌ ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ ｏｆ ｈａｒｐｉｎＰｓｓ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
ｌｅｕｃｉｎｅ￣ｚｉｐｐｅｒ￣ｌｉｋｅ ｍｏｔｉｆｓ ｉｎ ｈａｒｐｉｎｓ[Ｊ] . Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ
Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａꎬ ２００９ꎬ １７９４:１６８４－１６９２.
[２１] Ｏｈ Ｊꎬ Ｋｉｍ Ｊ Ｇꎬ Ｊｅｏｎ Ｅꎬ ｅｔ ａｌ. Ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ
ｔｙｐｅ ＩＩＩ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｈａｒｐｉｎｓ ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ
ｂａｃｔｅｒｉａ [ Ｊ ] . Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ
２００７ꎬ ２８２:１３６０１－１３６０９.
[２２] Ｄｕｎｋｅｒ Ａ Ｋꎬ Ｌａｗｓｏｎ Ｊ Ｄꎬ Ｂｒｏｗｎ Ｃ Ｊꎬ ｅｔ ａｌ. Ｉｎｔｒｉｎｓｉ￣
ｃａｌｌｙ ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ [ Ｊ ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｇｒａｐｈｉｃｓ ＆Ｍｏｄｅｌｌｉｎｇꎬ ２００１ꎬ １９:２６－５９.
[２３] Ｄｙｓｏｎ Ｈ Ｊꎬ Ｗｒｉｇｈｔ Ｐ Ｅ. Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌｌｙ ｕｎｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ [ Ｊ ] . Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００５ꎬ ６:１９７－２０８.
责任编辑:于金枝
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